李 瑩

(伊春區(qū)畜牧獸醫(yī)站,黑龍江伊春 153000)

兔巴氏桿菌病的血清學(xué)診斷及預(yù)防措施

李 瑩

(伊春區(qū)畜牧獸醫(yī)站,黑龍江伊春 153000)

兔巴氏桿菌病是由多殺性巴氏桿菌引起的多癥狀的疾病,如鼻炎、中耳炎、結(jié)膜炎、肺炎、皮下膿腫、敗血癥,以及子宮膿腫和睪丸炎等。確診需進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室診斷。本文介紹兔巴氏桿菌病的血清學(xué)診斷法。

兔;預(yù)防;巴氏桿菌病

1 流行病學(xué)

兔巴氏桿菌病按血清型分為7：A、5：A，家兔中較易感染發(fā)病。本病無季節(jié)性，但以春秋冷熱交替、氣溫驟變，或悶熱、潮濕的雨季發(fā)生較多。當(dāng)飼養(yǎng)管理不佳、營(yíng)養(yǎng)不全、飼料突變、過度疲勞、長(zhǎng)途運(yùn)輸、寄生蟲感染以及寒冷、悶熱、潮濕、擁擠、圈舍通風(fēng)不良、陰雨綿綿等，使兔子抵抗力降低時(shí)，病菌易乘機(jī)入侵體內(nèi)，發(fā)生內(nèi)源感染。病兔的糞便、分泌物含有毒力的病菌，一旦污染飼料、飲水、用具和外界環(huán)境，通過吸血昆蟲等媒介和皮膚、粘膜的傷口都可以感染發(fā)病。此病是引起9周齡～6月齡兔死亡的一種最主要的傳染病，潛伏期一般數(shù)小時(shí)至5d或更長(zhǎng)。兔巴氏桿菌能引起兔全身多處發(fā)病，為了能更好的進(jìn)行判定，可以采取多種試驗(yàn)方法進(jìn)行診斷。

2 免疫擴(kuò)散試驗(yàn)

（1）莢膜抗原的制備：將Carter A型兔多殺性巴氏桿菌菌種移植于加有0.1%綿羊血色素的馬丁瓊脂扁瓶中，37℃培養(yǎng)16～24h后，用滅菌磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）洗下菌苔，收集于離心管中，置56℃水浴30min，6000～8000r/min離心20min，吸取上清液，定量分裝，-18～-25℃冰箱保存。

（2）莢膜陽(yáng)性血清的制備將莢膜抗原與油佐劑混合乳化后免疫家兔，以后再通過耳靜脈注射莢膜抗原加強(qiáng)免疫3次即成。免疫擴(kuò)散用陽(yáng)性對(duì)照血清系人工感染多殺性巴氏桿菌發(fā)病耐過兔血清，經(jīng)免疫擴(kuò)散血清學(xué)檢驗(yàn)為陽(yáng)性。

（3）免疫擴(kuò)散試驗(yàn)取0.7～1g瓊脂糖放入含有1/10000硫柳汞的100ml0.01mol/LpH8.6 Tris緩沖液（氯化鈉5.84g、三羥甲基氨基甲烷1.21g、乙二胺四乙酸0.29g，加蒸餾水至1000ml）中，熱水浴徹底融化并混勻。將直徑90mm平皿放在水平臺(tái)上，每皿倒入熱融化的瓊脂糖Tris液15ml，厚度約為2～3mm。注意不要產(chǎn)生氣泡，凝固后加蓋，把平皿倒置，防止水分蒸發(fā)。按梅花形在瓊脂板上打孔，中央孔徑為4mm，周圍孔徑為3mm，孔距為4mm。在中央孔加抗原，周圍孔加被檢血清，擴(kuò)散板放濕室，室溫下進(jìn)行反應(yīng)，逐日觀察記錄結(jié)果，3d后判定?？乖着c被檢血清孔之間形成一條致密沉淀線及其末端向毗鄰的被檢血清孔之抗原孔方向偏彎者均判為陽(yáng)性。本抗原有群特異性，采用本法診斷兔巴氏桿菌病與細(xì)菌分離的符合率在95%以上。

3 間接ELISA

應(yīng)用間接ELISA診斷自然感染兔，檢出率可達(dá)96.2%。

（1）抗原制備同上“莢膜抗原的制備”部分。

（2）快診板制備 ①用pH9.6，0.1mol/升碳酸鹽緩沖液將抗原稀釋成最適濃度，加入到聚苯乙烯塑料反應(yīng)板的各孔中，每孔加入0.1ml，加蓋，4℃冰箱過夜。②次日，甩凈各孔內(nèi)包被抗原液，并注入pH7.2，0.01mol/LPBST（含0.05%吐溫-20的PBS）緩沖液，浸泡3～5min后甩干，如此重復(fù)3次。③甩干后，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

（3）操作步驟 ①將被檢血清、陽(yáng)性對(duì)照血清用PBST作1：200稀釋，每孔加入0.1ml，每份樣品加2孔，加蓋，置37℃濕盒1.5h。②甩凈各孔內(nèi)包被抗原液，并注入pH7.2，0.01mol/LPBST（含0.05%吐溫-20的PBS）緩沖液，浸泡3～5min后甩干，重復(fù)3次。③甩干后加入稀釋成工作濃度的酶標(biāo)記抗體，每孔0.1ml，置37℃濕盒1.5h。④同上法沖洗后每孔加入0.1ml新配制的底物溶液（0.2mol/磷酸氫二鈉25.7ml、0.1mol/L檸檬酸24.3ml，加蒸餾水至50ml，即為pH5.0的底物緩沖液或檸檬酸-磷酸鹽緩沖液；取檸檬酸-磷酸鹽緩沖液50ml，溶解20mg鄰苯二胺，臨用前加入30%雙氧水75μl，此液配制完成后必須立即使用），室溫下反應(yīng)15min。⑤每孔加入1mol/L硫酸0.05ml中止反應(yīng)，用492nm波長(zhǎng)測(cè)定每孔的OD值。

（4）結(jié)果判定凡被檢血清的OD值≥0.2者判為陽(yáng)性。

4 凝集試驗(yàn)

（1）診斷抗原將標(biāo)準(zhǔn)的A、B、C、D、E 5型兔多殺性巴氏桿菌菌株移植于加有0.1%綿羊血色素的馬丁瓊脂扁瓶中，37℃培養(yǎng)16～24h后，用滅菌磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）洗下菌苔，收集于離心管中，置56℃水浴30min，6000～8000轉(zhuǎn)/min離心20min，吸取上清液即為莢膜抗原。取2ml莢膜抗原加入50%的綿羊紅細(xì)胞0.2ml，37℃感作30min，其間振搖數(shù)次，離心后去上清液，用生理鹽水洗滌2次后加10ml生理鹽水即成1%致敏紅細(xì)胞，作為診斷抗原。

（2）試管凝集試驗(yàn)將待檢兔血清作成不同的稀釋度，分別加入等量的診斷抗原，搖勻后置于37℃水浴作用1h后觀察。凝集價(jià)在1：40以上者判為陽(yáng)性。

（3）平板凝集試驗(yàn)取被檢血清100μl加于載玻片上，隨后加入等量的診斷抗原，輕輕搖動(dòng)使診斷抗原與被檢血清均勻混合，3min內(nèi)判定結(jié)果。凡3min內(nèi)出現(xiàn)絮狀物，液體透明者判為陽(yáng)性。

5 免疫熒光試驗(yàn)

用于病原的檢查，即應(yīng)用熒光抗體檢查家兔鼻腔擦拭物的涂片，有較好的應(yīng)用效果。

6 預(yù)防措施

發(fā)病后立即隔離、封鎖，重病兔捕殺并深埋或焚燒，做無害化處理。癥狀較輕或流鼻涕、咳嗽的病兔應(yīng)及時(shí)隔離治療，慢性病兔要淘汰。兔舍用10～20%石灰乳或2～3%燒堿液定期進(jìn)行消毒。堅(jiān)持自繁自養(yǎng)。引進(jìn)種兔先要進(jìn)行防疫檢查，并隔離飼養(yǎng)一個(gè)月，細(xì)菌學(xué)檢查健康者方可入場(chǎng)。要注意日常的飼養(yǎng)管護(hù)，杜絕一切畜禽出入，控制傳染源。

預(yù)防時(shí)可用兔巴氏桿菌氫氧化鋁菌苗或禽巴氏桿菌菌苗兔疫注射，或用兔瘟、兔巴氏桿菌二聯(lián)苗免疫注射。每年兩次。

治療可用鏈霉素2～4萬單位/kg，肌注，每日2次，連用3～5日；配合青霉素2～4萬單位/kg，聯(lián)合使用，效果更好?；前粪奏て?.05～0.2g/kg，配合等量的小蘇打片服用，每日2次。氯霉素針劑60～100mg/kg，片劑按每只兔0.1 ～0.15g，每日2次，有良好的效果。對(duì)有明顯呼吸癥狀的病兔，可用氯霉素等抗菌藥物滴鼻，每次3～4滴，每日2次，有顯著療效。

[1] 陳奕營(yíng).兔巴氏桿菌病的診斷和防治[J].中國(guó)畜禽種業(yè)，2010，6（9）：117-118.

李瑩（1975—），女，大專學(xué)歷，助理獸醫(yī)師，主要從事動(dòng)物檢疫工作。