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      應用間接炭粉凝集試驗診斷豬副傷寒

      2016-04-05 23:05:49陳兆龍
      獸醫(yī)導刊 2016年22期
      關鍵詞:炭粉副傷寒稀釋液

      陳兆龍

      (黑龍江省蘿北縣畜牧獸醫(yī)局,黑龍江蘿北 154200)

      應用間接炭粉凝集試驗診斷豬副傷寒

      陳兆龍

      (黑龍江省蘿北縣畜牧獸醫(yī)局,黑龍江蘿北 154200)

      間接炭粉凝集試驗是以極細的炭粉(活性炭)為載體,將已知的豬霍亂沙門氏菌抗體吸附在炭粉的表面,制成抗體致敏炭粉,成為診斷未知豬副傷寒抗原的診斷液;反之,也可將已知的豬霍亂沙門氏菌懸液(抗原)吸附在炭粉的表面,制成抗原致敏炭粉,成為檢查未知豬副傷寒抗體的診斷液。豬副傷寒炭粉診斷液與相應抗原(或抗體)相遇時,在電解質(zhì)的參與下,二者發(fā)生特異性結合,使形成肉眼可見的炭粉凝集塊,液體變得清亮透明,即為陽性反應;如果二者不相應,炭粉則聚集于液滴的中央,成為一個搖而不散的炭粉團,即為陰性。

      副傷寒;豬;試驗診斷

      1 試驗器材

      96孔V型血清反應板1塊,刻度吸管數(shù)支,微量混合器1臺,臺式離心機1臺。

      2 試驗試劑

      (1)活性炭。商品活性炭的顆粒大小不勻,多數(shù)呈不規(guī)則的針狀。而致敏用的炭粉粒度要求在0.125~0.15mm之間。

      (2)豬霍亂沙門氏菌高免疫血清。以仔豬副傷寒C500強度免疫家兔制成,效價不低于1:5600。以pH 6.4 PBS稀釋成1:400倍,56℃ 30min滅活后,置4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

      (3)稀釋液。pH6.4 PBS液98ml,加硼酸1.0g,加正常兔血清1.0ml,56℃30min滅活。

      (4)pH6.4磷酸緩沖(PBS)液。

      (5)豬副傷寒抗體致敏炭粉診斷液。取上述濕炭粉0.25g,加豬霍亂沙門氏菌高免疫血清(1:400)3.0ml,混勻后于37℃水浴中致敏10min,其間不斷振搖,取出后以3000轉/min離心10min,棄去上清液。按同樣方法洗滌2次后,往沉淀物中加1%正常兔血清5.0ml,搖勻,以3000轉/min離心10min,棄去上清液。最后向沉淀物中加1%正常兔血清3.0m,1%硫柳汞溶液0.03ml,充分混勻后即成豬副傷寒抗體致敏炭粉診斷液。

      豬副傷寒抗體致敏炭粉診斷液的鑒定:在96孔V型血清反應板的第1、2孔內(nèi)分別加入相應菌懸液0.1ml;第3孔加稀釋液0.1ml,作對照。更換刻度吸管向第1、3孔中滴加豬副傷寒抗體致敏炭粉診斷液0.1ml;第2孔中滴加稀釋液0.1m,充分振蕩3分鐘,至見不到炭粒沉淀為止。放置于濕盒內(nèi),靜止5~7min,取出觀察結果。如第1孔出現(xiàn)明顯凝集,第2、3孔不出現(xiàn)凝集,則制備的豬副傷寒抗體致敏炭粉診斷液為合格;如第1孔不出現(xiàn)明顯凝集,為不合格,應重作。

      (6)豬副傷寒抗原致敏炭粉診斷液。①洗滌抗原:將豬副傷寒沙門氏菌培養(yǎng)物用無菌生理鹽水制成懸液,加入0.2%福爾馬林殺菌。以3000~5000轉/min離心沉淀30min集菌。沉淀菌以生理鹽水洗滌2次,并用生理鹽水制成2%菌懸液。②抗原擊碎:將2%菌懸液置小三角瓶內(nèi),放入超聲波清水槽內(nèi)擊碎15min(輸出功率250W,水深3cm,頻率320~340mA),采樣放顯微鏡下檢查有無完整菌體,如有未擊碎菌體,可繼續(xù)擊碎5min。全部擊碎后,以1000轉/min離心5min,收集上層液體,即為抗原液,棄去沉淀。③豬副傷寒抗原致敏炭粉:取上述濕炭粉0.25g,加抗原液4.0ml,于20℃以上條件下,在超聲波清水槽內(nèi)作用15min(條件與抗原擊碎時相同)。取出后以3000轉/min離心5min(上層液可作為抗原回收)。沉淀物加正常兔血清0.25ml,充分振蕩,使自凝炭粉分散,再加稀釋液10ml,充分混勻后,以3000轉/min離心10min。沉淀物再以稀釋液洗滌3次。最后,將沉淀物懸浮于2.0ml稀釋液中,即為豬副傷寒抗原致敏炭粉診斷液。④豬副傷寒抗原致敏炭粉診斷液的鑒定:取豬霍亂沙門氏菌高免疫血清在96孔V型血清反應板,用稀釋液作倍比稀釋,最后1孔為稀釋液作對照。每孔中各加豬副傷寒抗原致敏炭粉診斷液1白金耳,輕輕混勻至見不到炭粒沉淀為止。放置于濕盒內(nèi),靜止5~7分鐘,取出觀察結果。如在免疫血清稀釋至含有1:200~1:400滴度,出現(xiàn)“++”凝集者為合格,例如1:12800滴度免疫血清稀釋至32~64倍時能出現(xiàn)“++”凝集者。

      (7)正常炭粉。用以56℃30分鐘滅活后的正常家兔血清代替豬霍亂沙門氏菌高免疫血清,按上法處理炭粉即可。

      (8)待檢測抗原。以血液瓊脂或麥康凱瓊脂從病豬肝、脾或肺分離豬霍亂沙門氏菌。將培養(yǎng)物用無菌生理鹽水制成豬霍亂沙門氏菌懸液,以3000~5000轉/min離心沉淀30min集菌。沉淀菌以生理鹽水做成1:50豬霍亂沙門氏菌懸液,供試驗用。如為豬的臟器標本,可以乳缽研碎后,加入1:10~1:20生理鹽水做成混懸液,以脫脂棉過濾,取過濾液,供檢驗用。

      3 試驗方法

      試驗方法有玻板凝集法和反應板凝集法兩種?,F(xiàn)以反應板凝集法為例介紹如下。

      (1)血清反應板的第1、2孔滴加待檢抗原液0.1ml;更換刻度吸管,向第3、4孔,分別各加生理鹽水0.1ml。

      (2)更換刻度吸管,向血清反應板的第1、2、3孔分別各滴加豬副傷寒抗體致敏炭粉診斷液0.1ml;更換刻度吸管,向第4孔滴加正常炭粉0.1ml;置微量混合器上(或手持旋轉)混合3min,使豬副傷寒抗體致敏炭粉均勻分散于液體中,置濕盒內(nèi),室溫下反應5min后觀察結果。

      4 判定標準

      “++++”:100%凝集。炭粉在數(shù)秒鐘迅速凝聚,液體透明?!埃保?5%凝集。大部分炭粉呈微粒凝聚,液體基本透明?!埃保?0%凝集。一半的炭粉凝集,其余的炭粒團聚呈較大的球形,搖而不散,液體呈半透明狀?!埃保?5%凝集。炭粉很少凝集,液體呈不透明狀。振蕩時,膠粘的炭粉牢固團聚在一起。“-”:無凝集。炭粉顆粒均勻分布于液體中不發(fā)生凝集,液體呈均勻混濁的不透明狀。振蕩后沒有凝聚的細小炭粒聚集于液滴中央。以“++”為判定終點。如第2~4孔均呈現(xiàn)為陰性;第1孔呈現(xiàn)“++”以上者(包括“++”),被檢樣品為陽性。如第1孔呈現(xiàn)“+”為可疑;呈“-”為陰性。

      [1] 周利岳.豬副傷寒的診治[J].畜禽業(yè),2009,(9):82.

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