李彩萍

（廣西水產(chǎn)畜牧學(xué)校，廣西南寧 530021）

生殖激素調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究進(jìn)展

李彩萍

（廣西水產(chǎn)畜牧學(xué)校，廣西南寧 530021）

研究表明顆粒細(xì)胞凋亡是卵泡閉鎖的重要原因，調(diào)控顆粒細(xì)胞凋亡的因素是多種的，而生殖激素如生長激素、抑制素、活化素、卵泡抑素等間接地和直接地對(duì)卵巢卵泡顆粒細(xì)胞凋亡發(fā)揮重要的綜合調(diào)控作用，這些激素通過多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞的凋亡，成為卵泡的存活因子和死亡因子。這些途徑相互交聯(lián)，構(gòu)成信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，與卵巢的旁分泌、內(nèi)分泌、自分泌途徑一起參與卵泡閉鎖和顆粒細(xì)胞的凋亡。

生殖激素；顆粒細(xì)胞凋亡；機(jī)制研究

卵泡在發(fā)育到排卵前所發(fā)生的退化最終被清除的生理現(xiàn)象，人們稱之為卵泡閉鎖。在大多數(shù)哺乳動(dòng)物及禽類中，70～99.9%的卵泡在排卵前發(fā)生閉鎖。現(xiàn)已證實(shí)，卵泡閉鎖主要是通過細(xì)胞凋亡來完成的，包括卵母細(xì)胞凋亡和顆粒細(xì)胞凋亡。卵母細(xì)胞的凋亡引發(fā)的卵泡閉鎖主要發(fā)生在原始卵泡，初級(jí)卵泡及腔前卵泡，而顆粒細(xì)胞的凋亡主要發(fā)生在有腔卵泡和次級(jí)未排卵的卵泡。但目前比較一致的看法認(rèn)為顆粒細(xì)胞的凋亡觸發(fā)了卵泡閉鎖，顆粒細(xì)胞的凋亡已經(jīng)在雞、豬、水牛、兔等多種動(dòng)物上得到證實(shí)。

與細(xì)胞分裂分化的過程一樣，細(xì)胞凋亡也是細(xì)胞在內(nèi)外的復(fù)雜分子環(huán)境條件刺激之下所發(fā)生的一種基因調(diào)控反應(yīng)。在卵巢卵泡顆粒細(xì)胞內(nèi)參與細(xì)胞凋亡的因子是多樣的，而激素被認(rèn)為是調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞凋亡最主要的因子，它們通過旁分泌、內(nèi)分泌及自分泌途徑等多種信號(hào)途徑參與顆粒細(xì)胞凋亡，從而調(diào)控卵泡閉鎖。

1 促性腺激素參與的顆粒細(xì)胞凋亡的信號(hào)調(diào)控

促性腺激素與哺乳動(dòng)物卵巢的卵泡募集、選擇、分化及維持優(yōu)勢卵泡生長密切相關(guān)。當(dāng)一卵泡波中出現(xiàn)大卵泡時(shí)（大約4mm）時(shí)FSH峰出現(xiàn)。卵泡募集和循環(huán)中FSH水平的輕微升高時(shí)間性聯(lián)系，卵泡的選擇與循環(huán)中FSH 水平的降低有關(guān)，當(dāng)FSH峰降低到最低點(diǎn)時(shí)，未來的優(yōu)勢卵泡和最大的次級(jí)卵泡以相同的速率生長，一直到某一點(diǎn)時(shí)兩者的生長速度明顯不同，這一點(diǎn)被稱為分化。然后LH濃度在分化開始后1d或2d急劇升高，刺激卵泡液中雌二醇的升高，從而維持優(yōu)勢卵泡的生長直至排卵。因此，F(xiàn)SH和LH被認(rèn)為是卵泡的存活因子。大量的體內(nèi)外研究表明，F(xiàn)SH能夠單獨(dú)或者與其他因子協(xié)同作用抑制顆粒細(xì)胞自發(fā)性凋亡。

信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究表明，促性腺激素通過PKA/cAMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制顆粒細(xì)胞凋亡，而在此途徑中首先發(fā)揮作用的是血管活性腸肽和垂體腺苷酸環(huán)化酶活性多肽（PACAP），它們能夠刺激培養(yǎng)顆粒細(xì)胞的類固醇分泌以及cAMP的積累，cAMP的類似物dibutylrylcAMP也能模擬這一作用，并且8-bromo-cAMP也能促進(jìn)顆粒細(xì)胞的存活。然而，PKA抑制劑H-89能快速地誘導(dǎo)培養(yǎng)的雞排卵前卵泡顆粒細(xì)胞的凋亡而阻止促性腺激素的存活效應(yīng)。此外，Tilly等人［1］提出促性腺激素促進(jìn)細(xì)胞存活可能是通過激活PKA途徑抑制促凋亡因子Bax，Apaf-1及caspase-3的表達(dá)，上調(diào)Bcl-2和BclxLONG的表達(dá)。與母雞優(yōu)勢化前卵泡的顆粒細(xì)胞比較發(fā)現(xiàn)，排卵前的卵泡內(nèi)顆粒細(xì)胞的bcl-2 mRNA水平和Bcl-xLONG蛋白明顯地增高。認(rèn)為抑凋亡蛋白在顆粒細(xì)胞內(nèi)水平過高，可有效地結(jié)合及中和胞漿內(nèi)促凋亡蛋白Apaf-1，Bad及Bax，從而防止卵泡閉鎖。

也有證據(jù)表明促性腺激素，特別是FSH，能激活PKA途徑外的多種途徑，包括蛋白激酶B（PKB），蛋白激酶C（PKC），血清及糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的激酶途徑（SgK），p42-p44細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）以及促有絲分裂蛋白激酶信號(hào)途徑（MAPK）。FSH是經(jīng)過轉(zhuǎn)錄因子，NFκB激活PKC信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。而PKB蛋白家族是通過3-磷酰肌醇-依賴性激酶1磷酸化而激活的，促性腺激素激活PKB途徑是不依賴PKA途徑的，因此PKA抑制劑H-89不能抑制FSH誘導(dǎo)的PKB磷酸化。有證據(jù)表明SgK能調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞增生及在卵泡發(fā)育和黃體形成期間的分化［2］。FSH和LH上調(diào)顆粒細(xì)胞內(nèi)SgK的表達(dá)，通過PI-3激酶-PKD 1 酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)被激活，活化的SgK蛋白轉(zhuǎn)移到核內(nèi)，在細(xì)胞核調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的活性，包括Forkhead蛋白家族成員。經(jīng)性未成熟大鼠的卵泡顆粒細(xì)胞研究證實(shí)，F(xiàn)SH可以誘導(dǎo)P38 MAPK磷酸化，并被PKA抑致劑H89抑制，而cAMP的類似物卻可以模擬這種磷酸化現(xiàn)象，說明FSH誘導(dǎo)生成的cAMP及激活的PKA是激活顆粒細(xì)胞P38MAPK途徑的必要條件。

2 甾體類激素參與的顆粒細(xì)胞凋亡信號(hào)調(diào)控

2.1 雌激素和雄激素

雌激素具有促進(jìn)卵泡生長，雄激素具有促進(jìn)卵泡閉鎖及顆粒細(xì)胞凋亡的作用，二者之間有頡頏現(xiàn)象。據(jù)此，卵泡液內(nèi)雄激素與雌激素的比值作為卵泡閉鎖的生化指標(biāo)之一，比值升高表明正在發(fā)生閉鎖。

依據(jù)經(jīng)典的受體學(xué)說，雌激素是通過與其胞質(zhì)受體結(jié)合后調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)而發(fā)揮其生理作用。但近些年研究表明，17β-E2能通過一種非基因性效應(yīng)來調(diào)節(jié)胞內(nèi)第二信使分子如Ca2+的變化，發(fā)揮其生理作用。也有研究指出卵巢卵泡內(nèi)雌激素功能在于它作為活性氧清除劑，抑制卵泡顆粒凋亡。吳際等［3］分別用1μg/ml的雌激素和雄激素刺激體外培養(yǎng)的人卵巢顆粒細(xì)胞，用Northern 雜交技術(shù)檢測Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組比較，雌激素、雌激素加雄激素作用時(shí)bcl-2基因mRNA表達(dá)分別增加45%和20%左右，而雄激素作用時(shí)則下降35%左右，結(jié)果提示雌激素對(duì)顆粒細(xì)胞的作用機(jī)理可能與上調(diào)凋亡抑制基因Bcl-2 mRNA的表達(dá)有關(guān)，雄激素則可能與下調(diào)Bcl-2基因表達(dá)有關(guān)。

2.2 孕酮

卵巢顆粒細(xì)胞有孕酮的特異受體。P4可以抑制顆粒細(xì)胞凋亡，孕酮頡頏劑，RU486，能刺激卵泡閉鎖和促進(jìn)顆粒細(xì)胞凋亡。孕酮抑制顆粒細(xì)胞凋亡是通過結(jié)合其核內(nèi)受體PR，隨后調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞內(nèi)的應(yīng)答。有研究指出，大鼠卵泡顆粒細(xì)胞分為大小兩類，只有小顆粒細(xì)胞內(nèi)存在孕酮受體，并當(dāng)孕酮與小顆粒細(xì)胞內(nèi)的孕酮受體結(jié)合后，刺激合成和分泌bFGF，而分泌的bFGF再與大、小顆粒細(xì)胞膜上的bFGF受體結(jié)合，抑制顆粒細(xì)胞凋亡，從而同時(shí)維持和保護(hù)大、小顆粒細(xì)胞的生存能力。盡管如此，孕酮的抗凋亡效應(yīng)并不都是通過PR來實(shí)施的。泌乳小鼠的乳腺上皮細(xì)胞并不表達(dá)PR，但孕酮仍能維持其細(xì)胞活性。皮質(zhì)脂酮通過乳腺上皮細(xì)胞表達(dá)的腎上腺皮質(zhì)激素受體（GR）可阻斷細(xì)胞凋亡，因此孕酮可能結(jié)合及激活GR抗凋亡。

有研究指出核PR局部定位在胞漿膜上充當(dāng)著孕酮膜受體［4］。然而從小鼠自然永生的顆粒細(xì)胞系抽提的RNA中卻不能檢測到PR mRNA，直到出現(xiàn)促性腺激素峰值后顆粒細(xì)胞才表達(dá)PR mRNA。這些結(jié)果說明PR不是孕酮在原代顆粒細(xì)胞或SIGCs的功能性膜受體。盡管對(duì)于孕酮的顆粒細(xì)胞功能性膜受體還未鑒定，但發(fā)現(xiàn)在原代顆粒細(xì)胞和SIGCs表達(dá)一種60kDa的蛋白，能結(jié)合孕酮。在配體斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)中使用該蛋白抗體發(fā)現(xiàn)，該蛋白定位在胞漿膜上與孕酮結(jié)合，孕酮通過該蛋白傳導(dǎo)信號(hào)，可能非基因組的膜啟動(dòng)機(jī)制介導(dǎo)孕酮這一作用。然而，對(duì)于這一機(jī)制卻了解得非常少，最近有研究表明孕酮通過維持基底水平的胞內(nèi)游離 ［Ca2+］（［Ca2+］i）調(diào)控顆粒細(xì)胞凋亡［5］。同時(shí)，在孕酮影響［Ca2+］i及顆粒細(xì)胞活性方面，蛋白激酶G（PKG）是一個(gè)關(guān)鍵的調(diào)節(jié)點(diǎn)，藥理動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析表明PKG參與孕酮的抗凋亡作用［6］。

3 促性腺激素釋放激素（GnRH）參與的顆粒細(xì)胞凋亡信號(hào)調(diào)控

有大量的證據(jù)表明促性腺激素釋放激素在體內(nèi)外能促進(jìn)顆粒細(xì)胞的凋亡，并具有時(shí)間、劑量的依賴性，并且促性腺激素釋放激素受體阻斷劑可完全阻斷這種凋亡現(xiàn)象。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)理研究提出，促性腺激素釋放激素與受體結(jié)合，增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平及逆轉(zhuǎn)磷酸化，可能PKC途徑轉(zhuǎn)導(dǎo)促性腺激素釋放激素的促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用。Park等人用促性腺激素釋放激素類似物作用于體外培養(yǎng)的人黃體顆粒細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)促性腺激素釋放激素受體急劇表達(dá)，細(xì)胞內(nèi)Ca2+增多，caspase-3，-8，-9活性增強(qiáng)。結(jié)果說明促性腺激素釋放激素受體結(jié)合，通過細(xì)胞內(nèi)第二信使激活caspase級(jí)聯(lián)，引起顆粒細(xì)胞凋亡。

4 生長激素（GH）參與的顆粒細(xì)胞凋亡調(diào)控

生長激素，直接或經(jīng)由IGF-1，抑制排卵前卵泡閉鎖，增強(qiáng)細(xì)胞存活能力。當(dāng)GH加入體外培養(yǎng)的牛卵泡顆粒細(xì)胞，能強(qiáng)烈地刺激顆粒細(xì)胞產(chǎn)生IGF、IGFBP-3和oxytocin，并明顯降低顆粒細(xì)胞凋亡率。在顆粒細(xì)胞的培養(yǎng)液中加入低濃度的GH（1-100ng/ mL），可刺激E2釋放，而高濃度的GH（10 mg/mL）抑制E2釋放。PKA抑制劑，KT5720和Rp-cAMP，可完全或部分地阻礙GH刺激顆粒細(xì)胞釋放IGF-1、IGFBP-3、oxytocin、P、E2，從而影響顆粒細(xì)胞的凋亡。因而可見，GH和cAMP/PKA在顆粒細(xì)胞內(nèi)連鎖控制著這些因子分泌及凋亡發(fā)生，說明GH的效應(yīng)可能是通過cAMP/PKA系統(tǒng)轉(zhuǎn)導(dǎo)的。

5 抑制素、活化素、卵泡抑素 參與的顆粒細(xì)胞凋亡信號(hào)調(diào)控

近年來，發(fā)現(xiàn)了來自卵巢的抑制素-激活素-卵泡抑素軸，它是調(diào)控FSH和LH分泌的新家族。抑制素和活化素是由α、βA、βB三種亞單位在二硫鍵聯(lián)接下的不同組合形成的作用相反的兩個(gè)二聚體。目前越來越多的報(bào)道指出，顆粒細(xì)胞所產(chǎn)生的抑制素和激活素對(duì)控制卵泡的發(fā)育起重要地調(diào)節(jié)作用，前者被認(rèn)為是卵泡生存因子，而后者被認(rèn)為是卵泡閉鎖因子。

5.1 抑制素

目前研究抑制素調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞凋亡還未見報(bào)道，多認(rèn)為抑制素參與卵母細(xì)胞凋亡以調(diào)節(jié)卵泡閉鎖。在卵泡發(fā)育過程中，抑制素通過刺激雄激素產(chǎn)生而增加雌激素的合成，使其分化為優(yōu)勢卵泡，對(duì)鄰近卵泡起到抑制作用，并引起這些卵泡的閉鎖。抑制素有大分子形式（＞160 kDa）和小分子形式（34，58，77 kDa），大分子形式抑制素在卵泡峰及FSH峰33h內(nèi)急劇表達(dá)，并在優(yōu)勢卵泡內(nèi)維持24h，同時(shí)促進(jìn)雌激素的合成及降低卵泡素的濃度，卵泡優(yōu)勢化后，在次級(jí)卵泡和小卵泡內(nèi)小分子抑制素及卵泡素增多。因此，抑制素與雌二醇、卵泡素一起在卵泡的分化、優(yōu)勢選擇及卵泡閉鎖發(fā)揮重要作用，抑制素是否通過顆粒細(xì)胞的凋亡參與卵泡的閉鎖還有待證實(shí)。

5.2 活化素和卵泡抑素

活化素是抑制素β亞基同型二聚體，競爭性結(jié)合活化素受體Ⅱ以抑制抑制素在垂體及卵巢內(nèi)的作用。顆粒細(xì)胞分泌的活化素能增加FSH受體的表達(dá)和抑制素的合成，并且促進(jìn)早期卵泡發(fā)育中顆粒細(xì)胞的增生和激素合成，而卵泡抑素調(diào)節(jié)活化素與受體的結(jié)合以中和活化素在垂體和卵巢的作用?；罨赝ㄟ^增加IGFBP-4的水平促進(jìn)嚙齒動(dòng)物顆粒細(xì)胞的凋亡，這一作用不受LH的拮抗，而受卵泡抑素抑制；而活化素卻能抑制早期有腔卵泡的細(xì)胞凋亡，并且具有劑量的依賴性，這一作用也能被卵泡抑素卵泡抑素抑制。因此，活化素參與的細(xì)胞凋亡可能與卵泡發(fā)育的階段有關(guān)，并且受到卵泡抑素的調(diào)節(jié)。

6 結(jié)語

卵巢卵泡顆粒細(xì)胞凋亡是處在一個(gè)極其復(fù)雜的內(nèi)環(huán)境控制下完成的，并具有高度的協(xié)調(diào)性。它不僅有下丘腦-垂體-卵巢軸調(diào)節(jié)作用，也有卵巢本身的旁分泌和自分泌因子的調(diào)控機(jī)制。但是生殖激素，如前所述，存在著很廣泛的調(diào)節(jié)機(jī)制，不僅遠(yuǎn)距離地、間接地控制卵巢功能，而且在卵巢內(nèi)（主要在顆粒細(xì)胞內(nèi)）也發(fā)揮著十分顯著的直接的（或相反的）調(diào)節(jié)作用。有大量的證據(jù)表明在顆粒細(xì)胞表明存在著多種激素的受體，這些激素與受體結(jié)合刺激多種途徑以調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞的活動(dòng)，啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)存活基因或死亡基因的轉(zhuǎn)錄。此外，激素調(diào)節(jié)機(jī)制也與卵泡發(fā)育有關(guān)，這可能與不同階段的卵泡內(nèi)外環(huán)境有關(guān)。盡管如此，抑制素、活化素和卵泡抑素對(duì)顆粒細(xì)胞凋亡的影響機(jī)制還不是很清楚，它們通過何種途徑調(diào)控細(xì)胞凋亡及卵泡閉鎖的研究不是很透徹，還需要進(jìn)一步的探討。此外，這些途徑構(gòu)成一個(gè)網(wǎng)絡(luò)，它們之間的交聯(lián)對(duì)話仍有待我們深入探討。

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李彩萍（1980—），女，廣西南寧人，碩士研究生，主要從事畜牧獸醫(yī)中職教育工作，講師。