余文珍陳 實(shí)張永亮涂春香陳 勇（福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，福州，350；廈門大學(xué)附屬福州市第二醫(yī)院神經(jīng)外科，福州，350007）

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活血化瘀法對鼠頸動(dòng)脈粥樣硬化損傷血管wnt／β-catenin信號通路的影響

余文珍1陳 實(shí)2張永亮2涂春香1陳 勇1
（1福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，福州，350122；2廈門大學(xué)附屬福州市第二醫(yī)院神經(jīng)外科，福州，350007）

摘要目的：觀察活血化瘀法對頸動(dòng)脈粥樣硬化血管內(nèi)皮損傷模型大鼠wnt／β-catenin信號通路的影響，探討其可能的作用機(jī)制。方法：32只SD大鼠高脂喂養(yǎng)1個(gè)月后，隨機(jī)取8只作為假手術(shù)組（僅切開皮膚），其余大鼠均行頸總動(dòng)脈球囊損傷術(shù)，成膜后再隨機(jī)分為模型組（n＝8只）、活血化瘀中藥方中劑量（臨床等效量）組（n＝8只）和高劑量（臨床2倍量）組（n＝8只）。從術(shù)后第4天開始予以相應(yīng)藥物灌胃治療（模型組、假手術(shù)組灌等量生理鹽水），2周后取術(shù)側(cè)頸總動(dòng)脈段，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法撿測wnt、FzD1、AXIN1、GSK-3β、β-catenin、VEGF mRNA基因表達(dá)水平。結(jié)果：與假手術(shù)組比較，模型組wnt、FzD1、AXIN1、β-catenin、VEGF等mRNA水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0. 01），經(jīng)活血化瘀中藥方干預(yù)后，上述各基因mRNA水平均有不同程度升高，尤其是高劑量組與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0. 05～0. 01）；只有GSK-3βmRNA水平各組無明顯差異。結(jié)論：活血化瘀法可通過上調(diào)wnt／β-catenin信號通路表達(dá)，使損傷血管VEGFmRNA基因表達(dá)水平上升，提示該法可保護(hù)頸動(dòng)脈粥樣硬化血管內(nèi)皮損傷。

關(guān)鍵詞活血化瘀法；頸動(dòng)脈粥樣硬化；血管損傷；wnt／β-catenin信號通路

Effect of Activating Blood and Resolving Stasis Therapy on Injuried Vascular wnt／β-catenin Signal Pathway of Rats with Carotid Atherosclerosis

Yu Wenzhen1，Chen Shi2，Zhang Yongliang2，Tu Chunxiang1，Chen Yong1
（1 College of Integrated Traditional and Western Medicine，F(xiàn)ujian University of TCM，F(xiàn)uzhou 350122，China；2 Department of Neurosurgery，Second Hospital Affiliated to Xiamen University，F(xiàn)uzhou 350007，China）

Abstract Objective：To observe the effect of activating blood and resolving stasis on injuried vascular wnt／β-catenin in carotid atherosclerosis mode rats and its possible mechanism. Methods：After one-month high fat-diet，32 SD rats were randomly divided into sham operation group，model group，middle dose（dose in clinical equivalent）group and high dose of（2 times the amount of clinical）group. Except for the sham operation group，the other rats underwent carotid artery balloon injury surgery. After 3 days of intraperitoneally administered orally，model group and sham operation group were given equal volume of physiological saline，administered continuously for 14d. Then the expression of wnt，F(xiàn)zD1，AXIN1，GSK-3β，β-catenin，VEGF mRNA in injured vascular were analyzed by real-time fluorescence quantitative PCR in all groups. Results：Compared with the sham operation group，the expression of Wnt，F(xiàn)zD1，AXIN1，β-catenin，and VEGF mRNA levels in model group decreased（P＜0. 01）；and after treated by activing blood and resolving stasis therapy，the expression of the above genes increased in different degrees，especially in the high dose group（P＜0. 01～0. 05）；but there was no significant difference among groups on the expression of GSK-3β mRNA. Conclusion：The theapy of activating blood and resloving stasis therapy can increase the expression of VEGF mRNA of balloon injured carotid artery vascular through up-regulating wnt／β-catenin signal pathway，which suggested that it can protect the injured vascular of carotid atherosclerosis.

Key Words Activating blood and resolving stasis therapy；Carotid atherosclerosis；Injuried vascular；wnt／β-catenin signal pathway

目前我國心腦血管疾病呈高發(fā)上升趨勢，其中動(dòng)脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）是其主要的病理學(xué)基礎(chǔ)。研究表明，血管內(nèi)皮細(xì)胞（Vascular Endothelial Cells，VECs）損傷是動(dòng)脈粥樣硬化的始動(dòng)環(huán)節(jié)或關(guān)鍵因素［1-2］。因此，保護(hù)VECs及其功能對預(yù)防和治療AS具有重要意義。而AS與傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的“血瘀”表現(xiàn)極為相似，活血化瘀中藥在臨床中大量應(yīng)用，對其機(jī)制研究表明［3-4］，活血化瘀中藥具有調(diào)脂、抗炎、抗氧化、保護(hù)內(nèi)皮等作用進(jìn)而起到抗AS。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，具活血化瘀功效的中藥方能有效修復(fù)損傷的血管內(nèi)皮，為進(jìn)一步探討其分子機(jī)制，本研究以頸動(dòng)脈球囊損傷大鼠為模型，研究活血化瘀法對損傷血管內(nèi)皮Wnt／β-catenin經(jīng)典信號通路上相關(guān)信號分子表達(dá)的影響，如wnt、糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）、軸蛋白（Axin）、β-catenin及下游靶基因血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）等，探討其修復(fù)損傷血管內(nèi)皮的作用機(jī)制，為活血化瘀法防治AS提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1. 1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級雄性SD大鼠32只，體重（200±20）g，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司（SCXK（滬）2007-0005）。

1. 2 中藥與試劑、儀器 中藥方組成：桃仁12 g、紅花9 g、當(dāng)歸9 g、生地黃9 g、牛膝9 g、川芎6 g等（從福建中醫(yī)藥大學(xué)國醫(yī)堂醫(yī)院中藥房購得）。中藥預(yù)先浸泡30 min，后水煎3次，再合并水煎液，于水浴鍋中濃縮成含生藥量2 g／mL，分裝凍存?zhèn)溆谩Ｄ懝檀迹ㄅ枺?0111108），購自上海惠興生化試劑有限公司產(chǎn)品；膽酸鈉（批號：20110508），購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。PCR引物，生工生物工程（上海）有限公司合成。手術(shù)顯微鏡（美國world precision instruments）。PCR儀（ABI 7500型）。

1. 3 實(shí)驗(yàn)分組及治療 大鼠予以高脂飼料（自制，配方如下：25%豬油，2%膽固醇，0. 1%膽酸鈉，72. 9%基礎(chǔ)飼料）喂養(yǎng)1個(gè)月后，隨機(jī)取8只作為假手術(shù)組（僅切開頸部皮膚）（A組）；余下均行頸動(dòng)脈球囊損傷術(shù)，再隨機(jī)分為模型組（B組，n＝8只）、中藥方中劑量（臨床等效量）（C組，n＝8只）和高劑量（臨床2倍量）（D組，n＝8只）。并于術(shù)后第4天開始予以相應(yīng)藥物灌胃治療（模型組、假手術(shù)組予等量生理鹽水），2周后禁食不禁水處死大鼠，取術(shù)側(cè)頸總動(dòng)脈段，迅速置于液氮中，后轉(zhuǎn)移保存在-70℃冰箱中備用。注：大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷模型制備參照David Anthony等［5］方法稍進(jìn)行改良。術(shù)后在水瓶中加入芐星青霉素以通過飲水預(yù)防感染，并單籠喂養(yǎng)。另外因未找到合適西藥，故未設(shè)陽性對照組。

1. 4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測各組wnt、FzD1、AXIN1、GSK-3β、β-catenin、VEGF mRNA的表達(dá) 按Trizol法提取各組大鼠頸動(dòng)脈總RNA，并參照逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增試劑盒操作程序進(jìn)行cDNA合成。擴(kuò)增條件為：95℃，2 min變性，95℃，10 s，60℃，30 s，70℃，30 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，獲得各樣本待測基因的CT值，各組間相對基因表達(dá)用2-△△CT表示［△△CT＝AVERAGE（樣本CT值）-AVERAGE（內(nèi)參CT值）］。采用ACTB作為內(nèi)參照，所用引物序列見表1。

1. 5 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 17. 0軟件進(jìn)行處理，組間比較采用單因素方差分析，數(shù)值均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，P＜0. 05代表有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1　實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物

2　結(jié)果

2. 1 大鼠一般情況觀察 假手術(shù)組大鼠未見有明顯異常改變。模型組大鼠術(shù)后前3 d大鼠精神較差，后稍有好轉(zhuǎn)，但毛發(fā)欠光澤，體重增長緩慢，未見感染死亡現(xiàn)象。中藥方治療組大鼠較模型組大鼠毛色光澤，活動(dòng)度較好。

2. 2 各組wnt、FzD1、AXIN1、GSK-3β、β-catenin、VEGF mRNA的表達(dá)比較 用QPCR方法檢測上述基因表達(dá)，結(jié)果顯示各引物溶解曲線（圖1）均呈現(xiàn)單峰，說明其具有較強(qiáng)的特異性。每個(gè)樣品擴(kuò)增曲線（圖2）呈S形，CT值≤30，均陽性，拋物線平滑，基線平坦，并經(jīng)指數(shù)擴(kuò)增期依次達(dá)平臺(tái)期，用2-△△Ct方法分析統(tǒng)計(jì)相對表達(dá)值。定量分析顯示，與假手術(shù)組比較，模型組wnt、FzD1、AXIN1、β-catenin、VEGF等mRNA水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0. 01），藥物干預(yù)后，上述各基因mRNA水平均有不同程度升高，尤其是高劑量組與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0. 05～0. 01）；只有GSK-3βmRNA水平各組無明顯差異。（圖1、圖2，表2）

3　討論

圖1　相關(guān)基因溶解曲線

圖2　相關(guān)基因擴(kuò)增曲線

表2　各組wnt、FzD1、AXIN1、GSK-3β、β-catenin、VEGF mRNA相對表達(dá)比較（±s）

表2　各組wnt、FzD1、AXIN1、GSK-3β、β-catenin、VEGF mRNA相對表達(dá)比較（±s）

注：與A組比較，*P＜0. 05，**P＜0. 01；與B組比較，△P＜0. 05，△△P＜0. 01。

組別　　假手術(shù)組（A）　　模型組（B）　　中藥中劑量組（C）　　中藥高劑量組（D）只數(shù)8888 wnt　1. 0000±0. 1442　0. 3191±0. 0464**　0. 7239±0. 0940**△△　0. 4493±0. 0403**△△FzD1　1. 0000±0. 1792　0. 0065±0. 0004**　0. 0226±0. 0014**　0. 1238±0. 0099**△AXIN1　1. 0000±0. 0791　0. 0208±0. 0014**　0. 2799±0. 0365**△△　0. 6699±0. 0357**△△GSK-3β　1. 0000±0. 0815　1. 0269±0. 0975　0. 9833±0. 1122　0. 9731±0. 0732 β-catenin　1. 000±0. 1402　0. 7843±0. 0471**　0. 8482±0. 0942**　0. 9539±0. 0894△△VEGF　1. 0000±0. 0425　0. 4304±0. 0354**　0. 6072±0. 0457**△△　0. 7407±0. 0710**△△

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為“久病必有瘀，怪病必有瘀”，而AS的發(fā)生是一個(gè)長期的過程，最終導(dǎo)致臟腑功能失調(diào)，故而治療上當(dāng)以活血化瘀為主［6-7］。田金洲等對腦梗死患者進(jìn)行中醫(yī)證候分析，發(fā)現(xiàn)分型屬血瘀證的患者中有78. 6%頸動(dòng)脈超聲檢查有頸動(dòng)脈斑塊，而無血瘀證的只有57. 4%有頸動(dòng)脈斑塊，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0. 05）；經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析認(rèn)為頸動(dòng)脈粥樣硬化和血瘀證成正相關(guān)性［8］。故而本課題采用活血化瘀中藥方干預(yù)頸動(dòng)脈粥樣硬化。

內(nèi)皮細(xì)胞是構(gòu)成血管壁的生物屏障，在AS病變的發(fā)生上有重大意義［9］。而一般認(rèn)為頸動(dòng)脈粥樣硬化較冠狀動(dòng)脈粥樣硬化要早，與主動(dòng)脈硬化大約同時(shí)進(jìn)行，它是腦血管病重要的危險(xiǎn)因素之一［10］。頸動(dòng)脈粥樣硬化的治療方法有頸內(nèi)動(dòng)脈切除術(shù)（CEA）、頸動(dòng)脈血管成形支架置入術(shù)（CAS）、經(jīng)皮腔內(nèi)動(dòng)脈成形術(shù)（PTA）等［11］。這些治療方法均有可能損傷血管內(nèi)皮，引起內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂。本研究采用的動(dòng)物模型是先高脂喂養(yǎng)以造成血脂升高，后借助球囊損傷血管以模擬頸動(dòng)脈粥樣硬化血管內(nèi)皮損傷進(jìn)而導(dǎo)致功能紊亂。Wnt／β-catenin信號通路在正常細(xì)胞中無激活，在生物進(jìn)化中極為保守，其異常表達(dá)與人類疾病關(guān)系密切［12-13］。目前研究表明血管發(fā)生與Wnt／β-catenin信號通路有著密切的聯(lián)系，該信號通路可能成為未來血管內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)疾病治療的新靶點(diǎn)［14-15］。Wnt／β-catenin信號通路可以分為經(jīng)典型和非經(jīng)典型途徑。經(jīng)典Wnt蛋白（含Wnt1、Wnt3A和Wnt8等）與膜受體卷曲蛋白（Frizzled）結(jié)合，從而抑制Gsk-3β與Axin的表達(dá)，降低β-catenin的磷酸化［16］。β-catenin是一種多功能蛋白，可以作為血管內(nèi)皮和N-鈣粘素和肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架之間的支架，在存在Wnt配體時(shí)，可使其穩(wěn)定并轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核以促進(jìn)轉(zhuǎn)錄，激活靶基因VEGF等轉(zhuǎn)錄，控制血管穩(wěn)定性［17-19］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，球囊損傷大鼠血管wnt配體（wnt1）、wnt受體（FzD1）、Axin及β-catenin mRNA表達(dá)水平均較正常血管下降；經(jīng)活血化瘀中藥方干預(yù)后，模型大鼠損傷血管上述基因表達(dá)水平均有不同程度升高，特別是高劑量組，與模型組比較有顯著促進(jìn)作用（P＜0. 05～0. 01），表明其具有一定的劑量依賴性。Gsk-3β蛋白是Wnt／β-catenin信號通路中的關(guān)鍵分子，起負(fù)性調(diào)控作用，其可調(diào)節(jié)β-catenin進(jìn)入細(xì)胞核的量，防止細(xì)胞功能出現(xiàn)異常［20］。本研究結(jié)果顯示在Gsk-3β基因表達(dá)水平方面各組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示該模型Gsk-3β基因未出現(xiàn)表達(dá)異常。VEGF與血管內(nèi)皮特異性受體結(jié)合后，可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行有絲分裂，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞增生，形成新生血管［21］。在本研究中發(fā)現(xiàn)，活血化瘀中藥方能促進(jìn)VEGF基因的表達(dá)，提示其具有修復(fù)損傷血管的作用，這可能與促進(jìn)上述wnt／β-catenin信號通路中關(guān)鍵信號分子的表達(dá)有關(guān)。

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（2015 -07 -10收稿 責(zé)任編輯：王明）

中圖分類號：R285. 5

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

doi：10. 3969／j. issn. 1673 -7202. 2016. 03. 034

作者簡介：余文珍（1977. 01—），女，碩士，副教授，研究方向：代謝性疾病研究，E-mail：110035632＠qq. com

基金項(xiàng)目：福建省教育廳A類科技項(xiàng)目（編號：JA13165）；福州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（編號：2012-S-155-1）；福建中醫(yī)藥大學(xué)校管科研項(xiàng)目（編號：X2012018）