楊 飛?。ㄉ綎|省棗莊市嶧城區(qū)畜牧獸醫(yī)局　277300）

新型獸用疫苗佐劑研究進(jìn)展

楊 飛（山東省棗莊市嶧城區(qū)畜牧獸醫(yī)局277300）

相比于傳統(tǒng)的滅活或活體疫苗，由基因工程重組抗原或化學(xué)合成多肽組成的現(xiàn)代疫苗往往存在免疫原性弱等問題，需要免疫佐劑來(lái)增強(qiáng)其作用。疫苗佐劑能夠提高機(jī)體對(duì)抗原的適應(yīng)性免疫應(yīng)答，在疫苗的研發(fā)中具有重要的作用。隨著藥物研發(fā)的不斷進(jìn)步，近年來(lái)國(guó)內(nèi)外出現(xiàn)了許多新型佐劑。盡管傳統(tǒng)的鋁鹽佐劑是目前唯一全球公認(rèn)的人用佐劑，但存在激發(fā)細(xì)胞免疫應(yīng)答能力差等不足，因此，需要研發(fā)更為安全有效的獸用新型佐劑，尤其是安全無(wú)毒、能夠刺激較強(qiáng)細(xì)胞免疫應(yīng)答的佐劑，以及適合粘膜疫苗，亞單位疫苗及DNA疫苗等的免疫佐劑。本文分類闡述了近年來(lái)疫苗佐劑的最新研究進(jìn)展及應(yīng)用概況，總結(jié)了佐劑對(duì)免疫系統(tǒng)的影響和作用機(jī)制，臨床有效性和不良反應(yīng)，以及新型佐劑研發(fā)最新關(guān)注熱點(diǎn)。

疫苗佐劑是能夠提高機(jī)體對(duì)抗原的適應(yīng)性免疫應(yīng)答的物質(zhì)[14]，能夠在免疫反應(yīng)低下的動(dòng)物中誘導(dǎo)全面持久的免疫應(yīng)答，因此疫苗佐劑在疫苗的研發(fā)中具有重要的作用。傳統(tǒng)獸用疫苗中常用的佐劑有鋁鹽佐劑和油佐劑。鋁鹽佐劑為目前應(yīng)用最廣泛的一類佐劑，但其在誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞及Th1型反應(yīng)中作用很有限，在同高純度的小分子蛋白抗原共同使用時(shí)不能引起足夠的抗體應(yīng)答[1]。油佐劑疫苗在促進(jìn)疫苗效果方面優(yōu)于鋁鹽佐劑疫苗，但由于油佐劑皮下注射會(huì)引起炎癥、潰瘍和肉芽腫，且不易代謝。因此，研制和開發(fā)新型佐劑，已成為新疫苗研究中的一個(gè)重要領(lǐng)域[2-4]。目前，隨著基因工程亞單位疫苗及DNA疫苗的研究，高度純化新型疫苗的生產(chǎn)技術(shù)得到不斷突破，但其抗原常常不能誘導(dǎo)較強(qiáng)的免疫應(yīng)答[2]。因此要使新型疫苗的缺點(diǎn)得到彌補(bǔ)，最常用的方法是以適當(dāng)?shù)淖魟┡c之配合使用。而常規(guī)的佐劑由于其自身的缺陷使之很難適應(yīng)新型疫苗的發(fā)展，因此新型佐劑的研究工作已經(jīng)逐漸引起科研工作者的注意。

1　納米粒子佐劑

（1）納米粒子一般是指粒徑在1～100nm范圍內(nèi)的超微粒子，納米技術(shù)是指在1～100nm的量度范圍內(nèi)研究原子、分子的結(jié)構(gòu)及相互作用并加以應(yīng)用的技術(shù)，物質(zhì)用納米技術(shù)細(xì)化之后，具有比表面積大，表面活性中心多，反應(yīng)活性高，吸附和催化能力強(qiáng)的特點(diǎn)，因此會(huì)產(chǎn)生體積效應(yīng)，表面效應(yīng)，量子尺寸效應(yīng)，目前關(guān)于納米材料用作疫苗佐劑，已受到極大重視，納米粒子能穿透組織間隙，也可通過機(jī)體最小的毛細(xì)血管，且分布面極廣，易被消化和吸收，而且包裹或表面結(jié)合抗原的納米粒子能使蛋白抗原的表面充分暴露，同時(shí)使抗原結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定，在體內(nèi)能引起強(qiáng)烈的特異性免疫反應(yīng)。（2）大量的實(shí)驗(yàn)都表明，納米粒子佐劑可有效提高細(xì)胞免疫，體液免疫和黏膜免疫，美國(guó)密歇根州大學(xué)生物納米科技中心，將小鼠免疫流感病毒A和納米乳劑的混合物免疫小鼠，20d后用致死劑量的流感病毒感染小鼠，結(jié)果免疫動(dòng)物受到了完全的保護(hù)，而接種了甲醛滅活病毒或納米乳劑的小鼠，則發(fā)展為病毒性肺炎，6d后死亡[15]。Stieneker等發(fā)現(xiàn)聚甲基丙烯酸甲酯納米粒子對(duì)大鼠體內(nèi)的AIDS疫苗起輔助作用時(shí)，與氫氧化鋁輔助作用相比，抗體的滴度要高出100～1000 倍[16]。柴家前等通過專門技術(shù)制備納米蜂膠顆粒(NPP)，發(fā)現(xiàn)NPP使雛雞血液中的T淋巴細(xì)胞比率和RBC2C3bR花環(huán)率都極顯著增加，而RBC21C花環(huán)率顯著降低[5]。納米佐劑是目前研究的熱點(diǎn)，可避免傳統(tǒng)疫苗的載體效應(yīng)發(fā)生，還可提高生物利用率，提高制劑的均勻性，分散性和吸收性，具有較理想的免疫增強(qiáng)作用。

2　天然來(lái)源的佐劑

2.1蜂膠蜂膠是蜜蜂從植物中采集的樹脂、花粉及蜂蠟等混合物，內(nèi)含幾十種生物活性物質(zhì)、多種維生素、氨基酸、脂肪酸、多糖及酶等，具有廣譜抗病毒、抗細(xì)菌和抗霉菌作用。其具有增進(jìn)機(jī)體免疫功能和促進(jìn)組織再生的作用，應(yīng)用蜂膠或配合抗原能增強(qiáng)免疫功能以及補(bǔ)體和吞噬細(xì)胞活力，增加白細(xì)胞的產(chǎn)生和抗體產(chǎn)量，并使特異性凝集素的產(chǎn)生大大增加。趙恒章等以油乳劑、蜂膠和鋁膠為佐劑，按一定比例配制成巴氏桿菌的滅活苗[6]。經(jīng)試驗(yàn)證明，該疫苗安全，有效，其中鋁膠苗的效果不及蜂膠苗和油苗，油苗的保護(hù)期和蜂膠滅活苗的保護(hù)期相當(dāng)，但蜂膠滅活苗的抗體水平上升速度比油苗快且保護(hù)率高。歐陽(yáng)素貞在大腸桿菌病多價(jià)蜂膠苗對(duì)肉仔雞免疫效果的跟蹤研究中證明，該蜂膠疫苗對(duì)禽大腸桿菌病的免疫效果可靠[7]；另外發(fā)現(xiàn)淫羊霍-蜂膠佐劑不僅能提高小鼠外周血T淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率，而且影響抗環(huán)磷酸胺對(duì)T淋巴細(xì)胞的抑制作用，使受抑制的T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化活性基本恢復(fù)正常，并能刺激T，B淋巴細(xì)胞活化，顯著提高CTL活性[8]。

2.2多糖，糖苷及復(fù)方中藥多糖是一類具有廣泛生物活性的生物大分子物質(zhì)。植物多糖來(lái)源于植物的根、莖、葉、皮、種子和花，由相同或不同單糖以 α或β-糖苷鍵所組成，分子量數(shù)萬(wàn)甚至數(shù)百萬(wàn)。其具有抗菌、抗病毒、抗寄生蟲、抗感染、抗腫瘤、抗輻射、抗衰老、降血糖、降血脂等功用，對(duì)機(jī)體毒副作用小。中藥多糖特別是補(bǔ)益類中藥多糖一般都有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的作用，而對(duì)正常細(xì)胞沒有毒副作用，是良好的生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑，很有希望開發(fā)成為新型疫苗佐劑，從中草藥植物中提取糖苷，與病毒及類脂混合，在一定條件下形成一種性能穩(wěn)定的復(fù)合制劑，免疫增強(qiáng)作用明顯，此外，一些復(fù)方中藥也可作為佐劑，如紫術(shù)散，當(dāng)歸補(bǔ)血湯等，對(duì)免疫激活和提高免疫都有很大的作用?？傊?，中藥佐劑安全，有效，可靠，穩(wěn)定，是一個(gè)很有發(fā)展前景的佐劑，但因其產(chǎn)地不同，采收時(shí)間差異，有效成分的含量不如西藥那樣容易確定，另外一些佐劑制作煩瑣，價(jià)格高，效果不穩(wěn)定，限制了它的推廣使用，目前將中藥作為疫苗佐劑研究存在很多問題，如分子結(jié)構(gòu)不明確，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不易控制，生物活性的影響因素多等。柳鐘勛從當(dāng)歸中提取的當(dāng)歸多糖(ASDP)和當(dāng)歸內(nèi)酯(ASDE3)作為乙肝疫苗基因工程疫苗佐劑，發(fā)現(xiàn)ASDP/ASDE3的免疫效果明顯優(yōu)于鋁佐劑，且有效劑量范圍廣，毒性小[9]。另外，枸杞多糖作為甲肝疫苗的佐劑效果與鋁佐劑相似，且與鋁佐劑有協(xié)同作用。謝勇等研究發(fā)現(xiàn)以殼聚糖為佐劑的幽門螺桿菌蛋白抗原對(duì)幽門螺桿菌感染具有免疫保護(hù)作用，可明顯促進(jìn)TH2細(xì)胞因子的分泌，且與CT有協(xié)同作用[10]。林樹乾等發(fā)現(xiàn)黃芪多糖與金黃色葡萄球菌滅活苗聯(lián)用后可以顯著提高血清抗體滴度且抗體維持一個(gè)較高水平[11]。

3　脂質(zhì)體

脂質(zhì)體是單層磷脂或由數(shù)層可溶性物質(zhì)隔開的呈同心圓狀排列的連續(xù)多層磷脂所組成的脂質(zhì)小囊，既是抗原載體，也是免疫佐劑。其具有多種優(yōu)點(diǎn)：安全性高，天然靶向型，能降低被包裹抗原的毒性，增強(qiáng)動(dòng)物對(duì)抗原物質(zhì)的耐受性，提高抗原穩(wěn)定性，延長(zhǎng)疫苗使用期，降低貯存條件。但又存在由于所用材料的尾部脂肪酸有不同程度的雙鏈，導(dǎo)致貯存時(shí)會(huì)隨時(shí)間而逐漸氧化，產(chǎn)生溶血磷脂；小脂質(zhì)體傾向于相互融合成大脂質(zhì)體，在融合過程中可導(dǎo)致包入的抗原釋放等缺點(diǎn)。70年代Edgar等系統(tǒng)研究了LPS的性質(zhì)并用沙門氏菌的LPS水解得到MPLA，發(fā)現(xiàn)MPLA對(duì)患腫瘤的幾內(nèi)亞豬有保護(hù)作用，而其毒性只占LPS的0.08%。近年來(lái)，人們做了很多工作來(lái)驗(yàn)證Edgar的工作。IL-1b是一種促炎癥因子，在小鼠的研究[17]中，MPLA強(qiáng)烈刺激IL-1b的mRNA翻譯，相似的模式在后來(lái)研究中再次發(fā)現(xiàn)[18]，小鼠脾臟在注射MPLA后強(qiáng)烈表達(dá)IL-1b，但血清中IL-1b含量相比注射LPS組小鼠要低很多。由此可知MPLA與LPS同樣具有刺激促炎癥因子IL-1b的作用，但MPLA作用下IL-1b只被限制在特定部位起作用。劉湘濤等報(bào)道，用脂質(zhì)體、油乳劑、明礬及金黃色葡萄球菌免疫復(fù)合物為佐劑，分別與禽多殺性巴氏桿菌的主要保護(hù)性抗原莢膜多糖(CPS)配制成疫苗免疫雞，結(jié)果顯示，脂質(zhì)體組的IgG抗體水平高，抗體持續(xù)時(shí)間最長(zhǎng)[12]。脂質(zhì)體還是一種有效的黏膜免疫佐劑，能誘導(dǎo)分泌型IgA(SigA) 的產(chǎn)生。Alezn 等認(rèn)為，脂質(zhì)體疫苗經(jīng)下呼吸道免疫雌性小鼠，除誘導(dǎo)全身IgG和呼吸道SIgA分泌外，還可誘導(dǎo)陰道分泌物中產(chǎn)生特異性IgA，即遠(yuǎn)端黏膜區(qū)產(chǎn)生SigA。

4　細(xì)胞因子

細(xì)胞因子可調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖分化并誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)揮功能的高活性多功能多肽蛋白或糖蛋白。其具有明顯的免疫佐劑效應(yīng)，可增強(qiáng)病毒、細(xì)菌和寄生蟲疫苗的保護(hù)效應(yīng)，激發(fā)對(duì)腫瘤抗原的免疫反應(yīng)。先前研究得出細(xì)胞因子通過免疫調(diào)節(jié)提高抗原提呈能力，誘導(dǎo)并增強(qiáng)CTL的作用；細(xì)胞因子佐劑能使機(jī)體持續(xù)產(chǎn)生抗體，并阻礙淋巴濾泡中生發(fā)中心的形成；細(xì)胞因子能將B細(xì)胞與外周隔絕，使抗體生成下降，從而起到陰性免疫調(diào)節(jié)作用。

4.1粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)GM-CSF能募集并活化APC，增強(qiáng)初級(jí)免疫應(yīng)答。但GM-CSF的實(shí)際應(yīng)用受限于其毒性，需要多次注射和異源免疫[19]。在有關(guān)人用疫苗佐劑研究中上市產(chǎn)品主要用于癌癥化療引起的骨髓移植。可作為疫苗和單抗的復(fù)合佐劑，在上市適應(yīng)癥范圍內(nèi)有較好的耐受性[20]。

4.2白介素-12(IL-12)IL-12是目前發(fā)現(xiàn)的主要由B細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，與IL-2有協(xié)同作用。除此之外，IL-12可提高黏膜和體液免疫應(yīng)答中IgG2α和IgA的水平，明顯降低細(xì)菌的侵入量[13]。研究證明，其可激活Th1細(xì)胞，有望用于臨床試驗(yàn)的細(xì)胞因子佐劑。它加強(qiáng)Th1型細(xì)胞免疫，目前正在進(jìn)行AIDS和腫瘤治療的臨床試驗(yàn)[21]。

4.3白介素1(IL-1)IL-1是由抗原-抗體復(fù)合物、炎性細(xì)胞因子IL-1家族與OVA和破傷風(fēng)毒素的聯(lián)合免疫，提高血清和黏膜中IgG和IgA的水平，增強(qiáng)細(xì)胞免疫應(yīng)答[13]。近年來(lái)，IL-1介導(dǎo)固有炎性反應(yīng)，其佐劑性質(zhì)引起了研究者們?cè)絹?lái)越多的關(guān)注。細(xì)胞因子可以與DNA疫苗中的抗原共表達(dá)，提高DNA疫苗的效應(yīng)[20]。但是由于表達(dá)和純化的成本高，免疫時(shí)需多次注射，因而未得到廣泛應(yīng)用。

5　展望

以上所述的佐劑種類繁多，效果明顯，但它們也有一些不可避免的缺點(diǎn)，合理選擇和使用佐劑不但可以節(jié)約抗原的使用量，還可以迅速刺激免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)免疫應(yīng)答，特別對(duì)免疫力低下的動(dòng)物意義重大。為了追求可以以最小的免疫刺激即可引起適當(dāng)?shù)拿庖叽龠M(jìn)作用，粘度較低、顆粒大小均勻、穩(wěn)定性良好，在機(jī)體內(nèi)存在時(shí)間較長(zhǎng)，并可提高血中抗體濃度，局部反應(yīng)輕微，且無(wú)不良反應(yīng)等的理想免疫佐劑，已逐步成為研究的熱點(diǎn)。以多糖類物質(zhì)佐劑為例，一些多糖分別或同時(shí)具有調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞、吞噬細(xì)胞、白細(xì)胞介素、抗體水平以增強(qiáng)免疫功能；一些多糖可經(jīng)化學(xué)修飾形成多孔微顆粒，具有濃縮和儲(chǔ)存抗原的作用。多糖微?？赡褪芪改c道的降解，可發(fā)展成口服免疫載體?？梢?，隨著分子免疫學(xué)等基礎(chǔ)理論的快速發(fā)展，免疫佐劑的作用不再局限于增強(qiáng)免疫應(yīng)答，而更著重于其誘導(dǎo)機(jī)體選擇性地產(chǎn)生有效防御相應(yīng)病原體感染的特異性的免疫應(yīng)答并減少抗原物質(zhì)的副作用。目前對(duì)免疫佐劑研究的主要趨勢(shì)是多來(lái)源、多途徑開發(fā)出低廉、高效、速效、長(zhǎng)效的新型佐劑并探索其作用機(jī)理。隨著佐劑大量出現(xiàn)的同時(shí)，隨之而來(lái)的是對(duì)其安全性的擔(dān)憂。因此，未來(lái)的工作重點(diǎn)之一應(yīng)是深入研究佐劑的作用機(jī)制，全面推測(cè)其對(duì)免疫系統(tǒng)的影響，尋找并建立合理可靠的動(dòng)物模型，預(yù)測(cè)免疫毒性發(fā)生的可能性。

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（2016–08–22）