小鼠流感病毒性肺炎模型中腸道的病變及在中醫(yī)理論研究中的應(yīng)用

張淑靜 吳 瑩 齊曉宇 葛東宇 李根茂 玄子男 王 謙 王旭丹 李姝玉

（北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京，100029）

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小鼠流感病毒性肺炎模型中腸道的病變及在中醫(yī)理論研究中的應(yīng)用

張淑靜 吳 瑩 齊曉宇 葛東宇 李根茂 玄子男 王 謙 王旭丹 李姝玉

（北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京，100029）

摘要目的：建立小鼠流感性肺炎模型，明確呼吸道流感病毒感染過(guò)程中是否存在特異性的腸道病理?yè)p傷，并探討了其在“肺與大腸相表里”研究中的應(yīng)用。方法：BALB／c小鼠48只隨機(jī)分為正常組、病毒組。病毒組給予50 μL、50LD50病毒液滴鼻建立流感病毒感染的小鼠肺炎模型，感染后第3、5、6天分別取材，HE染色檢測(cè)肺臟、大腸、小腸、心臟、肝臟、腎臟組織病理結(jié)果，血生化檢測(cè)血清谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和尿素氮（BUN）水平。結(jié)果：流感病毒感染后，病毒組小鼠肺組織出現(xiàn)明顯的炎性病變外，隨時(shí)間延長(zhǎng)肺組織充血水腫出血加重；小腸黏膜腺體排列紊亂，絨毛粗大、部分脫落，黏膜固有層炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；大腸黏膜固有層、肌層大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，腺體結(jié)構(gòu)消失、脫落；而心臟、肝臟、腎臟無(wú)明顯病理改變；病毒組小鼠血清AST、ALT、BUN較正常組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：小鼠流感病毒性肺炎模型中存在小腸、大腸特異性免疫病理?yè)p傷，是研究中醫(yī)“肺與大腸相表里”理論及相關(guān)臨床治法的理想模型。

關(guān)鍵詞流感病毒；肺炎；腸道免疫病理；肺與大腸相表里

Pathologlcal Damage of Intestlne ln the Vlral Pneumonla Mouse Model and lts Appllcatlon ln the Theoretlcal Research of Tradltlonal Chlnese Medlclne

Zhang Shujing，Wu Ying，Qi Xiaoyu，Ge Dongyu，Li Genmao，Xuan Zinan，Wang Qian，Wang Xudan，Li Shuyu （Basic Medical Science College of Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China）

Abstract Objectlve：To establish viral pneumonia mouse models infected by influenza virus，and observe whether there is a specific intestinal pathological damage in the process of respiratory influenza virus infection，then discuss its application on the research of the theory“the lung and the large intestine being interior-exteriorly related”in Traditional Chinese Medicine. Methods：A total of 48 BALB／c mice were randomly divided into the normal group and the virus group. Influenza virus 50 μL 50 LD50and mouse lung-adapted strain，was intranasally inoculated to the virus group. On the 3，5 and 6 day of infection，HE staining was used to detect the pathologic changes／in lungs，large intestines，small intestines，hearts，livers and kidneys. In addition，blood biochemistry was used to detect the levels of aspertate aminotransferase（AST），alanine aminotransferase（ALT），urea nitrogen （BUN）in serum. Results：After infection，the lungs of the mice in the virus group showed obvious inflammatory pathological changes，and hyperemia edema，hemorrhage in the lung tissues aggravated with time；the arrangement of mucosal glands in the small intestines was disordered with the villus swelling and partial detachment，and the mucosa lamina propria was infiltrated with lots of inflammatory cells；the large intestine lamina propria and the muscular layer has been infiltrated with large number of inflammatory cells and the muscle layer glandular structures disappeared. However，the heart，liver and kidney had no obvious pathological changes，and the AST，ALT，BUN levels in the virus group showed no significant difference. Concluslon：The viral pneumonia mouse model infected with influenza virus exists specific immunologically pathological damage in the small intestine and the large intestine. It serves as an ideal model to study the Traditional Chinese Medicine theory“the Lung and the Large Intestine being interior-exteriorly related”and the related clinic treatment.

Key Words Influenza virus；Viral pneumonia mouse model；Intestinal munological pathology；the lung and the large intestine being interior-exteriorly related

流感是由流感病毒感染引起的急性呼吸道傳染病。臨床上，流感最常見的癥狀包括發(fā)熱、咳嗽、頭痛、乏力，并常伴有胃腸炎樣癥狀，如腹瀉、上腹疼痛、惡心、嘔吐［1-4］。2014年，Wang等在小鼠流感病毒性肺炎模型中發(fā)現(xiàn)：呼吸道流感病毒感染會(huì)引起小腸免疫損傷，對(duì)肝臟和腎臟卻沒有影響；并揭示了流感病毒感染誘發(fā)胃腸炎的機(jī)制，流感病毒感染誘導(dǎo)的小腸免疫損傷并非流感病毒的直接感染導(dǎo)致的，而是由肺源性CCR9＋，CD4＋T細(xì)胞向腸道組織遷移，引起腸道菌群失調(diào)所致［5］。然而，Wang等的研究中小鼠的腸道病變主要在小腸，對(duì)于大腸僅描述了感染小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度較正常小鼠明顯縮短［5］。既然腸道菌群失調(diào)是呼吸道流感病毒感染后誘發(fā)腸道炎性損傷的關(guān)鍵，而腸道菌群主要寄生在大腸，那么，呼吸道流感病毒感染是否會(huì)引起大腸的炎性病變，需要進(jìn)一步明確。

“肺與大腸相表里”是中醫(yī)臟腑理論體系中的重要內(nèi)容，其源于《黃帝內(nèi)經(jīng)》，《靈樞·本輸》篇曰“肺合大腸，大腸者，傳導(dǎo)之府”。目前常用的研究“肺與大腸相表里”的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型為以便秘為主要腸道表現(xiàn)的哮喘小鼠或潰瘍性結(jié)腸炎小鼠模型［6-9］，然而，這些模型的肺腸病變是否具有特異性，仍不清楚，并無(wú)相關(guān)報(bào)道。因此，本研究通過(guò)觀察小鼠流感病毒性肺炎模型中肺臟、小腸、大腸、心臟、肝臟、腎臟的病變情況，進(jìn)一步驗(yàn)證該模型中腸道的病變是否具有特異性，為該模型在肺與大腸相表里理論及相關(guān)臨床治法研究中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1　資料與方法

1. 1 一般資料

1. 1. 1 動(dòng)物與病毒株 雄性BALB／c小鼠48只，體重16～18 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK（京）2007-0001；病毒株：流感病毒甲型鼠肺適應(yīng)株A／FM／1／47（H1N1），由中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒學(xué)研究所提供，常規(guī)雞胚復(fù)蘇傳代，SPF種蛋購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1. 1. 2 藥物與試劑 HE染色試劑盒購(gòu)自北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司，乙醇、二甲苯購(gòu)自北京化工廠（分析純），石蠟（54～56℃）購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，Na2HPO4、KH2PO4和NaCl（1XPBS溶液），甲醛等購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，鼠血清ALT、AST和BUN水平檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所（貨號(hào)分別為C009-2、C0010-2和C013-2）。

1. 2 實(shí)驗(yàn)方法

1. 2. 1 分組與造模 將BALB／c小鼠隨機(jī)分為正常組、病毒組，每組24只，腹腔注射50 μg／g體重的戊巴比妥鈉麻醉小鼠，約10～15 min，待小鼠深度麻醉后，抓取小鼠使其鼻孔朝上，并對(duì)病毒組小鼠以50 μL、50LD50病毒液滴鼻感染，正常組小鼠用等量無(wú)菌磷酸鹽緩沖液（PBS）滴鼻對(duì)照。滴鼻感染結(jié)束后，讓小鼠側(cè)臥至自然蘇醒。

1. 2. 2 流感病毒的擴(kuò)增 將購(gòu)買來(lái)的SPF種蛋氣室朝上，室溫靜置至少24 h，在37. 9℃，濕度40%～60%，通風(fēng)的孵化箱中孵化，每隔3～4 h保持氣室向上水平翻轉(zhuǎn)一次，使其均勻受熱孵化，每天檢查雞胚的生長(zhǎng)情況，及時(shí)發(fā)現(xiàn)并剔除死胚。使用前將病毒接種于9日齡雞胚，尿囊腔傳代，常規(guī)培養(yǎng)，48h收集新鮮無(wú)菌尿囊液，傳代兩次。做微量血凝試驗(yàn)（HA）測(cè)病毒血凝效價(jià)，血凝滴度為1∶512，體內(nèi)感染小鼠，采用Reed Muench法［10］測(cè)定計(jì)算其對(duì)小鼠的半數(shù)致死量（LD50）為10－3. 877。

1. 2. 3 小鼠一般情況觀察、體重檢測(cè) 將隨機(jī)分配的正常組、病毒組小鼠，作標(biāo)記，連續(xù)6 d記錄小鼠的體重，并記錄小鼠的一般情況觀察進(jìn)行打分，打分的具體方法為：0分，健康；1分，幾乎不翹毛；2分，翹毛，但仍然活潑；3分，翹毛并且不活潑；4分，翹毛或不活潑；5分，死亡。

1. 2. 4 HE染色進(jìn)行組織病理學(xué)分析 正常組和病毒組小鼠于感染后3 d、5 d、6 d，小心快速摘取肺臟、大腸、小腸、肝臟、心臟、腎臟等組織于10%的福爾馬林中固定，流水中沖水過(guò)夜，梯度酒精中脫水，二甲苯透明，石蠟包埋后，將組織切片厚為5～7 μm，HE染色后脫水透明，中性樹膠封片后，顯微鏡下觀察結(jié)果并拍照。

1. 2. 5 生化檢測(cè) 正常組和病毒組小鼠于感染后3 d、5 d、6 d，摘眼球取血，室溫靜止30 min，3 000 r／min離心，收集血清，于－80℃冰箱保存。鼠血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和血清尿素氮（BUN）水平檢測(cè)按南京建成試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)。通過(guò)檢測(cè)血清AST、ALT、和BUN的水平來(lái)反映小鼠心臟、肝臟、腎臟的功能。

1. 3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 各分組所得計(jì)量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用SPSS 16. 0軟件處理數(shù)據(jù)，2組間均數(shù)比較用t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0. 05，P＜0. 05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

2　結(jié)果

2. 1 小鼠流感病毒感染后一般情況及體重的觀察正常組小鼠健康，精神良好，行為敏捷，皮毛順滑光亮，呼吸正常；病毒組小鼠在感染后第2 d出現(xiàn)食欲明顯下降，呼吸加快、短促，以腹式呼吸為主，行動(dòng)遲緩無(wú)力、毛發(fā)雜亂、翹毛、體溫下降，第3～4天病情加重，喘促明顯，蜷縮、怕冷、寒顫、皮毛無(wú)光澤，第6天開始出現(xiàn)死亡（圖1）。正常組小鼠體重?zé)o明顯變化，病毒組小鼠體重逐漸下降（圖2）。

圖1　小鼠流感病毒滴鼻感染后一般情況的觀察

圖2　小鼠流感病毒滴鼻感染后體重的變化

圖3　小鼠流感病毒感染后肺臟的病理變化（HE染色10×20）

圖4　小鼠流感病毒感染后小腸的病理變化（HE染色10×20）

2. 2 小鼠流感病毒感染后肺臟、小腸、大腸的病理變化 正常組小鼠肺泡大小較一致，肺泡壁菲薄，支氣管上皮完整，管腔內(nèi)無(wú)分泌物。感染第3天，病毒組小鼠肺組織出現(xiàn)小支氣管炎，中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。第5天病灶范圍進(jìn)一步擴(kuò)大，肺泡壁大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡壁增寬，結(jié)構(gòu)不清，出現(xiàn)水腫。第6天肺組織病變進(jìn)一步加重，幾乎累及全肺，肺泡腔中炎性滲出明顯，出血水腫進(jìn)一步加重，大量上皮脫落，肺泡壁結(jié)構(gòu)不清（圖3）。病毒組小腸黏膜腺體排列紊亂，絨毛粗大、部分脫落，黏膜固有層淋巴細(xì)胞大量浸潤(rùn)（圖4）；大腸黏膜固有層、肌層大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，腺體結(jié)構(gòu)消失、脫落（圖5）。

圖5　小鼠流感病毒感染后大腸的病理變化（HE染色10×20）

2. 3 小鼠流感病毒感染后心臟、肝臟和腎臟組織病變的觀察 HE染色結(jié)果顯示，與正常組相比，病毒組小鼠心臟、肝臟和腎臟組織正常，無(wú)明顯病理改變（圖6、圖7、圖8）。

2. 4 小鼠流感病毒感染后心臟、肝臟和腎臟組織功能檢測(cè) 病毒組小鼠血清AST、血清ALT和血清BUN檢測(cè)結(jié)果與正常組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0. 05），說(shuō)明流感病毒感染小鼠心臟、肝臟和腎臟功能無(wú)明顯異常（圖9、圖10、圖11）。

圖6　小鼠流感病毒感染后心臟的病理變化（HE染色10×20）

圖7　小鼠流感病毒感染后肝臟的病理變化（HE染色10×20）

圖8　小鼠流感病毒感染后腎臟的病理變化（HE染色10×20）

3　討論

腹瀉、惡心是流感最常見的呼吸道外臨床表現(xiàn)。2014年，Wang等在J Exp Med雜志上首次報(bào)道了呼吸道流感病毒感染引起腸道免疫損傷的現(xiàn)象及機(jī)制，從而引起學(xué)術(shù)界廣泛的關(guān)注與興趣。利用流感性肺炎小鼠模型，Wang等發(fā)現(xiàn)，流感病毒感染后，肺源性CCR9＋CD4＋T淋巴細(xì)胞在趨化因子CCL25作用下特異性地向腸道組織遷移。進(jìn)入腸道的CCR9＋CD4＋T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ，改變了腸道微生物的組成（腸道菌群失調(diào)）。腸道微生物的改變明顯刺激了腸道上皮細(xì)胞中IL-15的產(chǎn)生，促使了Th17細(xì)胞在小腸原位的極化，導(dǎo)致了腸道的免疫病理?yè)p傷。Wang等的研究解釋了臨床上流感感染后，除了呼吸道癥狀外，出現(xiàn)最常見的腸外癥狀——胃腸炎樣癥狀（尤其是在兒童中），如上腹疼痛，惡心、嘔吐，腹瀉等的機(jī)制。Wang等提出，腸道菌群構(gòu)成的變化（菌群失調(diào)）介導(dǎo)了呼吸道流感病毒感染誘導(dǎo)的特異性腸道免疫損傷。劉駿等的實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了流感病毒感染后存在腸道菌群的數(shù)量及組成的變化［11］。目前，盡管不同實(shí)驗(yàn)室報(bào)道流感病毒感染后腸道菌群的構(gòu)成及數(shù)量變化不完全一致，但流感病毒肺部感染造成腸道菌群失調(diào)，是被研究者公認(rèn)的。

圖9　小鼠流感病毒滴鼻感染后血清AST指標(biāo)檢測(cè)

圖10　小鼠流感病毒滴鼻感染后血清ALT指標(biāo)檢測(cè)

圖11　小鼠流感病毒滴鼻感染后血清BUN指標(biāo)檢測(cè)

然而，Wang等報(bào)道的流感病毒性肺炎小鼠的腸道損傷主要表現(xiàn)在小腸的炎性病變，對(duì)于腸道菌群主要寄生的大腸的病變，并沒有詳細(xì)的報(bào)道，僅觀察到感染小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度的縮短。基于腸道菌群失調(diào)是流感誘發(fā)腸道損傷的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，而腸道菌群主要寄生在大腸中，我們?cè)诒狙芯恐杏^察了流感病毒感染小鼠模型中肺臟、小腸、大腸、心臟、腎臟、肝臟病變情況，以明確流感病毒感染后是否存在大腸的病變，并進(jìn)一步驗(yàn)證了腸道病變的特異性。研究結(jié)果表明，小鼠流感病毒感染后，除了肺部明顯的炎性病變外，小腸、大腸均有病變，表現(xiàn)為黏膜腺體排列紊亂，絨毛脫落，固有層炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，并伴有腹瀉的表現(xiàn)。通過(guò)進(jìn)一步檢測(cè)了其他臟器的情況，證實(shí)了心臟、腎臟、肝臟均無(wú)病變，說(shuō)明流感病毒感染肺部所誘導(dǎo)的腸道免疫損傷具有特異性。我們的研究進(jìn)一步證實(shí)小鼠流感病毒性肺炎模型中存在特異性腸道病變，病變累及小腸及大腸組織。

“肺與大腸相表里”是近年來(lái)中醫(yī)臟腑理論研究的熱點(diǎn)。張景岳《類經(jīng)·十二經(jīng)病》中云：“大腸與肺為表里，肺主氣，而津液由于氣化，故凡大腸之或?yàn)a或秘，皆津液所生之病，而主在大腸也”。中醫(yī)所講的大腸與西醫(yī)有所不同，相當(dāng)于西醫(yī)解剖學(xué)中的回腸與結(jié)腸上段［12］。肺與大腸不僅在生理上相互聯(lián)系，而且在病理上相互影響，出現(xiàn)肺病及腸或腸病及肺，肺腸之病可以相互傳變，甚至持續(xù)形成惡性循環(huán)［13］。有研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠氣道性哮喘模型中，腹腔注射大黃素具有抵抗肺部炎性反應(yīng)的作用［14］，經(jīng)芒硝刺激大腸后，芒硝組小鼠血清中嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞總數(shù)均明顯減少，血清IgE含量明顯降低，芒硝“從腸論治”可以有效抑制哮喘小鼠氣道炎性反應(yīng)，改善氣道免疫微環(huán)境。人感染流感病毒后，不論是輕癥還是重癥，常伴有腹瀉、腹痛的癥狀；小鼠流感病毒性肺炎模型中，所有感染鼠均有明顯腹瀉，并持續(xù)整個(gè)感染過(guò)程。因此，人的流感感染與小鼠流感病毒性肺炎均具有“肺病及腸”的表現(xiàn)，并且具有特異性，不累及其他臟器。

有趣的是，耶魯大學(xué)Akiko Iwasaki實(shí)驗(yàn)組報(bào)道，肺臟抗流感病毒的免疫應(yīng)答也受到腸道菌群的調(diào)節(jié)。Takeshi Ichinohe等的研究表明，呼吸道流感病毒感染機(jī)體時(shí)，腸道菌群的組成對(duì)調(diào)節(jié)病毒特異性CD4＋和CD8＋T細(xì)胞的產(chǎn)生及抗體反應(yīng)起關(guān)鍵作用，腸道菌群可通過(guò)激活適當(dāng)?shù)难仔砸蜃?，在呼吸道黏膜的調(diào)節(jié)性免疫中發(fā)揮作用；腸道菌群失調(diào)的小鼠肺臟抗流感病毒的免疫應(yīng)答障礙，使肺組織中流感病毒無(wú)法清除，小鼠死亡率增加［15］。因此，正常的腸道菌群在維持肺臟抗病毒免疫中具有至關(guān)重要的作用，腸道菌群失調(diào)小鼠肺臟抗病毒免疫功能受損。由此可見，流感病毒性肺炎小鼠中存在肺腸病變的循環(huán)，是研究“肺與大腸相表里”理論及臨床治法的理想模型。然而，目前此模型在中醫(yī)臟腑理論研究中較少運(yùn)用，我們的研究為此模型在相關(guān)研究中的運(yùn)用以及探討中藥調(diào)節(jié)腸道菌群防治流感的機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

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（2015－08－20收稿 責(zé)任編輯：王明）

中圖分類號(hào)：R228

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A dol：10. 3969／j. issn. 1673－7202. 2016. 02. 028

通信作者：吳瑩（1980. 01—），女，博士，副教授，研究方向：中醫(yī)藥防治病毒性疾病的作用及機(jī)制，E-mail：aqiwuying＠hotmail. com

作者簡(jiǎn)介：張淑靜（1984. 09—），女，碩士，實(shí)驗(yàn)師，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)，E-mail：jingshuzhang＠126. com

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（編號(hào)：81473520）