桑椹首烏補腦顆粒對老年性癡呆模型大鼠血清SOD、MDA含量及腦組織β淀粉樣蛋白表達的影響

張會平 劉 宇 高 睿 趙 月（濟南市中醫(yī)醫(yī)院腫瘤科，濟南，250012）

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桑椹首烏補腦顆粒對老年性癡呆模型大鼠血清SOD、MDA含量及腦組織β淀粉樣蛋白表達的影響

張會平 劉 宇 高 睿 趙 月
（濟南市中醫(yī)醫(yī)院腫瘤科，濟南，250012）

摘要目的：研究桑椹首烏補腦顆粒防治老年性癡呆的作用機制，為指導臨床用藥提供實驗依據(jù)。方法：觀察服用桑椹首烏補腦顆粒后，老年性癡呆模型Wistar大鼠學習記憶功能、血管活性物質(zhì)（SOD、MDA）及腦組織β淀粉樣蛋白含量的變化。結(jié)果：桑椹首烏補腦顆粒能夠促進學習記憶功能的恢復，升高SOD、降低MDA含量，降低海馬區(qū)β淀粉樣蛋白的表達。結(jié)論：桑椹首烏補腦顆粒防治老年性癡呆可能是通過下調(diào)腦組織β淀粉樣蛋白的表達，升高SOD水平、降低MDA含量，減少腦組織損傷有關(guān)。

關(guān)鍵詞老年性癡呆；桑椹首烏補腦顆粒；學習記憶；血管活性物質(zhì)；β淀粉樣蛋白

Effects of Sangshen Shouwu Bunao Granule on the Level of SOD，MDA and the Expresslon of β-amylold ln Dementla Model Rats Serum

Zhang Huiping，Liu Yu，Gao Rui，Zhao Yue
（1 Jinan Municipal Hospital of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250012，China）

Abstract Objectlve：To explore the mechanism of Sangshen Shouwu Bunao granule on preventing dementia and provide data support on clinical treatment. Methods：To detect the changes of SOD，MDA and β-amyloid on Alzheimer Wistar rats after giving Sangshen Shouwu Bunao granule. Results：Sangshen Shouwu Bunao granule can promote the learning and memory capabilities of rats，increase SOD，decrease MDA level and down regulate amyloid β expression. Concluslon：Sangshen Shouwu Bunao granule can prevent Alzheimer's disease. This is possibly because it can reduce β-amyloid in brain tissue，increase levels of SOD，and decrease MDA levels；thus to repair brain tissue damage.

Key Words Alzheimer's disease；Sangshen Shouwu Bunao granule；Learning and memory capability；Vasoactive substances；βamyloid

桑椹首烏補腦顆粒具有補腎填精、益心安神、化瘀祛痰開竅的作用，臨床上用于治療老年性癡呆，為了進一步揭示其對老年性癡呆的藥效學作用與機制，我們通過實驗觀察了桑椹首烏補腦顆粒對老年性癡呆模型Wistar大鼠學習記憶功能、血管活性物質(zhì)（SOD、MDA）及腦組織β淀粉樣蛋白含量的影響?？偨Y(jié)如下。

1　資料與方法

1. 1 受試藥物 桑椹首烏補腦顆粒由江陰天江藥業(yè)有限公司制備，批號：0709310。成人1 d用量：3包／d×3 g／包＝9 g／d；大鼠臨床等效量：9 g× 0. 018／0. 2 kg＝0. 81 g／kg；擬給藥劑量為臨床等效量的2倍、1倍，即1. 62 g／kg和0. 81 g／kg。分別配制成16. 2%和8. 1%的水溶液，以10 mL／kg灌胃給藥。對照組藥：抗腦衰膠囊為吉林本草堂制藥有限公司產(chǎn)品，批號：20070210。大鼠臨床等效量：4. 5 g ×0. 018／0. 2 kg＝0. 41 g／kg；擬給藥劑量為臨床等效量，即0. 41 g／kg。

1. 2 實驗儀器 GB-303型電子天平（上海梅特勒公司產(chǎn)品），YXQ-SG46-280A型壓力蒸汽滅菌器（上海博訊實業(yè)有限公司產(chǎn)品），圓形水池（直徑為1 m，高60 cm）（濟南器具鍛造廠產(chǎn)品），DDL-5低速冷凍離心機（上海安亭科學儀器廠產(chǎn)品），Unic-2100型分光光度計（上海聯(lián)華儀器廠產(chǎn)品）。

1. 3 實驗試劑 SOD試劑盒、MDA試劑盒（南京建成生物工程研究所產(chǎn)品）；β淀粉樣蛋白免疫組化試劑盒（武漢博士德生物有限公司產(chǎn)品）。

1. 4 實驗動物 體重（220±20）g Wistar大鼠60只雄性，由山東大學醫(yī)學院實驗動物中心提供。

2　方法

2. 1 造模 參照文獻方法［1］，大鼠腹腔注射D-半乳糖50 mg／kg，1次／d，連續(xù)6周。造成衰老大鼠模型，其中陰性對照組注射同體積的生理鹽水。于第7周以鵝膏蕈氨酸（Ibotenic，IBO）損傷雙側(cè)meynert核，陰性對照組注射同等量的生理鹽水。

2. 2 分組與給藥 動物分組：大鼠造模后按照體重均衡隨機分為模型對照組，陽性藥對照組，桑椹首烏補腦顆粒高、低兩個劑量組。給藥劑量與途徑：陰性對照組、模型對照組給予純凈水，抗腦衰膠囊0. 41 g／kg組，桑椹首烏補腦顆粒1. 62 g／kg、0. 81 g／kg（簡稱桑椹高劑量組、桑椹低劑量組），配成16. 2% 和8. 1%的水溶液，各組按10 mL／kg，每天給藥，連續(xù)4周。

2. 3 Morris水迷宮試驗 用于測定大鼠學習記憶功能的狀況。參照文獻方法［2］，在大鼠給藥第3周后進行Morris水迷宮訓練，在圓桶的上邊等距離設置東、南、西、北4個標記點，以4個點分別在水面上和水桶底部的投影點，把水面和水桶共分成4個象限。根據(jù)試驗的要求，把平臺設置在東北象限，試驗時水桶內(nèi)加水至40 cm，水的溫度控制于23～25℃，站臺頂端平面比水平面低1～2 cm，每天把動物按東、南、西、北四個入水點放進水池內(nèi)。分別記錄試驗動物的入水時間，同時記錄試驗動物從入水至找到平臺且爬到平臺上面所需的時間，作為逃避潛伏期。最大潛伏期取60 s，如果大鼠在60 s時間內(nèi)沒能找到水池內(nèi)的站臺或者沒能爬到站臺上，把大鼠放到站臺上休息10 s，10 s后把大鼠從站臺上面取下來，休息30～60 s后，再進行下一輪訓練。此訓練1次／d，共6 d，第4周進行測試，并記錄各組大鼠經(jīng)過平臺的次數(shù)，t檢驗進行組間比較。

2. 4 SOD、MDA含量測定［3］觀察對模型大鼠血清SOD、MDA的影響。上述試驗測定完畢后，經(jīng)頸靜脈抽血2 mL。分離上層液（血清）。測定SOD、MDA含量（按試劑盒說明操作）。

2. 5 免疫組化法測定腦組織中β淀粉樣蛋白表達的變化 參照文獻方法［4］，大鼠采血后，迅速斷頭取腦組織，4%多聚甲醛浸泡，免疫組化法制備腦組織中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察，以細胞漿出現(xiàn)鮮艷的棕黃色染色為陽性細胞，計數(shù)每高倍鏡視野下（40×）的陽性細胞數(shù)及光密度值，觀察大腦組織海馬CA1區(qū)β淀粉樣蛋白表達情況。

2. 6 統(tǒng)計學方法 所有數(shù)據(jù)經(jīng)過SPSS 13. 0軟件處理，均以（±s）表示，t檢驗進行組間比較。

3　結(jié)果

3. 1 對Morris水迷宮試驗逃避潛伏期、平臺象限內(nèi)活動的影響 由表1可見：用藥高低劑量組均能明顯縮短潛伏期，通過平臺的次數(shù)明顯高于模型對照組（P＜0. 01，P＜0. 05），且高劑量組優(yōu)于抗腦衰膠囊組。提示本品對模型大鼠Morris水迷宮的空間學習記憶功能有明顯的恢復作用。

表1　對模型大鼠水迷宮平均逃避潛伏期和通過平臺次數(shù)的影響（±s，n＝10）

表1　對模型大鼠水迷宮平均逃避潛伏期和通過平臺次數(shù)的影響（±s，n＝10）

注：與模型對照組比較，*P＜0. 05，**P＜0. 01，與抗腦衰膠囊組比較，△P＜0. 05。

組別　　劑量（g／kg）藥后潛伏期（s）通過平臺次數(shù)（次）陰性對照組　?。?. 40±3. 46**　8. 40±2. 62**模型對照組　?。?8. 39±6. 82　2. 70±1. 97抗腦衰膠囊組　0. 41　 15. 35±5. 16　4. 63±2. 45桑椹高劑量組　1. 62　 10. 75±2. 88**△　7. 13±2. 65**△桑椹低劑量組　0. 81　 12. 72±3. 02*　5. 00±2. 38*

3. 2 對模型大鼠血清SOD、MDA的影響 由表2可見，與模型對照組比較，用藥高、低劑量組血清總SOD活力水平明顯升高（P＜0. 01），高劑量組血清MDA含量明顯降低（P＜0. 05）。

表2　對模型大鼠血清SOD、MDA含量的影響（-±s，n＝10）

表2　對模型大鼠血清SOD、MDA含量的影響（-±s，n＝10）

注：與模型對照組比較，*P＜0. 05，**P＜0. 01。

組別　　劑量（g／kg）SOD （NU／mL）MDA （nmol／L）陰性對照組　　－－　235. 04±46. 73**　3. 25±1. 53**模型對照組　?。?56. 62±36. 85　 6. 58±2. 12抗腦衰膠囊組　0. 41　 195. 25±35. 43*　5. 15±1. 94*桑椹高劑量組　1. 62　 206. 46±31. 58**　4. 36±1. 98*桑椹低劑量組　0. 81　 208. 74±43. 12**4. 77±2. 65

3. 3 對模型大鼠腦組織β淀粉樣蛋白表達的影響

由表3可見，2個桑椹首烏補腦顆粒用藥組不同程度降低腦組織不同部位β淀粉樣蛋白的表達。

表3　對模型大鼠海馬CA1區(qū)β淀粉樣蛋白表達的影響（±s，n＝10）

表3　對模型大鼠海馬CA1區(qū)β淀粉樣蛋白表達的影響（±s，n＝10）

注：與模型對照組比較，*P＜0. 05，**P＜0. 01，與抗腦衰膠囊組比較，△P＜0. 05。

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3. 4 各組大鼠海馬CA1區(qū)β淀粉樣蛋白表達陽性神經(jīng)元表達圖1-3（×400）對照組大鼠海馬CA1區(qū)細胞層次清晰，細胞排列整齊、緊密，有很少的β淀粉樣蛋白陽性神經(jīng)元。模型組海馬CA1區(qū)細胞層次紊亂，細胞排列稀疏、無序，可見大量的β淀粉樣蛋白陽性神經(jīng)元。高劑量組海馬CA1區(qū)細胞層次較清晰，細胞排列較整齊，有少量的陽性神經(jīng)元。

圖1　陰性對照組

圖2　模型對照組

圖3　高劑量組

4　討論

現(xiàn)代醫(yī)學研究證實在腦組織老化過程中，神經(jīng)元細胞膜上的不飽和脂肪酸被氧化而產(chǎn)生大量氧自由基，這些氧自由基能夠損傷細胞膜、細胞器，誘導神經(jīng)元發(fā)生凋亡，導致其功能破壞，認為氧自由基損傷是引起老年性癡呆患者腦損傷的重要機制之一。其中丙二醛（MDA）是脂質(zhì)過氧化反應的降解產(chǎn)物，其含量可以反映機體氧自由基產(chǎn)生和脂質(zhì)過氧化反應程度［5］。MDA會引起蛋白質(zhì)、核酸等生命大分子的交聯(lián)聚合，且具有細胞毒性，因而MDA在體內(nèi)含量增加，能夠加速衰老過程。而超氧化物歧化酶（SOD）是一種源于生命體的活性物質(zhì)，能消除生物體在新陳代謝過程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)。對人體不斷地補充SOD具有抗衰老的特殊效果。SOD檢測對老年性癡呆等老年性患者的診斷和預后監(jiān)測有重要臨床價值［6］。此外，神經(jīng)細胞外老年斑的形成是老年性癡呆病理的主要特征。20世紀80年代Master等發(fā)現(xiàn)老年性癡呆患者腦的老年斑中主要成分是細胞外淀粉樣蛋白（Aβ）的沉積。Aβ能引起線粒體損傷，引起氧化應激和Ca2＋超載，環(huán)氧酶COX的表達和活性下降可以導致細胞色素C的釋放和半胱胺酸天冬氨酸蛋白酶的活化，啟動神經(jīng)元的凋亡過程［7］。崔玉琴等研究證實［8］，老年性癡呆患者血清中Aβ含量升高，表明老年性癡呆患者可引起淀粉樣蛋白異常變化。因此Aβ沉積可導致老年性癡呆的發(fā)病，減少Aβ在腦組織中的沉積可延緩或減輕老年性癡呆的癥狀。

“桑椹首烏補腦顆?！敝饕缮ｉ?、制何首烏、白首烏、生酸棗仁、熟酸棗仁、柏子仁、紅景天、銀杏葉、蟲草粉、黃精、天麻、九節(jié)菖蒲、枸杞子、炙龜甲、淫羊藿、當歸、熟地黃、五味子、丹參等組成，是我國著名老中醫(yī)劉惠民及其嫡孫劉宇先生治療老年性癡呆的經(jīng)驗方，該方針對老年性癡呆本虛標實，腎虛、心腎不交為本，痰阻血瘀為標的病機特點，從腎從心論治，以補腎填精、益心安神、化瘀祛痰開竅法為主要治療方法。現(xiàn)代藥理研究證實，方中多種中藥提取物具有一定清除自由基、改善神經(jīng)系統(tǒng)損傷、延緩衰老、增強記憶力及改善睡眠等作用。張文娜等［9］通過研究發(fā)現(xiàn)，桑椹多糖具有一定清除自由基活性的作用。含二苯乙烯苷（TSG）70%的何首烏提取物、蒽醌類和水提取物，能改善高膽固醇血癥模型大鼠的學習記憶障礙［10］，具有益智［11］和抗抑郁作用［12］。陳金峰等［13］通過研究發(fā)現(xiàn)，酸棗仁-五味子藥對醇水雙提物中、高劑量均具有一定的鎮(zhèn)靜催眠作用。賀改英等［14］研究表明，銀杏葉提取物（GBE50）可通過調(diào)節(jié)衰老大鼠前額葉皮層和海馬IL-1β、IL-6及TNF-α以及恢復海馬神經(jīng)膠質(zhì)細胞超微結(jié)構(gòu)破壞，以抑制神經(jīng)炎性反應，從而改善神經(jīng)系統(tǒng)損傷。李弋等［15］通過研究從神經(jīng)系統(tǒng)的病理學角度，證實了黃精對AD大鼠海馬組織CAI區(qū)的形態(tài)學有顯著的改善作用。

本研究證實：桑椹首烏補腦顆粒能夠促進衰老模型大鼠學習記憶功能的恢復，升高SOD、降低MDA含量，下調(diào)腦組織β淀粉樣蛋白的表達，減少自由基的生成，加速衰老模型大鼠腦功能的恢復。由此證明，中藥制劑桑椹首烏補腦顆粒通過升高SOD、降低MDA含量，下調(diào)腦組織β淀粉樣蛋白的表達，減少自由基的生成，降低其損傷作用，從而發(fā)揮抗衰老作用。

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（2015－01－13收稿 責任編輯：張文婷）

世界中醫(yī)藥學會聯(lián)合會絡病專業(yè)委員會中俄絡病學術(shù)論壇通知（第一輪）（2016·莫斯科）

為按照中醫(yī)學科自身發(fā)展規(guī)律，推動中醫(yī)絡病理論發(fā)展，促進其基礎與臨床應用研究，增進世界各國（地區(qū)）從事絡病學研究專家學者的交流與合作，加強世界各國（地區(qū)）絡病研究學學術(shù)交流，提高絡病相關(guān)重大疾病及疑難疾病的中醫(yī)藥防治水平，加快中醫(yī)藥現(xiàn)代化和國際化的進程。世界中醫(yī)藥學會聯(lián)合會絡病專業(yè)委員會擬于2016年04月19日－24日在俄羅斯莫斯科舉辦世界中醫(yī)藥學會聯(lián)合會絡病專業(yè)委員會中俄絡病學術(shù)論壇，本次會議擬對心血管病、腦血管病的中醫(yī)藥特色療法為主題展開研討和交流，并介紹近年來絡病研究取得的成果。本次會議將以主題發(fā)言、大會交流等形式進行研討，具體內(nèi)容如下：

一、會議主題：絡病理論傳承創(chuàng)新國際化

二、參會對象：世界中聯(lián)絡病專業(yè)委員會會員及從事絡病理論研究的有關(guān)專家

三、會議須知：1.會議時間：2016年04月19日至24日2016年04月19日報到20－23日會議、醫(yī)院參觀訪問交流；2.會議地點：莫斯科。

四、會議籌備：主辦單位：世界中醫(yī)藥學會聯(lián)合會絡病專業(yè)委員會；承辦單位：俄羅斯圣彼得堡中醫(yī)醫(yī)院；聯(lián)系方式：E－mail：luobinglab＠sina. com

五、學分登記與發(fā)放：本次會議將授予國家級繼續(xù)教育學分二類證書。

世界中醫(yī)藥學會聯(lián)合會絡病專業(yè)委員會

2016年2月15日

中圖分類號：R285. 5

文獻標識碼：A dol：10. 3969／j. issn. 1673－7202. 2016. 02. 029

通信作者：張會平（1977. 10—），女，碩士，主治中醫(yī)師，研究方向：主要從事老年病及腫瘤內(nèi)科疾病中醫(yī)研究，E-mail：zhpzzz26＠163. com

基金項目：濟南市2007年科學技術(shù)發(fā)展計劃第五批項目（編號：200705089-1）