武蕊娟譚 鐳詹 雁阮 佳徐 超

（1成都中醫(yī)藥大學(xué)，成都，610075；2四川省中醫(yī)藥科學(xué)院，成都，610041）

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馬甲子葉提取物抗腫瘤活性部位的篩選

武蕊娟1，2譚 鐳2詹 雁2阮 佳2徐 超2

（1成都中醫(yī)藥大學(xué)，成都，610075；2四川省中醫(yī)藥科學(xué)院，成都，610041）

摘要目的：從藥用植物馬甲子葉醇提物中分離篩選具有抗腫瘤作用的活性組分。方法：采用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取馬甲子葉醇提物，并將這三個(gè)萃取部位進(jìn)行體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)，再把篩選得到的具有較好抗腫瘤活性的部位進(jìn)行硅膠柱層析分離，并采用MTT法對(duì)分離得到的組分進(jìn)行體外抗腫瘤活性比較。結(jié)果：通過體外抗HepG-2細(xì)胞和HeLa細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，乙酸乙酯萃取部位具有較好抗腫瘤活性。通過硅膠柱分離，獲得5個(gè)組分，通過MTT實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)這5個(gè)組分中，石油醚：乙酸乙酯為1∶1和1∶2洗脫所得到的兩個(gè)組分具有明顯的體外抗腫瘤活性，其中石油醚：乙酸乙酯為1∶2的洗脫具有更好的殺傷作用，對(duì)HepG-2細(xì)胞和HeLa細(xì)胞的IC50分別為45. 79，13. 16 μg／mL。結(jié)論：從馬甲子葉醇提物乙酸乙酯部位中分離得到2種具有抗腫瘤作用的活性組分，為進(jìn)一步分離抗腫瘤活性成分提供一定的指導(dǎo)作用。

關(guān)鍵詞馬甲子葉提取物；抗腫瘤活性；溶劑法和硅膠柱分離法；MTT；活性組分

Study of Effectlve Antl-tumor Actlvlty Parts from Leaves of Pallurus ramoslsslmus

Wu Ruijuan1，2，Tan Lei2，Zhan Yan2，Ruan Jia2，Xu Chaoqun2
（1 Chengdu University of Traditional Chinese Medicine，Chengdu 610075，China；2 Sichuan Academy of Chinese Medicine Sciences，Chengdu 610041，China）

Abstract Objectlve：To separate and select anti-tumor activity part from the leaves of Paliurus ramosissimus. Methods：Extracts from the leaves of Paliurus ramosissimus were extracted with petroleum ether，ethyl acetate and n-butyl alcohol respectively. In vitro anti-tumor experiments were performed at the three extract sites. The optimal site with best anti-tumor activity then was screened by silica gel column chromatography，and MTT assay was used for the comparison of components obtained for antitumor activity. Results：In vitro anti HepG-2 cells and HeLa cell experiments showed that ethyl acetate fraction extracts had good antitumor activity. Separated by a silica gel column，five components were collected by MTT assay，which found that when the ratio of petroleum ether：ethyl acetate were 1∶1 and 1∶2，both eluted fraction group had in vitro anti-tumor activity and when the ration of the elution of petroleum ether to ethyl acetate was 1∶2 the anti-tumor function was better. IC50of HepG-2 cells and HeLa cells were 45. 79 and 13. 16 μg·mL-1 respectively. Concluslon：Two kinds of active ingredients with anti-tumor effect were separated from the leaves of Paliurus ramosissimus by ethyl alcohol，which may provide guidance for the further separation of anti-tumor active ingredient.

Key Words Extracts from the leaves of Paliurus ramosissimus；Anti-tumor effect；Solvent and silica gel column separation；MTT；Active ingredient

馬甲子Paliurus ramosissimus（Lour.）Poir.系鼠李科馬甲子屬植物，又名鐵籬笆、銅錢樹。在我國(guó)長(zhǎng)江流域以南各省均有分布，多生于丘陵林邊灌叢中或荒山草地上。其根、果實(shí)、葉均可供藥用，根能除寒活血，解熱消腫，治療跌打損傷及心腹疼痛；果實(shí)能化瘀止血，活血止痛，臺(tái)灣地區(qū)民間用于治療牙痛和腹痛［1-2］；葉能治療無名腫痛，民間多用于治癰瘡潰瘍等。也有報(bào)道證實(shí)馬甲子醇提物具有鎮(zhèn)咳祛痰的功效［3-4］。經(jīng)課題組的前期研究證實(shí)其葉也具有抗腫瘤方面的作用且療效較好。此次實(shí)驗(yàn)主要從馬甲子葉醇提物中分離出具有抗腫瘤作用的活性組分，對(duì)其中活性成分進(jìn)行活性追蹤并分離純化，為闡明馬甲子的抗腫瘤作用機(jī)制奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1. 1 藥材 馬甲子鮮葉，于2014年5月7日采于四川省成都市牧馬山，經(jīng)四川省中醫(yī)藥科學(xué)院舒光明研究員鑒定為鼠李科馬甲子屬植物馬甲子Paliurus ramosissimus（Lour.）Poir的鮮葉。

1. 2 藥品與試劑 DMEM／HIGH GLUCOSE培養(yǎng)基，胎牛血清（Hyclone，美國(guó)），3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT），青霉素、鏈霉素（Amresco，美國(guó)），胰蛋白酶（Gibco，美國(guó)），其他試劑均為分析純。人肝癌細(xì)胞HepG-2、人宮頸癌細(xì)胞HeLa（四川大學(xué)華西藥學(xué)院靶向藥物及釋藥系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供），96孔板。

1. 3 儀器 Thermo Forma系列CO2培養(yǎng)箱（Sanyo，日本）；Model-550型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（Bio-Rad，美國(guó)）；SW-CJ-2D型超凈工作臺(tái)（蘇州市凈化設(shè)備總廠）；倒置顯微鏡（型號(hào)：Fx-35DX，Nikon）；離心機(jī)（型號(hào)：TGL-16G，上海醫(yī)用分析儀器廠）。

2　方法［5-10］

2. 1 溶劑法和硅膠柱分離法提取不同組分 稱取馬甲子鮮葉適量，粉碎，用10倍量95%乙醇浸漬提取2 d，過濾，減壓濃縮，濃縮液冷凍干燥得馬甲子葉醇提物。馬甲子葉醇提物依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分別得到以上3個(gè)部位及水溶液層，將各溶劑揮干，備用。將以上萃取得到的乙酸乙酯部位采用硅膠柱色譜分離，分別用石油醚：乙酸乙酯為15∶1，5∶1，3∶1，1∶1和1∶2配制的不同極性溶劑洗脫得到5個(gè)組分（Pl，P2，P3，P4和P5），蒸去溶劑，備用。

2. 2 MTT法測(cè)細(xì)胞增殖的抑制率 樣品配制：馬甲子各萃取部位和乙酸乙酯部位不同組分分別用異丙醇超聲溶解，1 000 r／min離心2次，0. 22 μm微孔濾膜過濾除菌，用培養(yǎng)基稀釋至所需濃度，備用。

按文獻(xiàn)方法［11-12］復(fù)蘇兩種細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG-2、HeLa細(xì)胞，均制備成濃度為6. 25×104個(gè)／mL的單細(xì)胞懸液，接種于96孔板，每孔160 L（即每孔接種1. 0×104個(gè)細(xì)胞），37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度的藥物，設(shè)陽(yáng)性對(duì)照0. 025 mg／mL 5-Fu注射液、陰性對(duì)照、空白對(duì)照組，復(fù)孔4個(gè)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。吸去上清液，用含0. 5 mg／mL MTT的無血清DMEM孵育3 h后，棄上清液，每孔加入150 μL DMSO，在酶標(biāo)儀上于490 nm處檢測(cè)各吸光度OD值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。按下列公式計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率：

抑制率＝1-（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白對(duì)照組OD值）／（陰性對(duì)照組OD值-空白對(duì)照組OD值）× 100%。

表1　馬甲子醇提物不同萃取部位作用于HepG-2細(xì)胞24 h的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2　馬甲子醇提物不同萃取部位作用于HeLa細(xì)胞24 h的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3　馬甲子醇提物乙酸乙酯部位不同組分作用于HepG-2細(xì)胞24 h的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表4　馬甲子醇提物乙酸乙酯部位不同組分作用于HeLa細(xì)胞24 h的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3　結(jié)果

3. 1 不同極性部位對(duì)HepG-2細(xì)胞、Hela細(xì)胞增殖的抑制作用 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，馬甲子石油醚和乙酸乙酯部位對(duì)HepG-2和HeLa細(xì)胞的增殖有較強(qiáng)的抑制作用，正丁醇及水溶液部分則無明顯作用。石油醚部位作用于HepG-2和HeLa細(xì)胞24 h的IC50分別為223. 17，180. 80 g／mL；乙酸乙酯部位作用于HepG-2和HeLa細(xì)胞24 h的IC50分別為138. 29，125. 11 g／mL。2個(gè)部位對(duì)HepG-2和Hela細(xì)胞增殖抑制率有明顯的量效關(guān)系。水提物部位對(duì)2種細(xì)胞體外增值均無明顯的抑制作用，正丁醇部位在最大濃度400 g／mL才有抑制作用。

3. 2 不同組分對(duì)HepG-2細(xì)胞、HeLa細(xì)胞增殖的抑制作用 乙酸乙酯部位采用硅膠柱層析分離得到的5個(gè)組分中，P4和P5 2個(gè)組分對(duì)HepG-2、Hela細(xì)胞增殖具有顯著的抑制作用。其中P4組分抑制HepG-2和HeLa細(xì)胞24 h的IC50分別為62. 91，45. 79 g／mL。P5組分抑制HepG-細(xì)胞和HeLa細(xì)胞24 h的IC50分別為26. 11，13. 16 g／mL。

圖1　不同組分對(duì)HepG-2和HeLa細(xì)胞增殖的抑制曲線

4　討論

本實(shí)驗(yàn)以人肝癌細(xì)胞HepG-2和人子宮頸癌細(xì)胞HeLa的體外抗腫瘤活性為指標(biāo)，用不同極性溶劑對(duì)馬甲子醇提物進(jìn)行萃取分離得到的4個(gè)溶劑部位，并對(duì)4個(gè)溶劑部位采用MTT法測(cè)定抗腫瘤活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，石油醚和乙酸乙酯部位的抗腫瘤活性較明顯，其中乙酸乙酯部位的抗腫瘤活性最強(qiáng)。故將乙酸乙酯部位過硅膠柱層析分離，洗脫得到5個(gè)組分，得到活性較好的P4和P5組分，為馬甲子分離得到有效抗腫瘤活性單體提供了有效的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

由于中藥活性成份多而復(fù)雜，并且成份之間有可能存在相互作用，作用機(jī)制也各有不同。目前研究表明，應(yīng)用中藥和其中的有效成分預(yù)防和治療腫瘤可以達(dá)到更好的效果。目前對(duì)馬甲子的研究主要集中在其根、莖、果實(shí)中化學(xué)成分的分離鑒定，而馬甲子葉中化學(xué)成分的研究還未見報(bào)道［13-15］，課題組擬對(duì)馬甲子的抗腫瘤藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及其作用機(jī)制進(jìn)行深入研究，為進(jìn)一步將馬甲子開發(fā)成一個(gè)新的抗腫瘤藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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（2015－06－16收稿 責(zé)任編輯：張文婷）

中圖分類號(hào)：R284. 2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A dol：10. 3969／j. issn. 1673－7202. 2016. 02. 038

通信作者：徐超群（1963. 09—），女，博士，研究員，研究方向：中藥新藥與新型給藥系統(tǒng)研究，E-mail：chaoqun_xu＠sina. com

作者簡(jiǎn)介：武蕊娟（1989. 08—），女，碩士在讀，研究方向：中藥新藥與新型給藥系統(tǒng)研究，E-mail：344354319＠qq. com

基金項(xiàng)目：四川省科技支撐計(jì)劃（編號(hào)：15ZC1978）；四川省科研院所科技成果轉(zhuǎn)化資金項(xiàng)目（編號(hào)：14010139）；四川省公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)專項(xiàng)