基因工程中的黏性末端和平末端

山西 梁曉勵(lì) 蔚捷宇

基因工程中的黏性末端和平末端

山西 梁曉勵(lì) 蔚捷宇

基因工程的操作中用到三種工具，其中有一種能準(zhǔn)確切割DNA的手術(shù)刀——限制性核酸內(nèi)切酶，經(jīng)過(guò)限制性核酸內(nèi)切酶切割后的DNA片段末端有的是黏性末端有的是平末端。

什么是黏性末端或平末端呢？

某種限制性核酸內(nèi)切酶能夠特異性識(shí)別雙鏈DNA分子特定核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開(kāi)。當(dāng)限制性核酸內(nèi)切酶在它識(shí)別序列的中心軸線兩側(cè)將DNA的兩條鏈分別切開(kāi)時(shí)，產(chǎn)生的是黏性末端，而當(dāng)限制性核酸內(nèi)切酶在它識(shí)別序列的中心軸線處切開(kāi)時(shí)，產(chǎn)生的是平末端。如下圖所示：

在基因工程中，經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶處理后暴露出的黏性末端或平末端，在DNA連接酶的作用下可連接起來(lái)。末端之間是如何連接的呢？

一、黏性末端之間的連接

兩個(gè)黏性末端之間相連，前提條件是末端的含氮堿基之間必須依次遵循堿基互補(bǔ)配對(duì)原則。

【例1】假如載體被切割后，得到的黏性末端序列為，則能與該載體連接的目的基因分子的黏性末端是（ ）

【解析】選項(xiàng)A的黏性末端從左到右依次是TTAA，而題干中的黏性末端從左到右依次是AATT，它們的黏性末端的堿基從左到右依次都遵循堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，符合黏性末端相連的條件，A正確；選項(xiàng)B的黏性末端從左到右依次是ATCC，而題干中的黏性末端從左到右依次是AATT，它們的黏性末端的堿基從左到右不能依次都遵循堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，不符合黏性末端相連的條件，B錯(cuò)誤；同理，C、D錯(cuò)誤。

【答案】A

【例2】限制性核酸內(nèi)切酶能識(shí)別雙鏈DNA分子的某種特定的核苷酸序列，并在特定部位切割DNA分子上核苷酸之間的磷酸二酯鍵。下圖為四種限制性核酸內(nèi)切酶BamH Ⅰ，EcoR Ⅰ，Hind Ⅲ以及Bgl Ⅱ的識(shí)別序列。箭頭表示每一種__限制性核酸內(nèi)切酶的特定切割部位，其中哪兩種限制-酶所切割出來(lái)的DNA片段末端可以互補(bǔ)黏合？其正確的末端互補(bǔ)序列為何？ （____）

A.BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ；末端互補(bǔ)序列—AATT—

B.BamH Ⅰ和Hind Ⅲ；末端互補(bǔ)序列—GATC—

C.EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ；末端互補(bǔ)序列—AATT—

D.BamH Ⅰ和Bgl Ⅱ；末端互補(bǔ)序列—GATC—

【解析】BamH I識(shí)別及切割的部位和 BglⅡ識(shí)別及切割的部位切割后的黏性末端都是GATC及CTAG，正好依次互補(bǔ)配對(duì)，D正確。而EcoR I識(shí)別及切割的部位切割后的黏性末端是AATT 及TTAA，與BamH I識(shí)別及切割的部位切割后的黏性末端GATC及CTAG不能互補(bǔ)配對(duì)，A錯(cuò)誤。同理，B和C錯(cuò)誤。

【答案】D

二、平末端之間的連接

兩個(gè)平末端之間是可以任意連接的。例如：

三、黏性末端與平末端之間的連接

如何將一個(gè)黏性末端與一個(gè)平末端相連，需要將平末端修飾成一個(gè)與該黏性末端互補(bǔ)配對(duì)的黏性末端，方可連接。例如：

四、基因工程末端之間連接的應(yīng)用實(shí)例

【例3】下圖為基因工程培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因馬鈴薯的過(guò)程及相關(guān)限制性內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)，識(shí)圖并分析下列問(wèn)題：

轉(zhuǎn)基因操作流程圖

幾種限制酶識(shí)別序列及切割位點(diǎn)表：

__限制___酶___Alu______Ⅰ_____E_____ coR_Ⅰ____Pst______Ⅰ_____________Sma_Ⅰ切割位點(diǎn)↓AGCT TTGA _____________________↑↓GAATTC CTTAAG↑____↓CTGCAG GACGTC↑___________↓CCCGGG GGGCCC↑____

若對(duì)符合設(shè)計(jì)要求的重組質(zhì)粒T進(jìn)行酶切。假設(shè)所用的酶可將其識(shí)別位點(diǎn)完全切開(kāi)，請(qǐng)根據(jù)圖對(duì)以下酶切結(jié)果作出判斷。

①采用EcoRⅠ和PstⅠ酶切，得到_____種DNA片斷。

②采用EcoRⅠ和SmaⅠ酶切，得到_____種DNA片斷。

【解析】做此題的關(guān)鍵是識(shí)圖。從表可看出，酶AluⅠ和SmaⅠ切出的是平末端，酶EcoRⅠ和PstⅠ切出的是黏性末端，從流程圖中看，對(duì)含有抗原基因的DNA片斷用EcoRⅠ和AluⅠ切割，切出的末端X為黏性末端，Y為平末端，載體質(zhì)粒上有三個(gè)酶切位點(diǎn)，但從圖②看出沒(méi)有用到酶PstⅠ，只用到了酶SmaⅠ和EcoRⅠ，切出的末端M為黏性末端，N為平末端，當(dāng)進(jìn)行基因表達(dá)載體構(gòu)建形成重組質(zhì)粒時(shí)，由圖可看出，末端N和Y相連接，這是由于平末端之間可以任意連接，但連接后形成的核苷酸序列，不是酶AluⅠ識(shí)別和切割的序列，也不是酶SmaⅠ識(shí)別和切割的序列。末端X和M相連，而這兩個(gè)末端都是酶EcoRⅠ切割的，符合黏性末端相連接的條件，連接成的核苷酸序列為，此序列仍為酶EcoRⅠ識(shí)別和切割的位點(diǎn)。①當(dāng)用酶EcoRⅠ和PstⅠ進(jìn)行酶切時(shí)，EcoRⅠ的酶切位點(diǎn)重新形成，PstⅠ的酶切位點(diǎn)一直保留，所以可從兩個(gè)位置切割，切成兩段。②采用EcoRⅠ和SmaⅠ進(jìn)行酶切時(shí)，EcoRⅠ的酶切位點(diǎn)重新形成，SmaⅠ的酶切位點(diǎn)在重組時(shí)消失了，所以只能在一個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行切割，切成一段。

【答案】①2 ②1

【例4】下圖表示構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)的某種質(zhì)粒與目的基因。已知限制酶Ⅰ的識(shí)別序列和切點(diǎn)是，限制酶Ⅱ的識(shí)別序列和切點(diǎn)是

據(jù)圖分析，當(dāng)進(jìn)行基因表達(dá)載體構(gòu)建時(shí)，分別用哪種酶切割質(zhì)粒和目的基因？_______________________。這樣做的理由是什么？____________________________。

【解析】此題意在考查學(xué)生分析問(wèn)題的能力及讀圖能力。從題干可看出，限制酶Ⅱ識(shí)別的序列中含有限制酶Ⅰ識(shí)別的序列和切割位點(diǎn)，因此用限制酶Ⅰ也可將限制酶Ⅱ識(shí)別的序列識(shí)別并切割。而限制酶Ⅱ不能識(shí)別限制酶Ⅰ識(shí)別的序列，所以用限制酶Ⅱ切割質(zhì)粒只能切割一個(gè)標(biāo)記基因，用限制酶Ⅰ切割目的基因可將兩端都切割。

【答案】用限制酶Ⅱ切割質(zhì)粒，用限制酶Ⅰ切割目的基因。用限制酶Ⅱ切割質(zhì)粒只能切割一個(gè)標(biāo)記基因，用限制酶Ⅰ切割目的基因可將兩端都切割。

（作者單位：山西省忻州師范學(xué)院附屬中學(xué)）