肉及肉制品中動物源性成分核酸檢測方法研究進展

石盼盼，李旭，吳昊，陳蕾（河南省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗院，河南鄭州450000）

肉及肉制品中動物源性成分核酸檢測方法研究進展

石盼盼，李旭，吳昊，陳蕾
（河南省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗院，河南鄭州450000）

民以食為天，食以安為先。肉類為人類的生命活動提供了豐富的蛋白質(zhì)、脂肪和B族維生素等，是人們生活的重要食品。但在利益的驅(qū)動下肉制品行業(yè)內(nèi)摻假事件時有發(fā)生，嚴重侵害了消費者權(quán)益，并造成了不良的經(jīng)濟和社會影響。因此加強研究肉類產(chǎn)品動物源性成分的檢測技術(shù)，廣泛開展肉及肉制品中動物源性成分的檢驗意義重大。本文綜合論述了目前已有的肉及肉制品中動物源性成分的核酸檢測技術(shù)，并對有應(yīng)用前景的新技術(shù)做了簡要介紹。

肉及肉制品；動物源性成分核酸檢測技術(shù)；聚合酶鏈式反應(yīng)

隨著人們生活水平的提高，飲食中肉類的比例逐年增加［1］，但肉制品行業(yè)內(nèi)用低價肉偽造高價肉，用非食用肉偽裝食用肉的現(xiàn)象時有發(fā)生。隨著人們安全意識的提高和食品監(jiān)管體系的完善，市場對肉及肉制品的動物源性成分的檢測要求也越來越高。近年來分子生物學技術(shù)飛速發(fā)展，動物源性成分的各種檢測技術(shù)相繼涌現(xiàn)，能夠快速、精準、靈敏地鑒定各類肉及肉制品的真實屬性。

核酸因其作為遺傳物質(zhì)的優(yōu)良特性，可準確鑒定肉及肉制品的物種源性。與依靠肌肉紋理辨別和依靠蛋白質(zhì)的免疫反應(yīng)或者電泳技術(shù)鑒別相比，此類方法優(yōu)勢明顯［2-3］。我們把目前肉及肉制品中動物源性成分的核酸檢測方法分為三類：一是以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的檢驗方法，通過PCR擴增物種特異性條帶結(jié)合相應(yīng)的核酸檢測技術(shù)來判斷動物源性；二是依賴于分子雜交技術(shù)的檢測方法，通過物種特異性探針與樣品核酸分子雜交來鑒定，PCR擴增也是該法的基礎(chǔ)；三是以不同于PCR的核酸擴增技術(shù)為基礎(chǔ)的檢測新方法。本文綜合論述了目前已有的肉及肉制品中動物源性成分的核酸檢測技術(shù)，并對有應(yīng)用前景的新技術(shù)做了簡要探討。

1　基于PCR技術(shù)的檢測方法

1.1PCR電泳法

PCR電泳法檢測動物源性成分的原理是樣品DNA用物種特異性引物擴增，產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳分離，凝膠成相系統(tǒng)檢測，然后通過與陽性條帶比對是否有目的條帶的擴增，來檢測樣品的動物源性。該方法檢驗肉制品動物源性成分最常用是利用線粒體細胞色素氧化酶b亞基（Cyt b）基因核苷酸序列在畜禽各種物間的特異性進行的。我國出入境檢驗檢疫行業(yè)標準SN/T2978-2011《動物源性產(chǎn)品中雞源性成分PCR檢測方法》即采用此方法。也有學者以物種的其他特異性基因為檢測對象進行研究，康文欣根據(jù)鴨特異性細胞色素C氧化酶III基因序列［4］設(shè)計引物，用PCR電泳法檢測市售肉卷中鴨源性成分，特異性靈敏性良好，能夠達到實際檢測需求。

PCR電泳法是動物源性成分核酸檢測的基礎(chǔ)技術(shù)，它通常還需要對擴增產(chǎn)物回收經(jīng)過核酸測序比對或者借助熒光定量檢測才能準確判斷，檢驗步驟多，過程比較耗時，已經(jīng)逐漸或被其他新技術(shù)取代。但熒光定量等其他技術(shù)檢測靈敏度高易造成假陽性，PCR電泳法常在其他檢測技術(shù)出現(xiàn)假陽性假陰性無法判斷時，作為補充驗證的作用存在。所以對于復雜的加工肉制品動物性成分檢測，實際工作中此法不可缺少。

1.2多重PCR法

多重PCR法是以PCR電泳法為基礎(chǔ)，在同一PCR反應(yīng)體系內(nèi)加上兩對以上的引物，可以針對多個DNA模板，或同一模板的不同區(qū)域，同時擴增出多個核酸片段的PCR反應(yīng)，又稱多重引物PCR。

馮海永等建立了羊肉產(chǎn)品中豬、牛、綿羊、山羊、雞、馬和牦牛動物源性成分鑒別的七重PCR檢測技術(shù)體系［5］。他設(shè)計七對特異性引物經(jīng)PCR擴增后，采用常規(guī)的瓊脂糖凝膠電泳分離相互差異在41 bp以上的多重PCR擴增產(chǎn)物，實現(xiàn)了對7個物種的快速準確鑒別。

多重PCR成本低效率高。但引物的設(shè)計要考慮到不能有互補序列，否則會因交叉反應(yīng)使有些條帶無法擴增；引物的濃度和延伸時間等參數(shù)都需要優(yōu)化，技術(shù)要求高。此技術(shù)可致力于開發(fā)檢測試劑盒。

1.3熒光定量PCR法

熒光定量PCR技術(shù)是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，根據(jù)熒光信號的積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后結(jié)合軟件實現(xiàn)對未知模定性定量分析的實驗方法。在肉制品動物源性成分檢驗中，多用到TaqMan熒光探針檢測法［6］。

王穎［7］等以豬線粒體12S rRNA基因序列為靶位點設(shè)計引物和探針，進行熒光定量PCR擴增，建立了畜肉食品中豬源性成分檢測體系，該方法快速準確特異性強，靈敏度高。

熒光定量PCR檢測的巨大優(yōu)勢是實現(xiàn)了對樣品DNA的定量檢測，并且簡化了實驗步驟，在一次PCR中就可以完成對目標片段的定性和定量檢測，省去凝膠電泳和掃描過程。此法是目前肉制品動物源性成分檢測應(yīng)用的熱門技術(shù)。但其靈敏性高，容易造成假陽性。對實驗條件和檢驗人員的要求也非常高。

1.4多重實時熒光PCR法

結(jié)合多重PCR與熒光定量的優(yōu)勢，在多重PCR體系中加入各種動物源性的熒光探針，根據(jù)實時熒光PCR的擴增結(jié)果進行檢測的技術(shù)。

我國出入境檢驗檢疫行業(yè)標準［8］中動物產(chǎn)品中牛、山羊和綿羊源性成分檢測就采用三重實時熒光PCR法，可以在一次PCR反應(yīng)中實現(xiàn)對樣品中三種動物源性成分的定性檢驗。

多重熒光PCR把基于PCR檢測的高效優(yōu)勢發(fā)揮到極致，可以在一小時左右的時間內(nèi)實現(xiàn)對多個樣品的多種動物源性實現(xiàn)準確的定性分析。但此法會出現(xiàn)某一或者幾個基因擴增效率低，會導致定量檢測不準確，甚至定性也無法判定的情況。所以條件的優(yōu)化非常重要。

1.5限制性片段長度多態(tài)性PCR法（restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）

PCR-RFLP法是用各物種通用引物進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)同一限制性內(nèi)切酶酶切后不同物種可產(chǎn)生不同長度的酶切片段，依據(jù)酶切結(jié)果鑒定樣品中相關(guān)肉源性成分的方法。

馮海永等設(shè)計出羊（綿羊、山羊）和鴨的通用引物，擴增出472 bp的片段，分別使用限制性內(nèi)切酶Spe I 和Bsu36I對羊和鴨的PCR產(chǎn)物進行酶切，羊（綿羊、山羊）的特異性片段為213 bp和259 bp、鴨的為95 bp 和377 bp［9］。

對于成分復雜的樣品PCR-RFLP法易產(chǎn)生大量的酶切片段使結(jié)果難以分析，更適合選用PCR-TRFLP（末端限制性片段長度多態(tài)性）檢測方法。PCR-TRFLP 與PCR-RFLP只分析酶切后末端片段的長度多態(tài)性使結(jié)果簡化，再結(jié)合毛細管電泳分析結(jié)果更加準確直觀。田金輝［10］等通過UP-PCR-TRFLP方法鑒定生鮮肉中的牛羊肉成分，分別設(shè)計不同熒光標記的上下游引物，PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)酶切后，在測序儀上用毛細管電泳檢測帶熒光的末端片段即可鑒定樣品中的牛羊肉成分。

此法較單純的PCR電泳法省時省力，并且簡便可靠。但對于多成分樣品會出現(xiàn)一定范圍內(nèi)使用的情況，如李通等用此法檢測摻雜豬肉的牛羊肉時發(fā)現(xiàn)，只有當豬肉摻雜比例大于30%時才有明顯的酶切條帶，對于一部分混合肉制品并不適用［11］。所以設(shè)計合適的通用引物及選擇合適的酶切位點對于此法非常重要。

1.6隨機擴增多態(tài)性PCR法 （Random Amplified Polymorphic DNA PCR，RAPD-PCR）

RAPD-PCR技術(shù)是用一系列（通常數(shù)百個）不同的隨機排列堿基序列的寡核苷酸單鏈（一般為10個bp）作為引物，對所研究的基因組DNA進行單引物擴增，最后將擴增出的條帶進行膠回收測序比對，來確定該擴增產(chǎn)物的基因類型。

王昱等用隨機擴增多態(tài)性PCR法，擴增未知肉品DNA，對陽性產(chǎn)物回收、克隆并測序比對后，發(fā)現(xiàn)是火狐基因序列，根據(jù)數(shù)據(jù)庫火狐序列信息設(shè)計特異性引物，熒光定量PCR法再次檢測該肉品DNA，結(jié)果表明樣品中含有火狐肉［12］。

相比與特異性引物探針法只能鑒定已知的肉品種類，此法是鑒定未知來源肉制品肉品種類的有效手段，對于不知道種屬的肉品不會出現(xiàn)漏檢或者無法檢出的情況。但是，RAPD技術(shù)易受到模板的質(zhì)量，引物序列等各種因素的影響導致重復性差，并且其檢測過程復雜，技術(shù)要求高，最終結(jié)果必須結(jié)合常規(guī)方法再鑒定。

1.7PCR-DHPLC法

DHPLC（denaturing high performance liquid chromatography）變性高效液相色譜，是含有專門DNA分離柱的液相色譜系統(tǒng)?？梢詫崿F(xiàn)對不同大小DNA片段的分離。PCR-DHPLC法檢測肉及肉制品中動物源性成分時，樣品DNA經(jīng)物種特異性引物PCR擴增后，產(chǎn)物用DHPLC按照不同堿基長度洗脫分離，比較目標色譜峰的有無來判斷是否含有該種動物源性成分。

王秋燕［13］等建立了肉及肉制品中牛源性成分的PCR-DHPLC檢測體系，得到了牛源性成分PCR-DHPLC的特征峰型圖，可用于檢測樣品中的牛源性成分，并具有良好的特異性和靈敏度。

PCR-DHPLC技術(shù)實現(xiàn)了動物源性成分檢測的高通量和自動化。但該技術(shù)對PCR擴增的嚴謹性、特異性要求較高。PCR產(chǎn)量不足特異性差時，DHPLC易形成異常峰型，色譜圖常不易判斷。

1.8微衛(wèi)星標記檢測法

微衛(wèi)星DNA是一段包含單拷貝DNA側(cè)翼的簡單重復模塊串聯(lián)組成的長達幾十個核苷酸的重復序列。微衛(wèi)星常被作為優(yōu)良的遺傳標記而得到廣泛應(yīng)用。

利用微衛(wèi)星標記檢測食品中動物源性時，首先在Genebank中選出各物種的微衛(wèi)星標記，并在其側(cè)翼序列設(shè)計特異性引物，經(jīng)PCR電泳法檢測是否有目的微衛(wèi)星擴增來實現(xiàn)檢測目的。鄭新等經(jīng)過實驗篩選了適合鑒別豬、牛、山羊、綿羊、雞、鴨、鵝動物源性的微衛(wèi)星標記DNA。并利用微衛(wèi)星標記技術(shù)成功檢測了肉及肉制品中的多種動物源性成分［14］。

微衛(wèi)星標記技術(shù)方便快捷，特異性高，適合大批樣品的檢驗。并且相比較其他分子標記（RFLP，AFLP，RAPD），微衛(wèi)星可提供更多的多態(tài)性，針對物種來源日益豐富的肉制品市場，微衛(wèi)星標記技術(shù)是一種新型的，具有相當市場應(yīng)用前景的肉品來源鑒別技術(shù)，但該技術(shù)需要豐富的微衛(wèi)星數(shù)據(jù)庫。

2　基于分子雜交的檢測方法

基因芯片檢測是將固定后的探針與樣品核酸分子在合適的條件下進行雜交，通過檢測雜交信號的有無及強度來獲取樣品核苷酸序列的相關(guān)信息。

早在1995年Jacob B.Buntjer［15］等就利用該技術(shù)鑒定加熱肉制品中的牛、山羊、綿羊、鹿、豬、雞和火雞成分，4 h內(nèi)可完成50個樣品的檢測，準確度可達到1%。

石豐運［16］根據(jù)線粒體DNA16SrRNA基因在脊椎動物間的保守性，設(shè)計一對可以擴增牛、山羊、綿羊、水牛、鹿、驢等16個物種DNA的通用引物，然后在該引物擴增區(qū)間設(shè)計16條特異性基因芯片檢測探針和兩條質(zhì)控探針，通過優(yōu)化PCR體系和雜交體系，建立了同時檢測樣品中16種動物源性的基因芯片檢測技術(shù)，其檢測的準確性與普通PCR電泳法符合率達到100%。

該技術(shù)實現(xiàn)了高通量大規(guī)模的樣品檢測，只需要經(jīng)過一次PCR和一次雜交反應(yīng)就可以檢測樣品的多種動物源性成分?；蛐酒夹g(shù)從科研實驗室進入與尋常百姓生活密切相關(guān)的食品安全檢測領(lǐng)域會有廣闊的發(fā)展應(yīng)用空間。但是反應(yīng)體系需要優(yōu)化并且芯片的制備耗時長，制作系統(tǒng)雜交系統(tǒng)和計算機檢測系統(tǒng)到目前為止市場價格仍非常昂貴。

3　其他新型檢測技術(shù)

3.1基因條形編碼檢測技術(shù)

基因條形碼的概念最早由加拿大動物學家Paul Heber［17］于2003年提出可以用某物種的單一的小片段基因來代表該物種，就像超市中掃描條形碼識別商品一樣，通過快速分析一小段DNA序列來識別物種，他把這種物種鑒定技術(shù)稱為基因條形碼技術(shù)。線粒體COI基因因含有大量具有物種特征的單核苷酸位點，可選擇作為條形編碼基因［17］。

用基因條形編碼技術(shù)檢測肉及肉制品動物源性成分的應(yīng)用近年來越來越多。邱德義［18］等以基因條形編碼技術(shù)鑒別魚肉等水產(chǎn)制品的物種來源，他們提取了16種樣品的DNA，利用COI基因通用引物進行擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)測序比對，提交DNA條形碼數(shù)據(jù)庫分析鑒定，簡單快速鑒別出樣品的動物源性成分。

基因條形碼檢測技術(shù)簡單快速準確，但由于動物源性食品來源豐富，需要豐富的數(shù)據(jù)庫作為支撐。對于多成分加工肉制品還需要輔助條形編碼基因的輔助才能準確鑒別。該技術(shù)成熟的關(guān)鍵是選擇和評價合適的物種條形碼，豐富數(shù)據(jù)庫，另外也依賴于PCR產(chǎn)物回收和測序技術(shù)的提高。

3.2LAMP（Loop-mediated isothermal amplification）環(huán)介導等溫擴增檢測技術(shù)

環(huán)介導等溫擴增是一種恒溫核酸擴增方法，它針對靶基因6個特異性序列設(shè)計內(nèi)外兩對特異性引物，加入具有鏈置換活性的Bst DNA聚合酶，恒溫（60℃～65℃）條件下進行高效快速的特異性擴增反應(yīng)。

楊麗霞等將LAMP與實時熒光技術(shù)相結(jié)合建立實時熒光LAMP法檢測肉制品動物源性，她在反應(yīng)體系中加入SybrGreenI實時檢測目的基因的擴增情況，并用該技術(shù)檢測牛羊肉中的豬肉成分［19］。LAMP與常規(guī)PCR相比不需要溫度循環(huán)，電泳及紫外觀察等過程，簡單快速特異性強，只需要一臺恒溫裝置就能完成檢驗，簡便快捷，適合基層快速診斷。但其靈敏度高，開蓋操作容易形成氣溶膠污染，假陽性問題比較嚴重。并且引物設(shè)計也比較復雜，對技術(shù)人員要求高。

3.3RPA檢測技術(shù)

RPA（Recombinase Polymerase Amplification）重組酶聚合酶擴增技術(shù)被稱為是可以替代PCR的核酸檢測技術(shù)，它能夠在15 min內(nèi)進行常溫下的單分子核酸擴增。該技術(shù)可以實現(xiàn)單分子的核酸檢測，對于低含量DNA檢測效果理想，能夠?qū)⒑哿康腄NA模板擴增到可以檢出的水平，從單個核酸分子到擴增產(chǎn)物；并且在恒定常溫（37℃～42℃）下既可以完成檢驗，不需要復雜昂貴的溫控設(shè)備，對DNA檢測的普及和現(xiàn)場檢驗意義重大。

此技術(shù)相比較LAMP繁瑣的引物設(shè)計，優(yōu)勢更為明顯，現(xiàn)已應(yīng)用到轉(zhuǎn)基因植物的檢測等方面［20］。對與檢測肉及肉制品中動物源性成分，目前鮮有此方面的報道。

4　結(jié)論與展望

任何一個良好的分子生物學檢測方法都應(yīng)滿足通用性，特異性，靈敏性和穩(wěn)定性。在此基礎(chǔ)上，追求高通量，低成本的檢驗方法。每一種方法都有其相對的優(yōu)缺點，在操作中可以根據(jù)實際情況進行選擇?？蒲袑嶒炇铱芍铝τ诤唵胃咝У奈锓N鑒定試劑盒的開發(fā)，質(zhì)檢領(lǐng)域面臨種類繁多、成分復雜的肉品種類可充分總結(jié)經(jīng)驗，優(yōu)化前處理，提取高效的DNA樣品，互相學習補充，提高肉類摻假的檢驗?zāi)芰?，為人類造福。關(guān)注其他領(lǐng)域的新技術(shù)，學會轉(zhuǎn)移應(yīng)用和創(chuàng)新開發(fā)更多更精準有效的定量檢驗新技術(shù)，任重而道遠。

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Research Progress in Nucleic Acid Test for Animal-derived Material in Meat and Meat Product

SHI Pan-pan，LI Xu，WU Hao，CHEN Lei
（Institute of Products Quality Supervision and Inspection in Henan Province，Zhengzhou 450000，Henan，China）

Food is the first thing for people and safety is the first thing for food.Meat is of great importance in people's life，which provide rich protein，fat and vitamin B for people's life.Earnings driven，food adulteration often occurs in the meat industry，which seriously undermined interests of consumers and the adverse impact for social and economic loss is very serious.So it is of great significance to carry on tests and studies about meat and meat products.This article analysed the nucleic acid inspection technique about animal-derived material in meat and meat product deeply and gave a brief introduction to some new technique which is showing extensive prospect.

meat and meat product；ingredients of animal origin nucleic acid detection technology；polymerase chain reaction（PCR）

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.10.052

石盼盼（1987—），女（漢），助理工程師，碩士，研究方向：食品檢驗。

2015-03-08