陳紅麗 徐佳迪 南文濱 郭雙 李武山 連杰 豐慧根 林俊堂

453003新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院；河南省干細(xì)胞與生物治療工程技術(shù)中心

·論著·

膠原/纖維蛋白膠復(fù)合藥膜的性質(zhì)及其體外抑瘤效應(yīng)初步研究

陳紅麗 徐佳迪 南文濱 郭雙 李武山 連杰 豐慧根 林俊堂

453003新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院；河南省干細(xì)胞與生物治療工程技術(shù)中心

目的制備載硫酸長春新堿（VCR）微球的膠原/纖維蛋白膠的緩釋藥膜并研究其性質(zhì)，考察京尼平的交聯(lián)濃度（0、0.05、0.1、0.2 mol/ml）對(duì)藥膜性質(zhì)的影響。方法冷凍干燥和京尼平交聯(lián)法制備多孔膠原膜，將VCR微球混合纖維蛋白膠后加入多孔膠原膜中制備膠原/纖維蛋白膠復(fù)合藥膜，考察藥膜的表面形態(tài)、機(jī)械性能、降解性質(zhì)和體外釋藥行為，并用CCK-8法檢測藥膜對(duì)3種腫瘤細(xì)胞（人肺癌細(xì)胞株A549、人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7和人宮頸癌細(xì)胞株HeLa）的體外抑瘤率。結(jié)果隨著交聯(lián)劑京尼平濃度的增加，藥膜機(jī)械強(qiáng)度增加，而斷裂伸長率降低。VCR微球與纖維蛋白膠及膠原復(fù)合制備成藥膜，可達(dá)到雙重緩釋的作用，減少藥物突釋，并延緩藥物釋放。未交聯(lián)的F0藥膜藥物24 h突釋為（41．8±3．4）%，京尼平交聯(lián)后的F0.05、F0.1和F0.2藥膜的藥物突釋分別為（38．4±4．1）%、（35．2±3．6）%和（34．3±3．7）%。未載藥的F0.1藥膜無顯著細(xì)胞毒效應(yīng)，而載藥的F0.1藥膜在不同時(shí)間釋放的藥液對(duì)3種腫瘤細(xì)胞株均有顯著的抑制作用，且對(duì)各細(xì)胞株敏感度不同。結(jié)論F0.1藥膜能不同程度減少藥物的突釋，使藥物釋放更加平穩(wěn)緩慢，有望用作抗腫瘤藥物載體。

京尼平；微球；膠原；纖維蛋白；體外抑瘤

Fund program：National Natural Science Foundation of China(U1304819,81401519);the Key Technologies R&D Program of Henan Province(122102210148);National Training Programs of Innovation and Entrepreneurship for Undergraduates(201310472034)

0 引言

膠原是一種天然蛋白質(zhì)，因其低抗原性、可生物降解性和良好的生物相容性，作為藥物載體和組織工程支架備受關(guān)注[1-3]。但其降解受局部因素的影響大，降解速度可控性不如人工多聚物，且機(jī)械性能差，故常采取交聯(lián)以及添加多糖類物質(zhì)等來彌補(bǔ)上述缺陷[4-5]。目前，膠原交聯(lián)的方法以化學(xué)交聯(lián)為主，但多數(shù)化學(xué)交聯(lián)劑如甲醛、戊二醛等對(duì)細(xì)胞或組織具有一定的毒性。京尼平（Genipin）是來自植物梔子中的天然交聯(lián)劑，其毒性低于化學(xué)交聯(lián)劑[6-7]。本研究用天然交聯(lián)劑京尼平對(duì)膠原支架進(jìn)行交聯(lián)，以期在提高生物材料抗降解能力的同時(shí)，保留其良好的生物相容性。膠原的另一個(gè)局限在于其只在酸性環(huán)境中溶解，由于膠原在中性環(huán)境中不能溶解分散，使得水溶性藥物難以分散均勻，因而作為藥物載體不能保證藥物均勻且緩慢釋放而發(fā)揮作用。纖維蛋白具有良好的血液和組織相容性，無毒副作用，作為可降解生物材料已在臨床上應(yīng)用[8-9]，將包載藥物的微球與纖維蛋白混合后，與膠原復(fù)合制備支架，可在一定程度改善膠原材料的上述缺點(diǎn)。本課題組前期制備了膠原/纖維蛋白膠的組織工程支架材料，具有良好的蛋白緩釋性質(zhì)[4]。本研究擬將硫酸長春新堿（vincristine sulfate,VCR）制成緩釋微球，復(fù)合于纖維蛋白膠中，再將上述混合物加入京尼平交聯(lián)的膠原多孔膜中，得到膠原/纖維蛋白膠復(fù)合藥膜，考察藥膜的形態(tài)、機(jī)械性能和藥物釋放特性，并探討雙重緩釋藥膜對(duì)3種腫瘤細(xì)胞株（人肺癌細(xì)胞株A549、人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7和人宮頸癌細(xì)胞株HeLa）的抑制作用，為下一步體內(nèi)實(shí)驗(yàn)提供參考，也為天然高分子載微球的藥膜作為抗腫瘤植入藥物載體的臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

VCR（純度＞98%）（上海康愛生物制品有限公司），聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）（分子質(zhì)量為5×104～8×105u，50∶50）（山東省醫(yī)療器械研究所），膠原（以新鮮豬皮為原料，采用胃蛋白酶消化法自制，主要成分為I型膠原,含量＞95%），纖維蛋白膠（廣州倍繡生物技術(shù)有限公司），RPMI 1640培養(yǎng)基（美國Gibco公司），CCK-8（美國Sigma公司），乙腈、二氯甲烷等試劑均為分析純或色譜純級(jí)。人肺癌細(xì)胞株A549、人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7和人宮頸癌細(xì)胞株Hela均購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所。

715高效液相色譜儀（法國Gilson公司），Zeiss Supra 55VP掃描電鏡（德國Zeiss公司），SpectraMax Plus384紫外-可見分光光度計(jì)（美國BeckmanCoulter公司），ALPHA 2-4 LD plus低溫冷凍真空干燥機(jī)（德國Christ公司），CTM8010萬能材料試驗(yàn)機(jī)（協(xié)強(qiáng)儀器制造（上海）有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 藥膜的制備

將膠原分別用一定濃度（0、0.05、0.1、0.2 mol/ml）的京尼平（4℃，pH 6.5）交聯(lián)12 h，去離子水充分漂洗去除交聯(lián)液，二次凍干，得膠原多孔膜。選用W/O/W溶劑揮發(fā)法制備載VCR的PLGA微球[5]，然后將微球與纖維蛋白按質(zhì)量比1∶10混合均勻，在上述混合液中加入凝血酶后，立即注入制備好的膠原多孔膜（纖維蛋白膠與膠原的質(zhì)量比為1∶3），分別得到不同交聯(lián)劑濃度作用的膠原/纖維蛋白/VCR微球復(fù)合藥膜（F0、F0.05、F0.1和F0.2）。最后，將制備好的緩釋藥膜切成直徑1 cm的圓形試片待檢。

1.2.2 微球及藥膜形態(tài)觀察

將藥膜置入液氮冷凍定型后，取出切成小試片后置于金屬片上，真空噴金處理后，掃描電鏡觀察藥膜表面形態(tài)及其中微球的分布狀態(tài)。

1.2.3 藥膜的孔隙率、pH值及機(jī)械強(qiáng)度測定

在25℃條件下，裝滿乙醇的比重瓶稱質(zhì)量為K1；將質(zhì)量為K0的藥膜置于比重瓶中，脫氣處理至乙醇完全充滿于藥膜中，再次加滿乙醇，稱質(zhì)量得到K2；取出藥膜后，將比重瓶與剩余的乙醇稱質(zhì)量得到K3。孔隙率（K%）的計(jì)算公式如下

將各樣品分別放入試管內(nèi)，加入10 ml去離子水，使藥膜完全浸沒，振搖樣品使其分散，37℃下浸提72 h。用pH計(jì)測量各樣品浸提液和同條件下靜置72 h去離子水的pH值。

取每種樣品各5個(gè)，剪成長條狀，計(jì)算其表面積，用萬能材料試驗(yàn)機(jī)進(jìn)行拉伸強(qiáng)度的測試（夾具間距為20 mm，拉伸速度為100 mm/min）。檢測其斷裂強(qiáng)度及斷裂伸長率。

1.2.4 藥膜的體外降解性

藥膜在保干器中充分干燥至恒重后精確稱質(zhì)量為W0，加入酶解液（含I型膠原酶100 U/mg，纖溶酶0.2 mg/ml），置于（37±1）℃、（75±1）r/min的空氣浴振蕩器中計(jì)時(shí)反應(yīng)。每種樣品設(shè)3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。反應(yīng)至一定時(shí)間時(shí)，各取出一片，用三蒸水充分漂洗，冷凍干燥后稱質(zhì)量W1。按以下公式計(jì)算降解百分率（D%）

1.2.5 藥膜的載藥量及體外釋藥行為

將藥膜試片置入試管，加入2.0ml含消化酶（I型膠原酶20 U/mg，纖溶酶0.05 mg/mL）的PBS（pH6.8，37℃），于空氣浴振蕩器中（37±1）℃、（75±1）r/min振蕩，每種藥膜的釋放同時(shí)做4組平行樣。相同條件下做對(duì)照微球的釋放實(shí)驗(yàn)。于固定時(shí)間間隔離心取全部釋放液，并加含等量消化酶的新鮮PBS，高效液相色譜法測定藥物含量[5]，以累計(jì)釋放率為縱坐標(biāo)，時(shí)間為橫坐標(biāo)繪制釋放曲線。

1.2.6 CCK-8法測定體外抑瘤效應(yīng)

將貼壁良好的處于指數(shù)生長期的3種細(xì)胞（A549、MCF-7、HeLa細(xì)胞），分別加入胰酶消化后用RPIM-1640培養(yǎng)基稀釋成細(xì)胞懸液；向96孔板中每孔加入200 μl細(xì)胞懸液（1×104/孔），每組設(shè)3個(gè)空白，置37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；將藥膜在不同時(shí)間點(diǎn)的釋放液加入細(xì)胞中，繼續(xù)培養(yǎng)24 h；加入CCK-8試劑10 μl，孵育1.5 h后，用多功能酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光度（OD）值，根據(jù)下式計(jì)算細(xì)胞存活率

式中：ODtreated和ODcontrol分別為藥品處理及未處理的細(xì)胞的吸光度值，ODblank為不加細(xì)胞只加CCK-8試劑的吸光度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示,樣本均數(shù)間比較采用t檢驗(yàn),以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 藥膜形態(tài)、孔徑及機(jī)械性能

制備的藥膜外觀完整，表面較粗糙，厚度均勻。其中F0和F0.05藥膜呈乳白色，F(xiàn)0.1和F0.2藥膜則呈淡藍(lán)色。掃描電鏡觀察微球呈圓整球形，表面光滑，無粘連；微球包埋于藥膜中且分布較均勻（圖1）。pH計(jì)測得各藥膜浸提液的pH值均在6.8～7.2。

F0、F0.05、F0.1和F0.2藥膜的平均孔徑分別為（243± 42）nm、（182±40）nm、（146±41）nm和（142±34）nm。隨著京尼平濃度的增加，支架材料的孔徑減小，孔隙率呈下降趨勢。未交聯(lián)的F0藥膜質(zhì)地松軟；隨著京尼平濃度的增加，硬度增加，斷裂伸長率降低（P＜0.05，P＜0.01），特別是0.2 mol/L京尼平交聯(lián)的藥膜（F0.2藥膜）質(zhì)地較脆。（圖2）

2.2 藥膜體外降解性

圖1 微球與藥膜的掃描電鏡圖

如圖3所示，降解16 h時(shí)肉眼觀察到未交聯(lián)的藥膜（F0藥膜）大部分已崩解，只剩一些絮狀纖維，經(jīng)計(jì)算藥膜剩余質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（23.3±2.4）%；24 h時(shí)幾乎完全降解，F(xiàn)0藥膜只剩少量沉淀；隨著京尼平濃度的增加，藥膜的降解速率降低，如F0.05、F0.1和F0.2的藥膜在16 h時(shí)的降解剩余質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為（50.4±3.5）%、（63.4±3.1）%和（67.2±3.2）%。在酶解液的作用下，F(xiàn)0.1和F0.2藥膜的降解速率基本一致（P＞0.05）。

圖2 藥膜的斷裂強(qiáng)度和斷裂伸長率測定

2.3 藥膜的釋藥行為

如圖4所示，VCR在藥膜的釋放呈典型的三相釋放，起始24 h突釋在34.6%～41.8%；隨著京尼平交聯(lián)濃度的增加，藥物的突釋明顯降低，3組交聯(lián)后的藥膜（F0.05、F0.1和F0.2藥膜）的釋放速率均小于未交聯(lián)的藥膜（F0藥膜）。同時(shí)，F(xiàn)0、F0.05、F0.1和F0.2藥膜分別在72、96、120和144 h時(shí)釋藥趨向平穩(wěn)，釋放量間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。其中F0.1和F0.2藥膜的釋放速率及釋放行為基本一致。

2.4 藥膜釋放液的體外抑瘤效應(yīng)

綜合上述研究結(jié)果，選擇F0.1藥膜進(jìn)行體外釋放藥液的抑瘤實(shí)驗(yàn)。采用CCK-8法測定藥膜在不同時(shí)間釋放的VCR藥液對(duì)腫瘤細(xì)胞株的抑制作用。結(jié)果如圖5所示，將未載藥的F0.1藥膜在不同時(shí)間的釋放液分別加入3種腫瘤細(xì)胞株（A549、MCF-7和HeLa）培養(yǎng)24 h后3種細(xì)胞的細(xì)胞活力均在90%以上。載藥的F0.1藥膜在12 h時(shí)釋放的藥液對(duì)3種細(xì)胞的抑制率最大，A549、MCF-7和HeLa細(xì)胞的細(xì)胞活力分別為（12.4±1.2）%、（15.6±1.5）%和（17.2± 1.7）%；在144 h時(shí)釋放的藥液對(duì)細(xì)胞的抑制率最小，細(xì)胞活力最大。在3種細(xì)胞中，相同劑量（相同時(shí)間段的釋放量）的VCR藥液對(duì)A549細(xì)胞的抑瘤效應(yīng)較強(qiáng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論與結(jié)論

圖5 不同時(shí)間的藥膜釋放液對(duì)3種腫瘤細(xì)胞活力的影響

化療藥物治療腫瘤的療效主要取決于腫瘤部位的有效藥物濃度與作用時(shí)間。由于化療藥物毒性較大，限制了其臨床用量，此外，化療藥物不能在腫瘤部位達(dá)到較高的藥物濃度并維持較長的作用時(shí)間，導(dǎo)致效果不夠理想。因此，尋找一種能在體內(nèi)維持較長時(shí)間的有效藥物濃度，尤其能在腫瘤局部發(fā)揮持續(xù)效用的化療藥物劑型，可對(duì)腫瘤的治療產(chǎn)生良好效果[10-11]。鑒于此，本研究試圖通過將化療藥物VCR制成微球后，再與纖維蛋白膠及膠原復(fù)合成藥膜，達(dá)到雙重緩釋效果，微球加入到纖維蛋白膠中可使載藥微球較均勻地分布于膠原膜中。該藥膜目的用于植入腫瘤術(shù)后瘤床，進(jìn)行間質(zhì)化療[5]，起到類似靶向作用，實(shí)現(xiàn)腫瘤組織局部的高濃度持續(xù)給藥，從而達(dá)到提高抗腫瘤效果的目的。

京尼平是天然來源的交聯(lián)劑，以其低細(xì)胞毒性和高生物相容性成為研究熱點(diǎn)，可交聯(lián)細(xì)胞組織和包含伯胺的生物材料。Ⅰ型膠原蛋白材料經(jīng)京尼平交聯(lián)后，可通過分子間的化學(xué)反應(yīng)使膠原內(nèi)部和膠原間的聯(lián)系更加緊密，從而改變材料的極限抗張強(qiáng)度、最大載荷及彈性模量等力學(xué)性能；同時(shí)，降解速度和體內(nèi)穩(wěn)定性亦可得到明顯改善[6-7]。但是在一定條件下，京尼平與氨基酸能發(fā)生呈色反應(yīng)生成梔子藍(lán)色素[12]，因此用京尼平交聯(lián)后，Ⅰ型膠原蛋白材料由白色變?yōu)樗{(lán)色。

交聯(lián)后的藥膜隨交聯(lián)劑濃度的增加，機(jī)械強(qiáng)度增加，體外降解速率降低；明顯降低了藥物的突釋，并延緩了藥物的釋放，使釋放速率更緩慢、平穩(wěn)。在一定濃度時(shí)，隨交聯(lián)劑濃度增加，藥物緩釋的效果愈加明顯。F0.1和F0.2藥膜的體外降解速率基本無差異，其體外藥物釋放行為也基本一致。這是因?yàn)樗幬镝尫攀軡舛忍荻群腕w系降解兩方面因素影響。藥物被速度限制性可降解載體膜（PLGA、纖維蛋白膠和膠原）包裹，藥物隨著載體的降解而釋放；如果載體基質(zhì)降解速度高于藥物擴(kuò)散速率，藥物釋放就由載體基質(zhì)降解速率決定[13-14]。

藥膜由于其藥物釋放緩慢，且可較長時(shí)間地發(fā)揮作用，因此推測對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用更為明顯。結(jié)合藥膜的機(jī)械性能與釋藥行為，選擇F0.1藥膜進(jìn)行體外抑瘤效應(yīng)實(shí)驗(yàn)。VCR屬細(xì)胞周期特異性藥物，臨床主要用于治療急性淋巴細(xì)胞白血病、惡性淋巴腫瘤、小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、卵巢癌和消化道癌[11]。F0.1藥膜體外12 h時(shí)釋放的藥液，對(duì)3種腫瘤細(xì)胞的抑制率最顯著，這和體外藥物在12 h時(shí)釋放的藥量最大一致；120～144 h之間F0.1藥膜釋放的藥液無顯著增加，故此時(shí)間段釋放的藥液，細(xì)胞抑制率最小。研究發(fā)現(xiàn)，3種腫瘤細(xì)胞株具有不同的藥物敏感度，其中藥物對(duì)A549細(xì)胞的抑瘤效應(yīng)最強(qiáng)。另外需要特別指出，由于體內(nèi)外的藥物釋放行為存在著差別，體內(nèi)外抑瘤實(shí)驗(yàn)也并不完全等同，因此上述研究結(jié)果尚待下一階段的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)。由于腫瘤細(xì)胞株具有不同的生物學(xué)效應(yīng)，故對(duì)藥物的敏感性也不同，繼而不同腫瘤的用藥劑量也不同，需根據(jù)具體情況給藥。

綜上所述，將載藥微球與纖維蛋白膠和膠原制備成復(fù)合藥膜，可減少藥物突釋，延長藥物作用時(shí)間。選用京尼平作為交聯(lián)劑可增強(qiáng)藥膜的機(jī)械強(qiáng)度，延緩體內(nèi)降解速率。綜合考慮藥膜的理化等性質(zhì)，F(xiàn)0.1藥膜各方面性質(zhì)最優(yōu)，符合本研究需要，體外細(xì)胞抑瘤實(shí)驗(yàn)表明F0.1藥膜對(duì)于A549細(xì)胞抑瘤效應(yīng)較強(qiáng)。下一步將通過體內(nèi)腫瘤模型實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究該植入藥膜的抑瘤效應(yīng)。

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Characteristic of collagen/fibrin complex film and the preliminary study of its in vitro anti-tumor effect

Chen Hongli,Xu Jiadi,Nan Wenbin,Guo Shuang,Li Wushan,Lian Jie,Feng Huigen,Lin Juntang
School of Life Science and Technology,Xinxiang Medical University;Stem Cell and Biotherapy Technology Research Center of Henan Province,Xinxiang 453003,China
Corresponding author:Chen Hongli,Email:chenhlhl@126.com

ObjectiveTo investigate the properties of vincristine sulfate(VCR)loaded collagen/fibrin microspheres complex film,especially to give evaluation of the concentration of genipin(0,0.05,0.1 and 0.2 mol/ml) as a cross-linking agent on the properties of the film.MethodsPorous collagen film were fabricated by freeze-drying method and cross-linked by genipin.VCR loaded microspheres were mixed with fibrin into collagen scaffolds to fabricate the complex film.The physiochemical properties of the film,such as surface morphology,mechanical function,in vitro degradation and VCR release kinetics were also measured.In vitro cytotoxicities of VCR loaded film were evaluated using CCK-8 assay.ResultsThe tensile strength of the film was strengthened and the breaking elongating rate of the film decreased with more proportion of genipin.The degradation rates of the films(F0.05,F0.1and F0.2)were slower than that of the F0film.VCR was released from the film in a prolonged period and the initial burst release of the film was less significant.The initial release of F0was(41.8±3.4)%,while of the films which cross linked (F0.05,F0.1and F0.2)were(38.4±4.1)%,(35.2±3.6)%and(34.3±3.7)%,respectively.The results showed that drug free film cross-linked by genipin(F0.1)possesses very low cytotoxicity to the tumor cells.The released VCR showed high in vitro inhibitive effects on HeLa,MCF-7 and A549 with different sensitivity on each line.ConclusionsF0.1film can achieve the release kinetics at a relatively constant speed.It has the potential for application as a carrier of anticancer drugs.

Genipin;Microspheres;Collagen;Fibrin;In vitro anti-tumor effect

陳紅麗，Email：chenhlhl@126.com

10．3760/cma．j．issn．1673-4181．2016．01．001

國家自然科學(xué)基金（U1304819，81401519）；河南省科技攻關(guān)項(xiàng)目（122102210148）；國家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201310472034）

2015-11-04）