倪曉鵬++高志紅

摘要：回顧了園藝作物全基因組測序的發(fā)展歷程，介紹3代測序技術的特點和應用現(xiàn)狀?？偨Y了葡萄、番木瓜、草莓等果樹，黃瓜、白菜、番茄等蔬菜以及蓮、康乃馨等花卉在內的25種園藝作物基因組測序簡況。重點介紹了全基因組測序在基因注釋、比較基因組學研究、重測序、全基因組關聯(lián)分析、轉錄組學、SNP芯片開發(fā)等方面的應用。最后討論了全基因測序研究的難點和今后的研究方向。

關鍵詞：園藝作物；基因組測序；基因組學

中圖分類號： Q78文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2016）02-0009-04

園藝業(yè)是農業(yè)種植業(yè)的重要組成部分，對豐富人類營養(yǎng)和美化、改善人類生存環(huán)境有重要意義。我國是世界園藝大國，園藝是我國農業(yè)的重要組成部分，其中蔬菜播種面積由1990年的600萬hm2增加到2013年的2 100萬hm2，產(chǎn)量由1990年的1.95億t增加到2013年的7.35億t[1]。種植面積和產(chǎn)量分別占世界的43%和49%，居世界第一位。隨著動植物全基因組測序的不斷發(fā)展，2001年由美國能源部推動的人類基因組工作草圖的發(fā)表被認為是人類基因組計劃成功的里程碑[2]。破譯人類遺傳信息，將對醫(yī)學、生物學乃至整個生物科學產(chǎn)生不可估量的影響。這一計劃促成了大批動植物全基因測序的完成，也有望從基因組水平上分析基因的結構、組成、調控和物種進化，從而避免傳統(tǒng)分子生物學帶來的種種弊端，大大促進全基因組測序技術在園藝作物上的應用發(fā)展。

1全基因測序的發(fā)展歷程及其在園藝植物測序中的應用

距世界第一例模式植物擬南芥全基因組測序發(fā)表已有十余年[3]，在此期間測序技術飛速發(fā)展，每年發(fā)表的測序文章都穩(wěn)定增加。擬南芥的測序就是基于第一代測序技術Sanger測序完成的，運用了鏈終止和斷裂技術。第一代測序技術已經(jīng)規(guī)?；揖哂袦y序讀長較長、測序準確率高等特點，但是由于其時間長、成本高、通量低等缺點而無法滿足現(xiàn)在實驗需求。

2004年，美國國家人類基因組研究所（NHGRI）發(fā)起了一項融資計劃[4]，目標是在未來10年將人類基因組測序的費用減少到1 000美元，這刺激了商業(yè)化的新一代測序（next generation sequencing，NGS）技術的快讀萌芽。第二代測序技術大幅提升基因組測序的輸出與成本比，相較第一代測序技術涵蓋范圍更加廣泛，可以同時測定多個平行DNA片段，從而輸出更多測序閱讀量，但一般長度較短、質量低。第一個NGS技術是羅氏公司（Roche）公司的454焦磷酸測序法[5]，Solexa和Illumina測序平臺在1年后也進行商業(yè)化應用。第二代測序技術具有成本低、單次數(shù)據(jù)量大、消耗時間短等特點，故又被稱為第二代高通量測序技術，并漸漸成為大規(guī)模全基因組測序技術的主導。

Roche 454測序平臺是基于焦磷酸測序，由于低數(shù)據(jù)率和相對較短的讀取，最初適用于細菌基因組測序，隨后技術改進，利用Roche 454與Sanger測序結合起來運用于更復雜的基因組測序，完成蘋果基因組測序[6]，取代Sanger測序作為主要數(shù)據(jù)源完成可可基因組[7]和甜瓜[8]基因組測序。Illumina 公司提供的Solexa系統(tǒng)比Roche 454系統(tǒng)數(shù)據(jù)產(chǎn)出量多且花費較少的費用。自推出以來，讀取長度獲得明顯改善，并成功運用到黃瓜的測序工作中[9]。

野生草莓[10]作為第一個采用Roche 454、Illumina、SOLiDTM三大平臺共同完成測序的植物，標志著測序技術向多平臺合作而不是獨立運行的模式發(fā)展。近幾年來，Illumina測序成為第二代測序平臺的主導，截至2014年11月，已為多種園藝作物如中國白菜[11]、馬鈴薯[12]、香蕉[13]、橙[14]和西瓜[15]基因組測序（表1）。

近年來，新一代測序平臺已經(jīng)出現(xiàn)并被稱為“第三代測序技術”，與第二代測序方法相比有著進一步模式轉變，有2個突出特點，一是測序前不再需要PCR擴增，二是熒光或電流信號都可以在互補鏈加核苷酸的酶反應中被檢測到。2種測序平臺現(xiàn)在已經(jīng)投入商業(yè)化運營，分別是Pacific Biosciences公司的PacBio RS平臺（http：//www. Pacificbio scie nces.com）和Ion Torrent 公司的Personal Genome平臺 （Life Technologies，http：//www.iontorren t.com）。PacBio測序平臺使用實時零模式波導檢測單個DNA聚合酶的活性[31]，大規(guī)模并行單分子實時（SMRT）測序保證了高通量測序。其突出特點是序列讀長，經(jīng)報道其單程長讀取對的準確率為84.2%～97.8%[32]，相較于第二代測序技術，第三代測序技術可以讀取更長序列、提高測序通量、節(jié)省試劑成本，但其錯誤率比第二代測序技術高，3代測序技術優(yōu)缺點比較見表2。

2全基因組測序的應用

2.1基因注釋

基因注釋是利用生物信息學方法給測序完成的物種序列附上生物學信息的過程，通過識別不編碼蛋白質的基因片段，識別基因上的元素（基因預測），給元素附上生物學信息的手段進行重復序列的識別、非編碼RNA的預測、基因結構預測和基因功能注釋，發(fā)現(xiàn)與農藝性狀相關基因，例如花期調控、植物生長習性、耐寒性、休眠、果實性狀與品質等。Fukuoka等通過鑒定蘋果（Malus×domestica）的146個MADS-box基因，與擬南芥和水稻MADS-box基因聚成6個亞組，預測MADS-box基因在17條染色體上的密度，在根、莖、葉、花組織和果實發(fā)育的5個階段進行了分析，表明MADS-box基因參與了蘋果的生理和發(fā)育過程的各個方面[33]。Yu等將超過6 000 個茄子組織和處理組的cDNA克隆組成1個含有16 245 個獨特序列的單基因組，對單基因組進行測序并采用SAGE策略對茄子單基因集在轉錄組中的功能分析，相當數(shù)量的短序列標簽被成功注釋[34]。

2.2比較基因組學研究

比較基因組學研究是基于基因組圖譜和測序技術，對已知的基因和基因組結構進行比較以了解相關基因的功能、表達機制和物種親緣關系。

番茄測序小組完成了對栽培番茄及其近緣野生種醋栗番茄全基因組的精細序列分析。在解碼的番茄基因組中共鑒定出 34 727 個基因，其中97.4% 的基因已經(jīng)精確定位到染色體上。通過比較基因組分析發(fā)現(xiàn)了番茄果實進化和發(fā)育的基因組學基礎，番茄基因組經(jīng)歷的2次三倍化使基因家族產(chǎn)生了特異控制果實發(fā)育及營養(yǎng)品質的新成員[19]。Zhang等研究發(fā)現(xiàn)在梅花基因組中存在和抗病相關的PR基因家族，由PR編碼的蛋白質可介導植物產(chǎn)生防御反應，以此來抵抗病害和不良環(huán)境。例如：梅花基因組中存在的[WTBX][STBX]PR10[WTBZ][STBZ]與梅花的葉和根抗鹽度、抗干旱和抗病菌的機制相關[21]。

2.3重測序

通過基因組重測序，可以對栽培種和野生種基因組之間的差異進行比較，從而揭示物種起源以及馴化過程，為鑒定有價值的遺傳資源以及園藝作物育種提供重要參考。

Qi等對115個黃瓜品系進行了深度重測序，鑒定出112個假定的馴化延伸，其中1個區(qū)域包含著參與黃瓜果實苦味消失過程的1個基因，以及1個重要的馴化特性，也調查了栽培品種中分離度的基因組基礎，在β-胡蘿卜素羥化酶發(fā)現(xiàn)了一個自然遺傳變異，可以用來培育含有更高營養(yǎng)價值的黃瓜，揭露黃瓜進化的遺傳歷程，為未來遺傳育種提供了保證[35]。

2.4全基因組關聯(lián)分析

全基因組關聯(lián)分析（genome-wide association study，GWAS）是應用基因組中數(shù)以百萬計的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide ploymorphism，SNP）作為分子遺傳標記，進行全基因組水平上的對照分析或相關性分析，通過比較發(fā)現(xiàn)影響復雜性狀的基因變異的一種新策略。隨著基因組學研究以及基因芯片技術的發(fā)展，人們已通過GWAS方法發(fā)現(xiàn)并鑒定了大量與復雜性狀相關聯(lián)的遺傳變異。近年來，這種方法在農業(yè)動物重要經(jīng)濟性狀主效基因的篩查和鑒定中得到了應用。

Kenta等為了研究栽培番茄遺傳和表型多樣性的關系，重測序6個栽培番茄品系，基于全基因連鎖不平衡分析表明，連鎖不平衡的延長依賴于染色質的性質，全基因組關聯(lián)分析表明所鑒定的SNP與農藝重要的性狀有著密切的關系，3個基因（FAS、SP、U）被發(fā)現(xiàn)與性狀變異相關，證明通過重測序得到的大量SNP進行全基因組關聯(lián)分析可以鑒別特異性位點，表明栽培番茄在基因組學和遺傳學發(fā)展上又邁進了一大步[36]。

2.5與轉錄組數(shù)據(jù)比較分析

轉錄組研究是基因功能及結構研究的基礎和出發(fā)點，是全基因組測序完成后首先要面對的問題。最近科學家們將高通量測序技術應用于轉錄組分析開發(fā)出了RNA測序技術（RNA-SEq），該技術能夠在全基因組范圍內檢測基因表達情況，進行差異基因篩選分析。由于RNA-SEq技術具有通量高、可重復性好、檢測范圍寬、定量準等特點，已經(jīng)廣泛應用于細菌、擬南芥、水稻和人類等生物轉錄組的研究。

Zenoni等利用RNA-Seq技術對葡萄栽培種Corvina漿果發(fā)育3個階段的轉錄組變化進行了研究，對比Pinot Noir 40024參考基因組，分析測量基因表達水平，共檢測到17 324個基因在果實發(fā)育過程中表達，其中6 695個在不同階段會特異性表達，這表明了基因功能的多樣性與表達特異性以及轉錄組的高度復雜性[37]。

2.6SNP芯片的開發(fā)

單核苷酸多態(tài)性（SNP）根據(jù)其在基因中的位置，可以分為基因編碼區(qū)、基因非編碼區(qū)、基因間隔區(qū)（基因之間的區(qū)域），在基因組中是多態(tài)性最豐富的DNA分子標記，具有數(shù)量眾多、分布均勻、分型方便等特點，它可以識別遺傳變異和關聯(lián)的表型基因分型。

Chagné等利用生物信息學工具，從包含蘋果品系中350 000 條序列的EST數(shù)據(jù)庫中開發(fā)SNP標記，結果識別了71 482個假定SNP分子標記。設計了464個PCR引物對，對PCR產(chǎn)物進行測序，重新獲得的SNP標記映射到蘋果參考基因（Royal Gala×A689-24雜交系和Malling 9×Robusta 5）SNP基因分型采用高分辨率熔解 （HRM）技術，共包含210個編碼SNP的93個新標記被成功映射到參考圖譜。此方法為使用數(shù)量性狀定位（QTL）技術了解重要農藝性狀和連鎖不平衡分析的基因調控提供了借鑒，也成為物理和遺傳圖譜結合的有效標記[38]。

3全基因組測序存在的挑戰(zhàn)

測序任何基因組的挑戰(zhàn)包括倍性和雜合度。與動物的基因組相比，植物基因組具有巨大的基因組大小、高度重復序列和全基因組或者片段基因組復制。

第二代測序平臺Roche 454、 Illumina和SoLiD不僅吞吐量顯著增加，還減少了錯誤率，增加了閱讀長度，使大范圍物種測序都能采用測序平臺經(jīng)濟地進行。然而，植物基因組的獨特性給測序帶來了許多挑戰(zhàn)，如他們的重復特性，裝配完整基因組是具有挑戰(zhàn)性的，這是由于植物基因組轉座因子的高拷貝數(shù)和擴張?zhí)匦詻Q定的。例如，玉米基因組測序通過BAC-by-BAC方法，基因組中85%含有轉座元件測序[39]。植物基因組中全基因組、節(jié)段和串聯(lián)重復的頻率[40]也給旁系同源種類帶來組裝問題，如果是最近一次復制，其序列同源性會高。因此，盡管第二代測序平臺能夠測序一大部分基因組，但迄今為止的全基因組測序方案還是缺乏足夠的代表性，質量評估在組裝過程中還會丟失部分基因。

另一個問題是，不是所有植物品種都是純合二倍體自交系，盡管使用WGS方法為雜合組織測序是可行的。然而高雜合度，包括交叉和無性繁殖的物種，如馬鈴薯，會阻礙WGS組裝。為了解決葡萄基因組（高度雜合二倍體）問題，Jaillonet等[JP3]采用了高度近交的品種，減少了雜合程度，進而才完成了測序。使用長閱讀可以提高一個基因組中組裝分離單體型的能力[16]。

植物倍性也是在植物denovo測序和組裝的一個巨大挑戰(zhàn)，其結果取決于物種是一個同源多倍體是異源多倍體，迄今為止，所有多倍體測序依賴于倍性降低或者染色體的物理分離。例如，絕大多數(shù)馬鈴薯品系是四倍體，最初是取雜合二倍體馬鈴薯基因 （RH89-039-16）進行測序從而避免同源染色體之間的高度雜合性，最后利用1個特殊的馬鈴薯基因型，1個加倍的單倍體 （DM1-3 516 R44），含有純合的12條染色體作為參考馬鈴薯基因組[12]。栽培草莓（Fragaria ananassa）是來自4個不同祖先的異源八倍體，野生草莓（Fragaria vesca）是二倍體，被用來測序是為了避免測序多個基因組帶來的困難[10]。

4全基因組測序的展望

為了面對世界基因組測序技術發(fā)展如此迅猛的挑戰(zhàn)，大量全基因組測序數(shù)據(jù)亟待深度挖掘，應制定長遠的戰(zhàn)略性基因組學研究計劃，不僅局限于栽培物種，更應該深度開發(fā)我國重要野生近緣物種的測序，促進重要基因資源的挖掘、保護和利用。擺脫先前依賴外觀表現(xiàn)型而轉入到基因型依賴型的研究當中去，從單一基因研究深入到全基因組關聯(lián)分析研究中。大力推動我國基因組學在基因克隆與分子育種領域的應用研究，提高園藝作物育種能力和水平。加強與轉錄組學、代謝組學、蛋白質組學和降解組學的相關研究，促進基因組學生物信息的共享與利用。加強生物信息學教育的投入，并將其應用于實踐中。隨著測序技術的不斷發(fā)展，相信在不久的將來園藝作物全基因組測序將進入快速發(fā)展的階段，為世界園藝產(chǎn)業(yè)帶來巨大貢獻。

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