郜衛(wèi)華 田羅 黃廷華 姚敏 許巧情

摘要：利用RACE （rapid amplification of cDNA ends）技術(shù)，克隆了凡納濱對蝦兒茶酚-氧位-甲基轉(zhuǎn)移酶（catechol-O-methyltransferase，COMT）基因cDNA序列。該基因（LvCOMT）cDNA全長910 bp（GenBank登錄號JQ345478），含有666 bp的開放閱讀框（ORF），編碼221個氨基酸，理論分子量74.9 ku，等電點4.98。經(jīng)軟件分析，該成熟肽有12個磷酸化的氨基酸位點，不具信號肽，推測凡納濱對蝦COMT基因可能是依賴12個可能的氨基酸發(fā)生可逆的磷酸化反應(yīng)來進行調(diào)控作用。LvCOMT基因與斑節(jié)對蝦、中國明對蝦的氧位-甲基轉(zhuǎn)移酶具有高度相似性，系統(tǒng)進化分析表明，LvCOMT在親緣關(guān)系上更接近于哺乳動物的兒茶酚-氧位-甲基轉(zhuǎn)移酶。應(yīng)用RQ-PCR分析COMT在凡納濱對蝦中的組織特異性分布，結(jié)果顯示COMT在肝胰腺組織中表達量最高，在鰓中的表達量最低。

關(guān)鍵詞：凡納濱對蝦；兒茶酚-氧位-甲基轉(zhuǎn)移酶；基因克隆；表達

中圖分類號： S917；Q786文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）02-0026-05

收稿日期：2015-03-06

基金項目：長江大學博士啟動經(jīng)費（編號：8012000101122）；廣東省海洋生物技術(shù)重點實驗室開放基金（編號：GPKLMB201403）。

作者簡介：郜衛(wèi)華（1977—），女，湖北襄陽人，博士，講師，主要從事水產(chǎn)分子營養(yǎng)學研究。E-mail：gwh@126.com。

通信作者：許巧情，博士，教授，主要從事水產(chǎn)分子生物學研究。E-mail：35507883@qq.com。

氧位-甲基轉(zhuǎn)移酶（O-methyltransferase，OMT）是一種轉(zhuǎn)甲基酶，在真菌[1]、細菌[2]、植物[3]等多種生物中普遍存在。根據(jù)甲基受體分子不同，氧位-甲基轉(zhuǎn)移酶的種類也有所不同。在動物中研究最多的2種氧位-甲基轉(zhuǎn)移酶是法呢酸-氧位-甲基轉(zhuǎn)移酶（farnesoic acid-O-methyltransferase，F(xiàn)AMeT）、兒茶酚-氧位-甲基轉(zhuǎn)移酶（catechol-O-methyltransferase，COMT）。COMT是1958年首先在人體中發(fā)現(xiàn)的一種重要代謝酶，廣泛存在于機體各種組織中，如腦、肝、腎、肺等，其主要功能是代謝具有毒性或生物活性的兒茶酚胺類物質(zhì)及降解外界系統(tǒng)的多巴胺[4]。迄今為止，已公布甲殼動物的法呢酸-氧位-甲基轉(zhuǎn)移酶序列包括斑節(jié)對蝦（Penaeus monodon）（AY823409）、凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）（AY823408）、刀額新對蝦（Metapenaeus ensis）（AF333042）、斷溝龍蝦（Penulirus interruptus）（AF249871）、日本長額對蝦（Pandalopsis japonica）（HQ399440）、擬穴青蟹（Scylla paramamosain）（HQ587049）、中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）（GQ861517）、黃道蟹（Cancer pagurus）[5]；而甲殼動物兒茶酚-氧位-甲基轉(zhuǎn)移酶的序列僅在中國明對蝦（Fenneropenaeus chinensis）（DQ091255）和斑節(jié)對蝦（Penaeus monodon）（JN572540）中發(fā)現(xiàn)。據(jù)報道，水產(chǎn)動物的OMTs基因參與病原和細菌感染后的免疫反應(yīng)[6-7]，其中COMT在動物中是否參與免疫反應(yīng)尚未見報道。本研究以凡納濱對蝦為材料，通過RACE（rapid amplification of cDNA ends）技術(shù)克隆獲得凡納濱對蝦COMT基因全長，并對其進行生物信息學分析，進一步利用熒光定量PCR技術(shù)對該基因的組織特異性分布進行分析，以期為該基因免疫作用研究奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1供試動物

試驗用蝦購自廣東海興農(nóng)生物科技有限公司，于廣東海洋大學東海島實驗基地水泥池暫養(yǎng)1周。取健康凡納濱對蝦，經(jīng)滅菌焦碳酸二乙酯（DEPC）水清洗后，先將其冰浴麻醉，冰浴條件下分離肝胰腺、鰓、胃、腸、心臟等5種組織，迅速裝入1.5 mL eppendorf離心管（RNase free），并立即投入液氮速凍，后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2總RNA的提取

取凡納濱對蝦肝胰腺、鰓、胃、腸、心臟等5種組織，按照聯(lián)合基因的Unizol Reagent（GENEray biotechnology，China）操作步驟，研磨、裂解組織后提取總RNA，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳和紫外可見分光光度計對提取的組織總RNA進行定性、定量檢測。

1.3LvCOMT cDNA全長克隆

1.3.1LvCOMT cDNA片段的獲得根據(jù)中國明對蝦COMT保守序列，應(yīng)用Primer Premier5.0軟件設(shè)計正 、反向引物（LvCOMTF1/R1）克隆中間片段，本研究中所有引物（表1）均由上海捷瑞生物工程有限公司合成。PCR反應(yīng)體系為 20 μL，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性1 min，57 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，用PCR產(chǎn)物凝膠回收試劑盒（OMEGA，美國）回收擴增片段，回收后與Easy Digestion T-vector（pED-T）（SinoBio，上海市）載體連接，并轉(zhuǎn)入感受態(tài)細胞DH5α中。挑取陽性克隆菌落送往深圳華大基因公司測序，將所得LvCOMT基因cDNA中間序列于NCBI中進行blastx同源性分析。

1.3.2LvCOMT cDNA3′端和5′端的獲得根據(jù)SMARTerTM RACE cDNA Ampllication Kit（Clontech，美國）和5′RACE System for Rapid Amplification of cDNA ends（Invitrogen，美國）試劑盒操作步驟，分別擴增LvCOMT基因cDNA的3′端和5′端序列，整個過程所需引物序列見表1。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，后續(xù)的DNA回收、連接轉(zhuǎn)化、測序、同源性比對等步驟同“1.3.1”節(jié)。

1.3.3序列分析采用BioEdit軟件將中間序列、3′端序列、5′端序列拼接得到LvCOMT基因全長cDNA序列。設(shè)計正、反向引物（LvCOMTF/LvCOMTR），對該基因進行ORF開放閱讀框克隆以確保全長的正確性。該過程采用Ex Taq DNA聚合酶，PCR反應(yīng)條件：95 ℃變性4 min；95 ℃變性40 s，57 ℃退火1 min；72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃冰箱保存。后續(xù)的DNA回收、測序、同源性比對等步驟同“1.3.1”節(jié)，所用引物序列見表1。

1.3.4LvCOMT cDNA全長生物學信息分析通過NCBI （http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/） 的blastx進行蛋白序列同源性檢索[8]；通過“http：//expasy.pku.edu.cn”網(wǎng)站上 ExPASy 軟件對該cDNA全長進行序列開放閱讀框搜索、蛋白質(zhì)分子量、等電點、氨基酸序列的推斷等；通過“http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP” 網(wǎng)站上SignalP 3.0軟件預(yù)測該基因的信號肽[9]；通過Clustal W1.8軟件進行氨基酸多重序列分析，再結(jié)合MEGA 4.0軟件用鄰接法構(gòu)建NJ系統(tǒng)樹（neighbour-joining tree）[10]。

1.3.5實時熒光定量PCR分析根據(jù)已克隆的LvCOMT基因和β-actin內(nèi)參基因設(shè)計熒光定量表達的特異性正、反向引物LvCOMTF′/LvCOMTR′和β-actinF′/β-actinR′（表1）。使用Fermentas RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit（MBI，LTU）試劑盒合成cDNA第1鏈。具體步驟如下：在冰浴后PCR管中加入1 μg總RNA和1 μL Oligo-dT（15）（0.5 μg/μL），然后再加入DEPC水，配制成10 μL體系，將反應(yīng)管置于PCR儀中，70 ℃預(yù)變性5 min，迅速置于冰上。變性反應(yīng)結(jié)束后，再加入4 μL 5×First-strand緩沖液、2 μL 0.1 mol/L DTT、1 μL RiboLockTM Ribonuclease inhibitor、2 μL dNTP mix（10 mmol/L）后，將PCR管置于PCR儀中，37 ℃孵育5 min，再加入1 μL Superscript Ⅱ （200 U/μL），將PCR管置于PCR儀中反應(yīng)，42 ℃孵育50 min，70 ℃變性10 min，4 ℃保存。實時熒光定量PCR使用SYBRPremix Ex TaqTM（TaKaRa，日本）試劑盒在ABI 7500 Real Time Thermal Cycler熒光定量PCR儀（Applied Biosystem美國應(yīng)用生物系統(tǒng)）中進行。定量數(shù)據(jù)分析采用相對定量中的2-△△Ct法[11]；使用SPSS 13.0軟件進行顯著性分析；用Turkey法進行多重比較分析。

2結(jié)果與分析

2.1LvCOMT全長cDNA序列的克隆及分析

以凡納濱對蝦肝胰腺cDNA為模板，采用分段克隆方法和3′RACE、5′RACE法對COMT基因全長cDNA序列進行克隆，得到全部中間序列（247 bp）和3′末端（560 bp）、5′末端（447 bp）（圖1），采用BioEdit軟件去除重疊序列以及接頭序列后得到910 bp的cDNA全長序列，將獲得的凡納濱對蝦LvCOMT cDNA全長序列提交NCBI，GenBank登錄號為JQ345478。經(jīng)在線軟件（http：//au.expasy.org/tools/dna.html）分析顯示，該基因具有1個起始密碼子（ATG）、1個終止密碼子（TGA）、1個長達666 bp的完整開放閱讀框，此ORF編碼221個氨基酸。該基因5′-UTR即 5′端非編碼區(qū)長99 bp，3′-UTR長145 bp。3′非編碼區(qū)存在1個mRNA不穩(wěn)定基序（ATTTA），未發(fā)現(xiàn)典型的poly（A）+加尾信號AATAAA（圖2）。經(jīng)網(wǎng)絡(luò)在線 （http：//web.expasy.org/compute_pi/）分析，該蛋白分子量為74.9 ku，等電點為 4.98。

2.2LvCOMT cDNA特征的分析

用“http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP”網(wǎng)站上的SignalP 3.0軟件在線預(yù)測該基因是否具有信號肽，發(fā)現(xiàn)開放閱讀框編碼的成熟蛋白沒有信號肽（圖3）。用“http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos”網(wǎng)站上的蛋白磷酸化位點預(yù)測該基因的磷酸化位點，得分超過0.5即為潛在的磷酸化位點[12]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該蛋白共有12個磷酸化位點，其中4個為Ser磷酸化位點，其氨基酸位點分別為6、21、76、149；3個為Thr磷酸化位點，其氨基酸位點分別為125、148、185；5個為Tyr磷酸化位點，其氨基酸位點分別為7、98、140、150、153（圖4）。

[FK（W10][TPGWH33.tif][FK）]

NCBI網(wǎng)站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）蛋白質(zhì)保守區(qū)結(jié)果顯示，該基因有1個由204個氨基酸組成的保守區(qū)，該保守區(qū)位于第18～221個氨基酸殘基之間，該保守區(qū)屬于甲基轉(zhuǎn)移酶-3家族。除了COMT，甲基轉(zhuǎn)移酶-3家族成員還包括咖啡酰輔酶A-氧位-甲基轉(zhuǎn)移酶（caffeoyl-CoA O-methyltransferase，CCoAOMT）和細菌氧位-甲基轉(zhuǎn)移酶（O-methyltransferase，OMT）。

2.3LvCOMT基因序列比對與系統(tǒng)發(fā)育分析

將LvCOMT氨基酸序列與斑節(jié)對蝦、中國明對蝦、舌齒鱸

[FK（W10][TPGWH44.tif][FK）]

（Dicentrarchus labrax）、羅非魚（Oreochromis niloticus）、三文魚（Salmo salar）、虹鱒魚（Oncorhynchus mykiss）、斑馬魚（Danio rerio）的OMT氨基酸序列比較，其一致性為47%～88%，相似性為68%～95%，與斑節(jié)對蝦、中國明對蝦OMT的一致性很高，分別為88%、87%，相似性分別為95%、94%，即本研究克隆的LvCOMT基因和中國明對蝦、斑節(jié)對蝦的OMT具有較高的同源性。使用ClustalW1.83軟件對凡納濱對蝦、斑節(jié)對蝦、中國明對蝦、舌齒鱸、羅非魚、三文魚、虹鱒魚、斑馬魚的COMT氨基酸序列進行氨基酸水平的多重比較（圖5）。

用中國明對蝦（AAZ66373）OMT、斑節(jié)對蝦（AEP84098）OMT、斑節(jié)對蝦（AAX24112）FAMeT、凡納濱對蝦（AAX24111）FAMeT、刀額新對蝦（AAK28535）FAMeT、擬穴青蟹（AEE26196）FAMeT、中華絨螯蟹（ACX30003）FAMeT、斑馬魚（NP_001077312）COMT、小鼠（Mus musculus）（NP_001104533）COMT、人（Homo sapiens）（NP_001128634）COMT、擬南芥（Arabidopsis thaliana）（AAF04440）COMT、煙草（Nicotiana tabacum）（CAA52462）COMT進行系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果顯示凡納濱對蝦COMT基因?qū)儆贑OMTs的新成員，是一種兒茶酚-氧位-甲基轉(zhuǎn)移酶（圖6）。

2.4LvCOMT基因在組織中的表達分布

熒光定量PCR分析顯示，LvCOMT基因在凡納濱對蝦的鰓、肝胰腺、胃腸道、心臟中均有表達（圖7），其表達量由高到低為肝胰腺>腸道>胃>心臟>鰓。肝胰腺中表達量最高，顯著高于其他各組織；鰓、心臟中的LvCOMT表達量最低。

[FK（W11][TPGWH77.tif；S+3mm][FK）]

3結(jié)論與討論

OMT可以催化許多不同功能和調(diào)控作用的大分子、小分子的甲基化反應(yīng)，其不僅在植物、動物的生長、發(fā)育、繁殖方面具有調(diào)控作用[13-14]，而且還參與植物防御與環(huán)境因子的相互作用[15]。OMT轉(zhuǎn)甲基反應(yīng)的化學機制都相同，差別在于甲基受體分子不同，對動物研究較多的2種OMT分別是FAMeT、COMT。研究表明，COMT在代謝動物大腦中的兒茶酚胺類（如去甲腎上腺素、多巴胺等）方面起重要作用[16]。在Mg2+存在時，COMT可催化S腺苷蛋氨酸的1個甲基轉(zhuǎn)移到含兒茶酚結(jié)構(gòu)的底物分子上，從而形成甲基化產(chǎn)物[17]。本研究通過RACE技術(shù)克隆了凡納濱對蝦兒茶酚-氧位-甲基轉(zhuǎn)移酶基因（GenBank登錄號JQ345478）；該基因全長 910 bp，含有1個長達666 bp的開放閱讀框，編碼的成熟肽由221個氨基酸組成；該基因理論分子量為74 872.60 u，等電點為4.98。

COMT研究始于人體中兒茶酚-氧位-甲基轉(zhuǎn)移酶的發(fā)現(xiàn)[14]，繼而陸續(xù)開展了其他物種的COMT相關(guān)生物學功能研究。本研究中，經(jīng)“http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi”網(wǎng)站上蛋白質(zhì)保守區(qū)分析，結(jié)果顯示該基因有1個由204個氨基酸組成的保守區(qū)，該保守區(qū)屬于甲基轉(zhuǎn)移酶-3家族。氨基酸多重比對顯示，LvCOMT氨基酸序列與斑節(jié)對蝦、中國明對蝦、舌齒鱸、羅非魚、三文魚、虹鱒魚、斑馬魚的OMT氨基酸序列的一致性為47%～88%，相似性為68%～95%，與斑節(jié)對蝦、中國明對蝦的OMT一致性很高，分別為88%、87%，相似性分別為95%、94%，與甲殼動物十足目動物的FAMeTs序列一致性很低，即本研究克隆的LvCOMT基因和中國明對蝦、斑節(jié)對蝦的OMT具有較高同源性。系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，凡納濱對蝦COMT與哺乳動物的COMTs屬于同支，屬同種兒茶酚-氧位-甲基轉(zhuǎn)移酶。

在線磷酸化位點和信號肽預(yù)測結(jié)果表明，凡納濱對蝦COMT有12個氨基酸磷酸化位點，沒有信號肽，說明凡納濱對蝦COMT基因可能是依賴12個可能的氨基酸發(fā)生可逆的磷酸化反應(yīng)來進行調(diào)控作用，這與中國明對蝦調(diào)控方式一致[7]。

近年研究表明，水產(chǎn)動物的OMT基因在病原和細菌感染中發(fā)揮重要作用。Tsoi等用SSH技術(shù)對大馬哈魚免疫相關(guān)研究時發(fā)現(xiàn)，OMT基因在誘導后高度上調(diào)表達[6]。李殿香研究表明，中國明對蝦OMT基因在細菌誘導后的上調(diào)表達可能是參與了對抗細菌入侵的免疫防御反應(yīng)[7]。筆者以往研究發(fā)現(xiàn)，COMT基因是在環(huán)境脅迫中發(fā)現(xiàn)的差異表達基因，其與鹽度變化之間存在某種聯(lián)系，具體機制還須要進一步研究[18]。

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