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      一種快速提取微藻完整葉綠體及其DNA的方法

      2016-04-11 18:02潘遠(yuǎn)健金剛謝振華代建國(guó)
      江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2016年2期
      關(guān)鍵詞:提取方法葉綠體微藻

      潘遠(yuǎn)健++金剛++謝振華++代建國(guó)+++王妍++欒崇林++于化泓

      摘要:利用高鹽結(jié)合SDS裂解法,對(duì)杜氏鹽藻、湛江叉鞭金藻、球等鞭金藻葉綠體及其DNA進(jìn)行分離和提取。經(jīng)超聲波勻漿后差速離心,可獲得比較完整的葉綠體,再經(jīng)有機(jī)試劑萃取,可得到產(chǎn)率較高、純度較好的葉綠體DNA,經(jīng)PCR擴(kuò)增得到清晰的條帶。本試驗(yàn)方法快速簡(jiǎn)便,DNA質(zhì)量可以滿足后續(xù)分子生物學(xué)操作需要。

      關(guān)鍵詞:微藻;葉綠體;葉綠體DNA;提取方法

      中圖分類號(hào): Q244;S917文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A文章編號(hào):1002-1302(2016)02-0066-03

      收稿日期:2015-01-15

      基金項(xiàng)目:廣東省深圳市科技項(xiàng)目(編號(hào):JC201005280534A、JCY20130331151022276);廣東省自然科學(xué)基金(編號(hào):10151805501000007)。

      作者簡(jiǎn)介:潘遠(yuǎn)健 (1987—),男,廣西梧州人,碩士研究生,從事基因調(diào)控研究。E-mail:wenrenzhiying@163.com。

      通信作者:金剛,博士,教授,主要從事水生生物學(xué)研究。E-mail:jingang@szpt.edu.cn。葉綠體是綠色植物進(jìn)行光合作用的細(xì)胞器。20世紀(jì)初,學(xué)者根據(jù)植物葉片的花斑現(xiàn)象具有母性遺傳的特性,推斷在葉綠體上或許存在核外的遺傳因子。20世紀(jì)60 年代初,隨著電鏡技術(shù)與分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,葉綠體基因組的存在由Gupta等證實(shí)[1]。目前,葉綠體DNA(cpDNA)被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞質(zhì)遺傳、植物系統(tǒng)發(fā)育、植物雄性不育、親緣關(guān)系、葉綠體轉(zhuǎn)基因等研究中。微藻作為水體生態(tài)系統(tǒng)重要的初級(jí)生產(chǎn)者及潛在的外源基因表達(dá)載體,研究其葉綠體和cpDNA功能、結(jié)構(gòu)特征,對(duì)于葉綠體表達(dá)體系構(gòu)建具有重要作用。因此,快速、簡(jiǎn)便地獲得質(zhì)純、量大cpDNA是許多工作的前提。目前,獲得微藻完整葉綠體和純度高、濃度大的微藻cpDNA存在一定困難,主要原因是微藻種類繁多,每種微藻有其生物學(xué)特點(diǎn),缺乏通用方法;葉綠體DNA含量較少,在提取過程中存在諸多干擾因素 (核DNA、RNA、蛋白質(zhì)等)。

      提取植物cpDNA的傳統(tǒng)方法有CsCl2梯度離心及DNaseⅠ結(jié)合蔗糖梯度離心等,這些方法操作較繁瑣,不易同時(shí)獲得理想的產(chǎn)率、純度。20世紀(jì)80年代至今,在非藻類植物葉綠體提取、微藻葉綠體分離技術(shù)等方面研究成果較多[2-9]。本研究在前人研究的基礎(chǔ)上作了一些改進(jìn)(如離心時(shí)間和速度、藻體破碎方法、葉綠體破碎時(shí)間、DNA分離時(shí)的離心速度和時(shí)間等),提取杜氏鹽藻(Dunaliella salina)、湛江叉鞭金藻(Dicrateria Zhanjiangensis)、球等鞭金藻(Isochrysis galbana)的完整葉綠體,結(jié)果較為滿意。

      1材料與方法

      1.1材料

      杜氏鹽藻、湛江叉鞭金藻、球等鞭金藻由筆者所在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)。

      1.2試劑配制[7]

      緩沖液A:400 mmol/L蔗糖、50 mmol/L Tris-HCl(pH值 8.0)、20 mmol/L EDTA-Na2、0.2% BSA、0.2%巰基乙醇(現(xiàn)用現(xiàn)加);緩沖液B:400 mmol/L蔗糖、50 mmol/L Tris-HCl (pH值 8.0)、0.1% BSA;緩沖液C:1.25 mol/L NaCl、50 mmol/L EDTA、50 mmol/L Tris-HCl(pH值 8.0);緩沖液D:100 mmol/L Tris-HCl(pH值 7.8)、50 mmol/L EDTA、100 mmol/L NaCl、0.2%巰基乙醇(現(xiàn)用現(xiàn)加)。試驗(yàn)所用試劑蛋白酶K、DNase Ⅰ、DNA Maker等購(gòu)于寶生物工程(大連)有限公司。

      1.3分離葉綠體和提取cpDNA[9]

      把生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期的微藻置于0~4 ℃暗處理24 h。將暗處理后的500 mL藻液分裝到50 mL離心管中,4 ℃下 5 500 r/min 離心2 min收集藻細(xì)胞(沉淀),棄上清。往以上所得沉淀加入30 mL緩沖液A,冰上破碎1.5 min得藻體破碎液。將藻體破碎液用6層濾網(wǎng)(300目)過濾,濾液倒入離心管中,4 ℃ 1 000 r/min離心20 min,收集上清。將上清液在4 ℃ 4 000 r/min離心20 min,棄上清,將沉淀保存于4 ℃冰箱備用。DNA酶去核處理:往上一步所得沉淀中加入200 μL 緩沖液B、2.5 μL DNase-Ⅰ、40 μL 0.2 mol/L MgCl2,37 ℃靜置15 min。加入200 μL 0.4 mol/L EDTA-Na2,再加入緩沖液C,4 ℃ 4 000 r/min離心20 min,棄上清。在上一步所得沉淀中加入600 μL 預(yù)冷的緩沖液D,30 μL 20% SDS(終濃度1%),2.5 μL 蛋白酶K(始濃度為1 mg/mL),60 ℃水浴2 h。冷卻后加入等體積的酚 ∶氯仿 ∶異戊醇(25 ∶24 ∶1)混合液,4 ℃ 10 000~12 000 r/min離心10 min,取上清。上清液加入等體積的氯仿:異戊醇= 24 ∶1,4 ℃ 10 000~12 000 r/min離心10 min,取上清。上清加入1/5體積的3 mol/L NaAc及2倍體積預(yù)冷的無水乙醇,-80 ℃放置1 h,然后4 ℃下12 000 r/min離心10 min,棄上清。加入預(yù)冷的75% 乙醇,10 000 r/min離心10 min洗滌1~2次(此步驟要特別小心,重懸DNA時(shí)動(dòng)作要輕緩。操作太劇烈會(huì)機(jī)械斷裂cpDNA)。倒立EP管,自然晾干或置于超凈臺(tái)風(fēng)干。加入30~40 μL 1×TE,-20 ℃保存。

      1.4蔗糖密度梯度法分離球等邊金藻、杜氏鹽藻葉綠體DNA

      參考曲京東的蔗糖梯度離心法[9]分離球等邊金藻、杜氏鹽藻葉綠體DNA,其中2個(gè)蔗糖梯度分別為40%、60%。采用紫外分光光度法檢測(cè)cpDNA的濃度、純度。

      1.5葉綠體rps2基因、rbcL基因片段的擴(kuò)增

      為了驗(yàn)證所提取的cpDNA質(zhì)量,參照NCBI上收錄的杜氏鹽藻rps2基因、球等鞭金藻rbcL基因序列設(shè)置2對(duì)引物:rps1:5′-AGCAAGACGAATACGAGT-3′,rps2:5′-TTTACGACAATTATACCG-3′;rbcL1:5′-AAGCCTCTAATGCAACAC-3′,rbcL2: 5′-CCACAAACTGAAACGAAA-3′。分別以所提取的杜氏鹽藻、球等鞭金藻的cpDNA為模板,進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系如表1所示。

      同時(shí)設(shè)置1個(gè)陰性對(duì)照,驗(yàn)證提取的cpDNA有無基因組DNA污染。利用鹽藻基因組DNA的特異引物對(duì):前:5′ -TGAGCCTGTGCGTGTTTC- 3′;后:5′ -GGTGTCTTGCGTGAGTG -3′,并以所提取的cpDNA、基因組DNA作為模板(表2)。

      2結(jié)果與分析

      2.1葉綠體顯微觀察

      在葉綠體提取的不同階段進(jìn)行顯微觀察,以確定不同階段葉綠體形態(tài)的變化。圖1-a是光學(xué)顯微鏡下完整的杜氏鹽藻細(xì)胞,其形態(tài)呈梭形或球形,隨其運(yùn)動(dòng)的改變而改變,細(xì)胞的一端幾乎完全被葉綠體占據(jù)。圖1-b是經(jīng)過超聲波破碎和差速離心后分離得到的杜氏鹽藻完整葉綠體,在葉綠體周圍可以看到光暈,說明所得葉綠體比較完整,外膜沒有被破壞。圖1-c為蔗糖密度梯度離心所得葉綠體。圖2-a為湛江叉鞭金藻完整細(xì)胞,圖2-b是湛江叉鞭金藻完整的葉綠體。圖3-a為球等鞭金藻完整細(xì)胞,圖3-b、圖3-c分別是球等鞭金藻完整葉綠體。

      2.2cpDNA的電泳檢測(cè)

      將2種方法提取的3個(gè)不同海水藻提到的cpDNA進(jìn)行0.7%瓊脂糖凝膠電泳(110 V/mL,40 min,8 μL ),得到整齊干凈的條帶,如圖4所示。M為maker;1、3、4分別為差速離

      心所提取的杜氏鹽藻cpDNA、球等鞭金藻cpDNA、湛江叉鞭金藻cpDNA;2、5分別為蔗糖梯度離心所得杜氏鹽藻cpDNA、球等鞭金藻cpDNA。

      2.3分光光度計(jì)檢測(cè)cpDNA的濃度和純度

      表3為快速分離法所得cpDNA純度、濃度,表4為蔗糖密度梯度離心法所得cpDNA光密度結(jié)果。由表3可知,快速差速離心抽提到的cpDNA濃度約2.80 μg/mL,D260 nm/D280 nm接近1.8,說明其含量及純度都較為理想,可用于后續(xù)分子操作。由表4可知,蔗糖密度梯度離心法提取的cpDNA濃度約1.00 μg/mL,D260 nm/D280 nm約1.6,這可能跟含有色素雜質(zhì)等有關(guān)。

      2.4葉綠體rps2基因、rbcL基因片段的擴(kuò)增

      rps2、rbcL基因基因都在目的片段長(zhǎng)度處顯示出整齊干凈的條帶(圖5),第3泳道沒有明顯的條帶,與預(yù)期結(jié)果一致。3結(jié)論與討論

      開始分離葉綠體之前,把藻液在黑暗下低溫靜置24 h,可以降低葉綠體中淀粉的含量,減少淀粉核對(duì)葉綠體膜的破壞性,有利于分離得到完整的葉綠體[9]。經(jīng)差速離心以后分離到的葉綠體樣品純度雖然相對(duì)很高,但是仍有來自細(xì)胞核的污染。因此,本試驗(yàn)在保持葉綠體不破碎的前提下(低溫下完整葉綠體比較穩(wěn)定),在葉綠體樣品中加入DNase Ⅰ并于37 ℃靜置15 min以去除來自核DNA的潛在污染。在裂解葉綠體時(shí)先充分重懸,再加入SDS,可提高葉綠體破碎效果,提高cpDNA得率。本研究結(jié)果表明,蔗糖梯度密度分離的葉綠體及其cpDNA濃度都比較低,此外,還存在著2個(gè)不同濃度的蔗糖緩沖液混合時(shí)間過長(zhǎng)就會(huì)相溶在一起,提取的葉綠體層面比較窄,葉綠體得率低的弊端。PTOX1基因在以cpDNA為模板時(shí)沒有明顯的條帶,說明所得DNA純度比較高。

      參考文獻(xiàn):

      [1]Gupta R,Golding G B. The origin of the eukaryotic cells[J]. Trends in Biochemical Sciences,1996,21(5):166-171.

      [2]Bookjans G,Stummann B M,Henningsen. Preparation of chloroplast DNA from pea plastids isolated in a medium of high ionic strength[J]. Anal Biochem,1984,141:244-247.

      [3]高潔,孔繁瑞,李繼耕. 油菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系葉綠體DNA特異片段的分子克隆[J]. 遺傳學(xué)報(bào),1987,14(5):337-343.

      [4]趙衍,翁醒華,鄒勤,等. 水稻葉綠體基因文庫的構(gòu)建和精細(xì)限制圖譜的制作[J]. 遺傳學(xué)報(bào),1991.18(2):149-160.

      [5]龔小松,閻隆飛. 高等植物葉綠體DNA提純方法的改進(jìn)[J]. 科學(xué)通報(bào),1991,36(6):467-469.

      [6]崔彬彬,李云,馮大領(lǐng),等. 楊樹葉綠體分離及葉綠體DNA提取方法的研究[J]. 保定師范??茖W(xué)校學(xué)報(bào),2006,19(2):25-27.

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      [9]曲京東. 杜氏鹽藻完整葉綠體的分離和葉綠體轉(zhuǎn)化體系的構(gòu)建[D]. 鄭州:鄭州大學(xué),2007.翟立紅,周蘭庭,韓鵬,等. 玉米穗行數(shù)基因的QTL定位與分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2016,44(2):69-72.

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