夏卜賢+++安云蓉+++高建明+++羅峰+++陳曉木++李歐靜++王飛揚(yáng)+++石東峰+++關(guān)小楠+++吳宏玉+++裴忠有

摘要：以甜高粱品種羅馬和W452與普通高粱品種忻粱52不同生育時(shí)期的葉片和莖稈為材料，對(duì)總糖、蔗糖含量以及蔗糖合成酶（sucrose synthase，SS）基因表達(dá)規(guī)律進(jìn)行研究。結(jié)果表明：在葉片和莖稈的整個(gè)生育期，蔗糖為總糖的主要組成成分，其含量與總糖含量的變化趨勢(shì)一致；在葉片中，總糖和蔗糖含量從拔節(jié)期開(kāi)始逐漸升高，在灌漿期達(dá)到最高，隨后又下降，同時(shí)通過(guò)對(duì)SS基因表達(dá)規(guī)律研究發(fā)現(xiàn)，SS基因表達(dá)量先于蔗糖含量在開(kāi)花期達(dá)到最高；在莖稈中，蔗糖含量占總糖含量的60%，甜高粱的糖分含量明顯高于普通高粱，完熟期時(shí)糖分含量達(dá)到最高，而SS基因表達(dá)規(guī)律與在葉片中表達(dá)相似，開(kāi)花期達(dá)到最高，隨后有所下降。因此，通過(guò)研究糖分含量變化趨勢(shì)與SS基因表達(dá)規(guī)律為甜高粱分子育種創(chuàng)造了條件。

關(guān)鍵詞：甜高粱；qRT-PCR；糖分積累；蔗糖合成酶；基因表達(dá)；生育期

中圖分類(lèi)號(hào)： S514.01文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2016）02-0133-03

收稿日期：2015-01-05

基金項(xiàng)目：天津市中青年骨干創(chuàng)新人才培養(yǎng)計(jì)劃；天津市科技支撐計(jì)劃（編號(hào)：12ZCZDNC00100）；天津市高校優(yōu)秀青年教師資助。

作者簡(jiǎn)介：夏卜賢（1989—），男，安徽馬鞍山人，碩士研究生，主要從事作物遺傳育種研究。E-mail：beifanglang12689@126.com。

通信作者：裴忠有（1967—），男，遼寧大連人，博士，研究員，主要從事甜高粱育種研究。E-mail：zhongyoupei@tjau.edu.cn。隨著化石能源的日趨枯竭和環(huán)境的日益惡化，發(fā)展生物能源成為未來(lái)解決能源危機(jī)的主要途徑。甜高粱作為普通高粱的一個(gè)變種，因其莖稈糖分、汁液含量高，是目前被公認(rèn)最有發(fā)展前景的能源作物之一，而其總糖、蔗糖含量以及蔗糖合成酶（sucrose synthase，SS）基因調(diào)節(jié)蔗糖合成代謝已成為研究熱點(diǎn)。謝鳳周對(duì)甜高粱品種麗歐的總糖含量變化趨勢(shì)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)在整個(gè)生育時(shí)期呈逐漸增加的趨勢(shì)，在完熟期達(dá)到最高[1]；楊相坤等對(duì)蔗糖含量在整個(gè)生育時(shí)期的變化進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)從孕穗期到蠟熟期呈逐漸升高、在蠟熟期達(dá)到最高值后又略有下降趨勢(shì)[2-3]。通過(guò)對(duì)甜高粱莖稈汁液化學(xué)成分的分析發(fā)現(xiàn)，蔗糖是其主要成分，占55%左右[4]。而蔗糖受作為調(diào)節(jié)植物蔗糖代謝的關(guān)鍵酶之一SS的調(diào)節(jié)，該酶在小麥胚芽中被首次發(fā)現(xiàn)[5-7]，它參與淀粉、纖維素和ATP 等的合成，調(diào)動(dòng)蔗糖進(jìn)入各種代謝途徑，且可逆合成和分解蔗糖，進(jìn)而調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)過(guò)程等[8]；該酶在番茄中控制蔗糖的合成及運(yùn)轉(zhuǎn)，保持相對(duì)較強(qiáng)的活性[9]；該酶在甘蔗中有利于運(yùn)輸過(guò)程中將庫(kù)器官的蔗糖卸出[10]，在多數(shù)植物中存在2種同工酶SS1和SS2，其中SS1主要分解蔗糖，SS2主要合成蔗糖[11]，并且利用酶聯(lián)免疫法（ELISA）驗(yàn)證了蔗糖合成酶表達(dá)量與蔗糖含量具有顯著的相關(guān)性[12]。本研究測(cè)定了普通高粱及甜高粱的葉片和莖稈中糖分含量，分析了SS基因的表達(dá)量，這對(duì)進(jìn)一步了解葉片、莖稈中的糖分積累與SS基因表達(dá)之間的關(guān)系具有非常重要的意義。

1材料與方法

1.1材料種植及取樣

本試驗(yàn)所用甜高粱品種為羅馬和W452，普通高粱品種為忻粱52，均由天津農(nóng)學(xué)院高粱育種課題組提供。試驗(yàn)分別于2011年和2012年在天津農(nóng)學(xué)院作物標(biāo)本園進(jìn)行，試驗(yàn)地前茬為玉米，土壤肥力偏低。5月1日播種，設(shè)3次重復(fù)，每個(gè)小區(qū)面積30 m2，行長(zhǎng)4 m，行距0.5 m，株距0.2 m；播種時(shí)每個(gè)小區(qū)施底肥硫酸鉀和復(fù)合肥各0.075 kg；中耕除草3次。分別在拔節(jié)期、孕穗期、抽穗期、開(kāi)花期、灌漿期和完熟期等6個(gè)生育時(shí)期隨機(jī)重復(fù)3次取樣，取材部位為植株中部莖稈和完全展開(kāi)的葉片，一部分用于測(cè)定樣品的各種糖分含量，另一部分用液氮速凍后置于-80 ℃冰箱內(nèi)保存，用于研究葉片及莖稈中蔗糖合成酶基因的表達(dá)規(guī)律。

1.2試劑

測(cè)量總糖含量所用試劑包括酒石酸鉀鈉（C4H4O6KNa·4H2O）、硫酸銅（CuSO4·5H2O）、無(wú)水葡萄糖（C6H12O6）、氫氧化鈉（NaOH）、亞鐵氰化鉀[K4F4（CN）6·3H2O]、次甲基藍(lán)（C16H18CIN3S·3H2O）、鹽酸（HCl），均購(gòu)自天津北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠。測(cè)量蔗糖含量所用試劑包括色譜純乙腈、果糖標(biāo)準(zhǔn)品、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品、蔗糖標(biāo)準(zhǔn)品，均購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所。RNA提取試劑盒購(gòu)自北京百泰克（Bioteke）公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于北京康為世紀(jì)公司，定量反應(yīng)中的內(nèi)參基因β-actin及SS基因引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3蔗糖和總糖含量的測(cè)定

高粱莖稈和葉片通過(guò)榨汁處理后分成2份，分別用于總糖和蔗糖含量的測(cè)定，簡(jiǎn)單步驟為：向10 mL樣品中加入1 mL 濃硫酸，混勻，68 ℃水解10 min，隨后使用SGD-Ⅳ型全自動(dòng)還原糖測(cè)定儀測(cè)定汁液中的總糖含量，采用高效液相色譜儀（安捷倫CP-3800）測(cè)定樣品中的蔗糖含量，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次。

1.4總RNA的提取與分析

根據(jù)百泰克公司RNA提取試劑盒的說(shuō)明提取高粱葉片和莖稈的總RNA。將提取的RNA溶于溶解液（TE Buffer）后，使用微量核酸測(cè)定儀檢測(cè)其純度和濃度，并取1 μL的RNA樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，以確定所提取RNA的完整性。

1.5利用qRT-PCR分析蔗糖合成酶基因的表達(dá)

本試驗(yàn)應(yīng)用Primer 5、Oligo 6 等軟件在甜高粱SS基因Susy2（FJ513325）跨內(nèi)含子區(qū)設(shè)計(jì)正向引物5′-GTCCCTCAAGACACTCCCT-3′和反向引物5′-ATTGGATTGGGCAAAGTAG-3′；高粱β-actin基因引物，其正向序列為5′-ACGGCCTGGATGGCGACGTACATG-3′，反向序列為5′-GCAGAAGGACGCCTACGTTGTGTAC-3′。按北京康為世紀(jì)公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說(shuō)明將RNA樣品反轉(zhuǎn)成cDNAs。cDNAs合成后，將cDNA以10倍梯度稀釋成5個(gè)濃度，使用ABI公司的7 500 fast熒光定量PCR儀分別擴(kuò)增靶基因SS和內(nèi)參基因β-actin，根據(jù)2個(gè)基因的循環(huán)數(shù)與初始模板濃度制備2個(gè)基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行擴(kuò)增效率的檢測(cè)。擴(kuò)增體系如下：cDNAs 2 μL，依次加入12.5 μL的2×Ultra SYBR Mixture，10 μmol/L上下游引物各1 μL，最后加入RNase-Free的水補(bǔ)至25 μL。實(shí)時(shí)熒光定量PCR的擴(kuò)增程序如下：預(yù)變性95 ℃10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)。溶解曲線程序?yàn)椋?5 ℃15 s；60 ℃1 min；95 ℃15 s；60 ℃15 s。每個(gè)樣本進(jìn)行3次重復(fù)，同時(shí)設(shè)置無(wú)模板陰性作對(duì)照。在反應(yīng)結(jié)束后儀器會(huì)自動(dòng)生成熔解曲線圖及樣品的循環(huán)數(shù)（CT）。

2結(jié)果與分析

2.1不同生育時(shí)期葉片中總糖和蔗糖含量的變化

為了解作為糖分合成部位——葉片中糖分的變化情況，本試驗(yàn)對(duì)甜高粱品種羅馬和W452與普通高粱品種忻粱52不同生育時(shí)期總糖和蔗糖含量進(jìn)行測(cè)定。由圖1、圖2可以看出，3個(gè)品種糖分含量都呈現(xiàn)出從拔節(jié)期至灌漿期一直上升而到完熟期又有所下降的趨勢(shì)，3個(gè)品種葉片中的糖分含量在開(kāi)花期和灌漿期比較接近；從整個(gè)生育時(shí)期來(lái)看，3個(gè)品種的糖分含量在灌漿期都有1個(gè)突然升高的過(guò)程，可能這一時(shí)期是糖分合成的活躍期，等到完熟期時(shí)，大量糖分被運(yùn)輸至莖稈或穗子中，所以此時(shí)又呈下降趨勢(shì)。

2.2不同生育時(shí)期莖稈中總糖和蔗糖含量的變化

甜高粱為普通高粱的一個(gè)變種，它的莖稈已經(jīng)成為糖分儲(chǔ)存的庫(kù)，而普通高粱的莖稈只是作為糖分轉(zhuǎn)移的流。從圖3、圖4可以看出，W452和忻粱52總糖和蔗糖含量從拔節(jié)期開(kāi)始逐漸升高，灌漿期時(shí)達(dá)到最高值，隨后在完熟期又有所下降；而羅馬的總糖和蔗糖含量則在完熟期達(dá)到最高值，這種變化趨勢(shì)與葉片中的糖分積累規(guī)律基本一致，同樣甜高粱莖稈中的糖分在灌漿期也有1個(gè)突然升高的過(guò)程，但忻粱52莖稈中的總糖和蔗糖含量與甜高粱相比在各個(gè)時(shí)期都比較低，這可能是因?yàn)楣酀{期時(shí)葉片中大量合成的蔗糖流向庫(kù)器官——

穗，很少在莖稈中儲(chǔ)存，導(dǎo)致莖稈中的糖分含量比較低，而甜高粱的庫(kù)器官除了穗以外還有莖稈，因此甜高粱莖稈中總糖和蔗糖含量明顯高于普通高粱莖稈；同時(shí)本試驗(yàn)還在3個(gè)品種中進(jìn)行蔗糖和總糖含量的相關(guān)性分析，結(jié)果表明，不同高粱品種莖稈內(nèi)的蔗糖和總糖含量都呈現(xiàn)出極顯著相關(guān)（r>0.98，P<0.01），蔗糖含量約占總糖含量的60%。

2.3不同生育時(shí)期葉片中SS基因表達(dá)分析

SS基因是植物蔗糖合成重要的調(diào)節(jié)基因，本試驗(yàn)利用qRT-PCR方法對(duì)3個(gè)高粱品種羅馬、W452與忻粱52的不同生育時(shí)期葉片中的SS基因表達(dá)進(jìn)行分析。從圖5可以看出，以拔節(jié)期的表達(dá)量作為參照，SS基因在不同高粱品種中的表達(dá)量均呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，開(kāi)花期達(dá)到最高，此時(shí)羅馬、W452和忻粱52的表達(dá)量分別是拔節(jié)期的7.8、10.5、1.8倍，可見(jiàn)2個(gè)甜高粱品種變化幅度較忻粱52明顯，忻粱52葉片中SS基因在不同生育時(shí)期的表達(dá)量變化差異不大。

2.4不同生育時(shí)期莖稈中SS基因表達(dá)分析

莖稈為甜高粱糖分的主要儲(chǔ)藏器官，了解莖稈中SS基因的表達(dá)與甜高粱中蔗糖積累的關(guān)系具有非常重要的意義。本試驗(yàn)對(duì)羅馬、W452和忻粱52的各個(gè)時(shí)期莖稈中SS基因的表達(dá)量進(jìn)行分析（圖6）。在整個(gè)生育時(shí)期，SS基因在3個(gè)品種內(nèi)的表達(dá)量均呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，至開(kāi)花期表達(dá)量最高，此時(shí)羅馬、W452和忻粱52的表達(dá)量分別為拔節(jié)期的5.0、5.1、1.7倍，說(shuō)明SS基因在甜高粱品種中的表達(dá)量明顯比普通高粱高，而且SS基因在忻粱52各個(gè)生育期中的表達(dá)量變化差異不大，該結(jié)果與葉片中SS基因的表達(dá)量變化趨勢(shì)一致，但是表達(dá)量明顯比葉片中的少。

2.5高粱SS基因表達(dá)與蔗糖含量的相關(guān)性分析

通過(guò)以上蔗糖和SS基因在葉片和莖稈整個(gè)生育時(shí)期的變化趨勢(shì)可以看出，SS基因的變化趨勢(shì)與蔗糖含量的變化趨勢(shì)基本表現(xiàn)一致，但SS基因表達(dá)量的最高峰是在開(kāi)花期，蔗糖含量最高峰出現(xiàn)在灌漿期，主要因?yàn)殚_(kāi)花期蔗糖合成活躍，但開(kāi)花這一生理過(guò)程會(huì)消耗植物大量的能量[13]，以致流向庫(kù)器官中的蔗糖少，所以在灌漿期之前蔗糖積累緩慢；到了灌漿期，雖然SS基因的表達(dá)量有所下降，但高粱生長(zhǎng)發(fā)育的幾大耗能過(guò)程已結(jié)束，此時(shí)合成的蔗糖開(kāi)始積累，導(dǎo)致葉片和莖稈中的蔗糖含量在灌漿期有1個(gè)短暫快速的積累過(guò)程。因此，總的來(lái)說(shuō)SS基因的表達(dá)與蔗糖積累具有一定的相關(guān)關(guān)系。

3結(jié)論與討論

高粱為重要的能源和飼料作物，已為世界各國(guó)所認(rèn)同[14]。甜高粱莖稈無(wú)論是用來(lái)生產(chǎn)燃料乙醇還是用作青貯飼料，了解其糖分組成及決定因素對(duì)提高糖分含量具有重要意義。結(jié)果表明，蔗糖是甜高粱糖分的主要成分，而先前對(duì)蔗糖含量的相關(guān)性研究大都基于酶活性的測(cè)定，酶活性分析容易受提取過(guò)程和外界因素的影響，不一定能完全反映兩者之間的關(guān)系[15]。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)不同高粱品種葉片和莖稈中糖分含量的測(cè)定與SS基因表達(dá)量的比較，獲得更直接的與糖分積累相關(guān)的數(shù)據(jù)。

從生理上來(lái)說(shuō)，葉片是高粱的源器官，蔗糖在葉片中合成后經(jīng)長(zhǎng)距離運(yùn)輸?shù)綆?kù)器官。本研究結(jié)果表明，葉片中總糖和蔗糖含量的變化呈“山峰”的變化趨勢(shì)，灌漿期時(shí)糖分含量達(dá)到最高值，但是通過(guò)對(duì)SS基因表達(dá)規(guī)律的研究發(fā)現(xiàn)，SS基因表達(dá)量先于蔗糖含量在開(kāi)花期達(dá)到最高，即糖分含量的積累具有一定的延后性。

普通高粱的穗是其唯一的“庫(kù)”，而甜高粱作為普通高粱的變種具有2個(gè)庫(kù)器官——穗和莖稈。相較于普通高粱而言，甜高粱莖稈中總糖和蔗糖的積累明顯提高，完熟期時(shí)糖分含量達(dá)到最高值，而SS基因的表達(dá)規(guī)律與在葉片中相似，開(kāi)花期表達(dá)量達(dá)到最高值，隨后有所下降。甜高粱莖稈在開(kāi)花期之前蔗糖含量普遍較低，并且不同品種的差異并不大，從灌漿期開(kāi)始，蔗糖大量積累，到完熟期時(shí)甜高粱莖稈中蔗糖含量高于普通高粱忻粱52將近6倍，這與陳維維等的研究結(jié)論[16-17]相似。但從2個(gè)甜高粱品種整個(gè)生育時(shí)期莖稈中糖分含量的變化來(lái)看，W452從拔節(jié)期到開(kāi)花期呈上升趨勢(shì)，灌漿期達(dá)到最大值后略有下降，這一結(jié)果與張華文等的研究結(jié)論[18]一致，而羅馬直到完熟期時(shí)才達(dá)到最大值，其結(jié)果與麗歐品種的特性[1]相似，這可能是因?yàn)榱_馬（生育期為190 d）的生育期比W452（132 d）長(zhǎng)的原因，測(cè)定羅馬完熟期糖分時(shí)已是深秋，低溫條件降低了細(xì)胞的呼吸強(qiáng)度，使得糖分一直處于不斷積累的過(guò)程。

從拔節(jié)期開(kāi)始，SS基因的表達(dá)量一直呈緩慢上升的趨勢(shì)，到開(kāi)花期突然增高，此時(shí)合成的大量蔗糖主要供給開(kāi)花過(guò)程[13]，隨著這一耗能過(guò)程的結(jié)束，光合產(chǎn)物開(kāi)始往儲(chǔ)藏器官中運(yùn)輸。雖然隨后SS基因的表達(dá)量有所下降，但此時(shí)甜高粱莖稈中的蔗糖含量積累速度仍然大于消耗速度，這也正是在生長(zhǎng)后期糖分不斷積累的原因。本試驗(yàn)結(jié)果表明，SS基因很可能是影響糖分差異的主要基因，說(shuō)明在以后育種上可以根據(jù)SS基因的表達(dá)量為指標(biāo)篩選獲得優(yōu)質(zhì)的甜高粱品種。

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