吳培培++馮磊++唐應(yīng)華++褚軒+王偉峰+侯繼波

摘要：為了獲得用生物反應(yīng)器無血清培養(yǎng)基微載體懸浮培養(yǎng)Vero細(xì)胞增殖傳染性法氏囊病毒（infectious bursal disease virus，IBDV）的工藝參數(shù)，通過馴化Vero細(xì)胞適應(yīng)無血清微載體懸浮培養(yǎng)后，再優(yōu)化傳染性法氏囊病毒在此細(xì)胞上的增殖工藝參數(shù)，包括初始細(xì)胞密度、微載體濃度、IBDV的感染復(fù)數(shù)（MOI）、接種時(shí)間和病毒收獲時(shí)間。結(jié)果表明：獲得適應(yīng)無血清培養(yǎng)的細(xì)胞株——V0株，建立細(xì)胞庫。獲得3 L反應(yīng)器中培養(yǎng)V0細(xì)胞增殖IBDV工藝參數(shù)，其初始接種密度為3×105 cell/mL、微載體濃度為3 g/L、細(xì)胞培養(yǎng)1 d后按MOI為0.2接種IBDV，接毒后120 h收獲病毒，可達(dá)最高病毒效價(jià)109.307 TCID50/mL。本研究獲得的Vero細(xì)胞、IBDV以及各項(xiàng)工藝參數(shù)為后續(xù)大規(guī)模懸浮培養(yǎng)制備法氏囊疫苗提供了生物材料和技術(shù)支持。

關(guān)鍵詞：無血清培養(yǎng)；Vero細(xì)胞；傳染性法氏囊病毒（IBDV）；微載體；生物反應(yīng)器；增殖工藝

中圖分類號(hào)： S858.31文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2016）02-0244-03

收稿日期：2015-02-03

基金項(xiàng)目：江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金[編號(hào)：CX（15）5045]。

作者簡(jiǎn)介：吳培培（1982—），女，江蘇南通人，碩士，助理研究員，從事獸用生物制品工程技術(shù)研究。 Tel：（025）84392018；E-mail：wupeipei2015@163.com。

通信作者：侯繼波，男，山東德州人，博士，研究員，從事獸用生物制品工程技術(shù)研究。E-mail：houjibo@jaas.ac.cn。雞傳染性法氏囊病（infectious bursal disease，IBD），是由傳染性法氏囊病毒（IBDV）引起的雞的一種高度接觸性傳染病[1]。1980年以后該病傳入我國并大面積暴發(fā)和持續(xù)流行，嚴(yán)重影響了我國養(yǎng)雞業(yè)的發(fā)展，當(dāng)前對(duì)于該病采用接種疫苗進(jìn)行預(yù)防[2]。目前，國內(nèi)生產(chǎn)IBDV疫苗大部分采用雞胚成纖維細(xì)胞增殖病毒，在培養(yǎng)過程中需添加一定量胎牛血清或小牛血清，以提供細(xì)胞生長(zhǎng)增殖所必需的各種生長(zhǎng)因子。隨著動(dòng)物細(xì)胞無血清培養(yǎng)技術(shù)的不斷進(jìn)步，無血清培養(yǎng)已成為包括疫苗在內(nèi)的生物技術(shù)藥物生產(chǎn)的總趨勢(shì)[3-4]。當(dāng)前國內(nèi)疫苗生產(chǎn)方式延用了傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室滾瓶培養(yǎng)方式，由于每個(gè)轉(zhuǎn)瓶的細(xì)胞質(zhì)量、病毒產(chǎn)量和滴度都不同，導(dǎo)致疫苗的批間差很大。隨著生物反應(yīng)器的發(fā)展，大規(guī)模轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞疫苗工藝技術(shù)向生物反應(yīng)器培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞疫苗工藝技術(shù)的轉(zhuǎn)變成為必然[5-6]。本研究對(duì)從美國組織細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)菌種保藏中心（ATCC）引進(jìn)的10%小牛血清培養(yǎng)的Vero細(xì)胞進(jìn)行無血清馴化，最終獲得無血清培養(yǎng)Vero細(xì)胞株；在實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模微載體懸浮培養(yǎng)無血清Vero細(xì)胞，并優(yōu)化IBDV的增殖條件，病毒能夠高效增殖且免疫原性好，為后期大規(guī)模微載體懸浮培養(yǎng)無血清Vero細(xì)胞增殖IBDV提供研究基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1細(xì)胞和病毒

Vero細(xì)胞由國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心（簡(jiǎn)稱“中心”）購自ATCC，以10% FCS DMEM傳代培養(yǎng)，并建立Vero細(xì)胞原始庫；IBDV為中心保藏毒種。

1.2試劑與儀器

無血清培養(yǎng)基：不含血清，也不含任何動(dòng)物來源成分的無血清培養(yǎng)基，購于GIBCO公司，設(shè)計(jì)用于數(shù)種腎臟來源細(xì)胞系的生長(zhǎng)。筆者所在實(shí)驗(yàn)室通過培養(yǎng)基成分優(yōu)化，添加適量的生長(zhǎng)因子使該培養(yǎng)基更加適合細(xì)胞生長(zhǎng)[7]。

微載體購自GE公司。用無Ca2+、Mg2+離子的磷酸緩沖液清洗并浸泡3 h后，經(jīng)121 ℃高壓蒸汽滅菌25 min，冷卻后儲(chǔ)于4 ℃密封待用。使用前用37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)液清洗2遍。

3 L動(dòng)物細(xì)胞反應(yīng)器購于荷蘭Applikon Biotechnology公司，反應(yīng)器培養(yǎng)工作體積0.5～2.7 L，具有溶氧（DO）、pH值、溫度、轉(zhuǎn)速及四氣（N2、O2、CO2及空氣） 控制系統(tǒng)。

1.3Vero細(xì)胞無血清適應(yīng)培養(yǎng)[8]

將ATCC引進(jìn)Vero細(xì)胞，采用無血清直接適應(yīng)法培養(yǎng)。簡(jiǎn)述如下：Vero細(xì)胞在含10% 胎牛血清（FCS）的DMEM中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用胰酶消化后，離心，用無血清培養(yǎng)基重懸后計(jì)數(shù)，按照1×105 cell/mL細(xì)胞量，以無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞活性，及時(shí)換液，去除死亡細(xì)胞，最終獲得無血清培養(yǎng)Vero細(xì)胞株V0，并凍存。

1.4細(xì)胞接種量和微載體濃度的優(yōu)化

將馴化后的V0細(xì)胞消化后以1×105、3×105、5×105 cell/mL的初始接種密度分別接種到含有1、3、5 g/L微載體中。細(xì)胞在3 L反應(yīng)器中培養(yǎng)，pH值7.0～7.2、DO飽和度50%、攪拌轉(zhuǎn)速60～80 r/min、溫度37 ℃。每天取樣觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)并計(jì)數(shù)。采用Nova 400全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)基中的葡萄糖（Gluc）、谷氨酰胺（Gln）、乳酸（Lac）和銨離子（NH4+）等營(yíng)養(yǎng)成分及代謝產(chǎn)物的含量，試驗(yàn)結(jié)果用OriginPro 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.5病毒接種量和收獲時(shí)間的優(yōu)化

在3 L反應(yīng)器中，V0細(xì)胞接種量為3×105 cell/mL、微載體濃度為3 g/L，pH值7.0～7.2、DO飽和度50%、攪拌轉(zhuǎn)速60～80 r/min、溫度37 ℃。培養(yǎng)1 d后，將IBDV病毒分別以不同的病毒感染復(fù)數(shù)（MOI）0.2、0.5、1感染V0細(xì)胞，37 ℃培養(yǎng)，分別于感染后的24、48、72、96、120、144 h取樣收獲病毒，反復(fù)凍融3次后，取上清在CEF細(xì)胞上檢測(cè)病毒的50%組織細(xì)胞感染量（TCID50），篩選出合適的病毒接種量和收獲時(shí)間。

2結(jié)果與分析

2.1獲得適應(yīng)無血清培養(yǎng)的Vero細(xì)胞

經(jīng)直接無血清適應(yīng)，篩選獲得能在無血清培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的Vero細(xì)胞。在適應(yīng)過程中，細(xì)胞外觀表現(xiàn)為逐漸拉長(zhǎng)，但仍為上皮樣細(xì)胞樣特性（圖1-A）。細(xì)胞生長(zhǎng)速度較有血清條件下緩慢，一般需2 d才能達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。經(jīng)逐步傳代適應(yīng)后，無血清培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期提前至1 d，與正常有血清培養(yǎng)的Vero細(xì)胞生長(zhǎng)接近。

2.2最佳初始接種密度為3×105 cell/mL

采用3 g/L的微載體，V0細(xì)胞的初始接種量分別為1×105、3×105、5×105 cell/mL，每天取樣觀察細(xì)胞狀態(tài)、計(jì)數(shù)及培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分分析。細(xì)胞初始接種密度過低（1×105 cell/mL）時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)缺乏初始密度效應(yīng)而造成生長(zhǎng)相對(duì)緩慢，細(xì)胞終密度也相對(duì)較低。細(xì)胞初始接種密度為3×105 cell/mL時(shí)，接種后6 h細(xì)胞貼附到微載體上，細(xì)胞黏球率（每個(gè)微載體上黏附的細(xì)胞表面積占微載體總面積比例）為25%，培養(yǎng)2 d后細(xì)胞開始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞黏球率為50%，培養(yǎng)至4 d，細(xì)胞達(dá)到最大密度1.18×106 cell/mL，黏球率95%以上（圖1-B）。細(xì)胞密度過高（5×105 cell/mL），初始占球率就比較高，約50%左右，細(xì)胞生長(zhǎng)空間有限。

對(duì)不同初始密度接種的細(xì)胞培養(yǎng)條件進(jìn)行取樣檢測(cè)，主要檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)基中的Gluc、Glu、Lac和NH4+營(yíng)養(yǎng)成分及代謝產(chǎn)物的含量。檢測(cè)結(jié)果（圖2）表明，較高的初始接種密度（5×105 cell/mL）會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)液中的Gluc、Glu消耗過快，在生長(zhǎng)過程中累積較多的Lac和NH+4。細(xì)胞初始密度為3×105 cell/mL時(shí)，細(xì)胞均勻分布于每個(gè)微載體表面，同時(shí)也為后續(xù)預(yù)留了充裕的生長(zhǎng)空間，細(xì)胞生長(zhǎng)良好，最終獲得較高細(xì)胞終密度。

2.3最佳微載體濃度為3 g/L

采用細(xì)胞的初始接種量3×105 cell/mL，微載體濃度分別為1、3、5 g/L，取樣觀察細(xì)胞狀態(tài)、計(jì)算細(xì)胞數(shù)量，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，結(jié)果（圖3）表明，微載體濃度偏低（1 g/L）時(shí)，細(xì)胞相對(duì)微載體偏多，導(dǎo)致初始黏球率高，在50%以上，細(xì)胞后期缺乏生長(zhǎng)空間。微載體濃度為3 g/L時(shí)，接種后6 h細(xì)胞貼附到微載體上，黏球率約為25%；培養(yǎng)2 d后細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，黏球率約為50%，培養(yǎng)至4 d，細(xì)胞達(dá)到最大密度1.18×106 cell/mL，黏球率95%以上（圖4）。微載體濃度偏高（5 g/L）時(shí)，會(huì)導(dǎo)致初始黏球率偏低，約10%以下，與微載體數(shù)量相比，細(xì)胞數(shù)量相對(duì)較低，細(xì)胞生長(zhǎng)因缺乏初始密度效應(yīng)而造成生長(zhǎng)相對(duì)緩慢。

2.4最佳病毒接種量為0.2 MOI和收獲時(shí)間為120 h

V0細(xì)胞微載體懸浮培養(yǎng)，初始接種密度3×105 cell/mL、微載體濃度3 g/L，培養(yǎng)24 h后，細(xì)胞100%貼附微載體，分別

按照0.2、0.5和1的MOI感染Vero細(xì)胞，37 ℃培養(yǎng)5 d后收獲病毒液，反復(fù)凍融3次后，取上清在CEF細(xì)胞上檢測(cè)病毒的TCID50。檢測(cè)結(jié)果表明，接種0.2 MOI的IBDV，感染V0細(xì)胞120 h后，收獲病毒，病毒效價(jià)可達(dá)109.368 TCID50/mL（表1）。IBDV病毒感染24 h后，取樣觀察細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)量增多，無脫落現(xiàn)象，病毒效價(jià)沒有增長(zhǎng)；感染72 h后，細(xì)胞開始出現(xiàn)部分脫落現(xiàn)象，病毒效價(jià)開始增長(zhǎng)；感染96～120 h，病毒效價(jià)明顯增長(zhǎng)，大部分細(xì)胞從微載體上脫落；感染144 h后，病毒效價(jià)開始降低（表1）。

3討論與結(jié)論

在生物反應(yīng)器中以持續(xù)攪拌的方式用微載體懸浮培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞，與滾瓶培養(yǎng)細(xì)胞方式相比，前者營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、氣體及熱量的傳遞更加充分均勻，為細(xì)胞生長(zhǎng)及病毒增殖提供相對(duì)優(yōu)質(zhì)、恒定的培養(yǎng)環(huán)境，整個(gè)生物過程控制精確，易于重復(fù)。所以采用生物反應(yīng)器微載體懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，制備抗原，更有利于保證疫苗產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，并有利于規(guī)模化放大[9]。以生物反應(yīng)器微載體懸浮培養(yǎng)Vero細(xì)胞增殖IBDV技術(shù)將成為我國獸用疫苗生產(chǎn)的趨勢(shì)。

本研究馴化獲得無血清培養(yǎng)的Vero細(xì)胞株，并對(duì)其在實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模培養(yǎng)條件下增殖IBDV的條件進(jìn)行優(yōu)化。采用3種不同細(xì)胞接種量分別接種3種不同濃度的微載體，結(jié)果表明，細(xì)胞接種量在3×105 cells/mL、微載體濃度在3 g/L時(shí)，細(xì)胞增殖狀態(tài)良好，細(xì)胞最終密度達(dá)到1.18×106 cell/mL。本次結(jié)果與賈涵婧等的結(jié)果[10]一致，即當(dāng)1個(gè)微載體周圍的細(xì)胞數(shù)控制在一定范圍之內(nèi)，能夠使細(xì)胞生長(zhǎng)獲得一個(gè)較為穩(wěn)定的平臺(tái)期。葡萄糖、谷氨酰胺等營(yíng)養(yǎng)物不會(huì)消耗過多以致耗竭，而乳酸、銨等代謝副產(chǎn)物的累積對(duì)培養(yǎng)環(huán)境造成的壓力較小，有利于細(xì)胞生長(zhǎng)，最終獲得一個(gè)比較高的細(xì)胞密度。

病毒接種量過高，會(huì)產(chǎn)生大量的不完全病毒；病毒接種量過低，又會(huì)影響病毒的產(chǎn)量[8]。本研究結(jié)果亦提示，MOI為0.2時(shí)，接毒后96～120 h IBDV的TCID50最高。IBD病毒感染Vero細(xì)胞后72～96 h，病毒效價(jià)開始上升，120 h后病毒效價(jià)達(dá)到峰值，144 h后病毒效價(jià)有所下降，故確定IBD病毒適宜的收獲時(shí)間為120 h。

綜上所述，本試驗(yàn)優(yōu)化了無血清微載體培養(yǎng)Vero細(xì)胞和增殖IBD病毒的實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模培養(yǎng)的適宜條件，采用Applikon的3 L生物反應(yīng)器對(duì)無血清Vero細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，控制細(xì)胞培養(yǎng)的溫度、溶氧、pH值，進(jìn)行不同細(xì)胞量、微載體濃度、病毒接種量和收毒時(shí)間的優(yōu)化，為應(yīng)用大型生物反應(yīng)器大規(guī)模制備IBDV疫苗奠定了基礎(chǔ)。

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