傅里葉變換紅外光譜對滇重樓生長年限的鑒別研究

劉飛++楊春艷++道永艷++楊會云++王元忠

摘要：用傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）結(jié)合光譜軟件Omnic 8.0中光譜檢索的方法對同一產(chǎn)地滇重樓樣品進行生長年限的鑒別研究。測試了68株、7種不同生長年限滇重樓主根木質(zhì)部樣品的紅外光譜，利用Omnic 8.0軟件建立了Paris0、Paris1、Paris2、Paris4等4個光譜庫，所有光譜庫均分別由每個生長年限任意6株主根木質(zhì)部樣品的平均紅外光譜、平均一階導數(shù)光譜、平均二階導數(shù)光譜和平均四階導數(shù)光譜組成。各樣品紅外光譜及其導數(shù)光譜分別與相應的光譜庫進行光譜檢索來鑒別樣品的生長年限，比較了紅外光譜及其3種導數(shù)光譜在相關(guān)性、絕對微分差、平方微分差3種檢索算法，以及1 800～900 cm-1、1 800～500 cm-1、全光譜（4 000～400 cm-1）3個檢索范圍的鑒別效果。結(jié)果表明：紅外四階導數(shù)光譜、絕對微分差算法、全光譜范圍的檢索鑒別效果較好；基于主根木質(zhì)部樣品四階導數(shù)紅外光譜在全光譜范圍、絕對微分差算法的光譜檢索對滇重樓生長年限鑒別正確率為86.8%。由結(jié)果看出，F(xiàn)TIR結(jié)合光譜檢索的方法可以鑒別滇重樓生長年限，為重樓藥材生長年限的鑒定提供了一種新思路。

關(guān)鍵詞：傅里葉變換紅外光譜；光譜檢索；滇重樓；生長年限；鑒別

中圖分類號： O657.33文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）02-0300-04

收稿日期：2015-08-09

基金項目：國家自然科學基金（編號：81460584）；云南省大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃（編號：201411390003）。

作者簡介：劉飛（1974—），男，云南江川人，碩士，副教授，主要從事生物紅外光譜研究。E-mail：yxtclf@163.com。

通信作者：王元忠，碩士，副研究員，主要從事藥用植物資源評價研究。E-mail：yzwang1981@126.com。滇重樓（云南重樓）[ Paris polyphylla Smith var. yunnanensis （Franch. ） Hand.-Mazz. ]和七葉一枝花 [Paris polyphylla Smith var. chinensis （Franch.） Hara]主要分布于中國云南、四川、貴州等地，是中藥材重樓的基源植物[1]。滇重樓以根莖入藥，具有清熱解毒、消腫止痛、涼肝定驚的功效[2]。滇重樓富含多種甾體皂苷、黃酮素、脂肪酸酯、植物內(nèi)生真菌等活性成分，其中甾體皂苷是主要活性成分[3]。藥理學研究表明，重樓藥材具有抗癌、抗菌消炎、止血鎮(zhèn)痛、驅(qū)蟲、收縮子宮等藥理作用而被廣泛應用于臨床治療，是云南名藥云南白藥、宮血寧和季德勝蛇藥片等中成藥的主要成分[3-4]。滇重樓根莖生長緩慢，從種子開始大約需要生長7年才能采收[5]，已有的研究表明生長年限是影響滇重樓藥材品質(zhì)的重要因素[5-7]。因此，對滇重樓藥材生長年限的鑒定是其品質(zhì)保障的基礎(chǔ)。

關(guān)于滇重樓藥材生長年限的鑒定，目前主要采用性狀法來鑒定。性狀鑒定法主觀性強，需要有經(jīng)驗的人來鑒別。通過理化方法或DNA分子技術(shù)鑒定，需對藥材進行分離提取，專業(yè)性強、技術(shù)難度大，在生長年限鑒定方面比較困難。近紅外光譜和拉曼光譜可直接測試藥材，但影響因素多，不利于推廣[8]。傅里葉變換紅外光譜能全面反映樣品內(nèi)部所有組分定性和定量的整體信息，具有用量少、靈敏度高、操作簡單等優(yōu)點。導數(shù)光譜能放大光譜差異，強化光譜特征。紅外光譜及其導數(shù)光譜應用于中藥材的品種、產(chǎn)地、栽培模式等的鑒別研究已有報道[9-10]，但對中藥材生長年限的鑒別研究鮮有報道。光譜檢索是光譜分析中鑒別化合物的一種方法，此方法對植物品種的鑒別研究已有成功的應用報道[10]，但對植物生長年限的鑒別研究未見報道。本試驗擬通過對7種生長年限的68株滇重樓主根木質(zhì)部樣品的紅外光譜及其導數(shù)光譜，采用光譜檢索的方法來研究滇重樓生長年限的鑒別方法，以期為中藥材生長年限的鑒別提供新的思路。

1材料與方法

1.1材料

Frontier型傅里葉變換紅外光譜儀（美國Perkin-Elmer公司），裝備DTGS檢測器，掃描范圍為4 000～400 cm-1，分辨率為4 cm-1，累計掃描16次；光譜數(shù)據(jù)處理和光譜檢索用Omnic 8.0軟件。

溴化鉀（天津市福晨化學試劑廠）為分析純；試驗藥材：68株7種不同生長年限的滇重樓均為人工栽培，從種子開始種植，購自云南省麗江市七河鄉(xiāng)五峰村五老山的種植戶，整株采挖，并經(jīng)云南省農(nóng)業(yè)科學院藥用植物研究所鑒定為百合科重樓屬植物滇重樓。生長年限分別為2、3、4、8、9年的各采集了10株，生長年限分別為5、7年的各采集了9株。將滇重樓植株的主根洗凈后經(jīng)60 ℃恒溫烘干至恒質(zhì)量，分別取各植株主根木質(zhì)部制備樣品。表1為試驗所用滇重樓樣品的生長年限及其編號。

1.2方法

將所取樣品放入瑪瑙研缽，磨為均勻粉末后，按樣品與溴化鉀質(zhì)量比1 ∶50加入溴化鉀，并攪磨均勻，然后壓片測試光譜。所有光譜均扣除背景，并使用Omnic 8.0軟件進行自動基線校正、九點平滑和歸一化等預處理，同時求出每個樣品光譜的一階導數(shù)光譜、二階導數(shù)光譜、四階導數(shù)光譜。取每種生

長年限任意6個樣品的光譜求其平均光譜及相應的一階、二階、四階導數(shù)光譜，在Omnic 8.0軟件中建立Paris0、Paris1、Paris2、Paris4 4個光譜數(shù)據(jù)庫，每個數(shù)據(jù)庫分別由各生長年限主根木質(zhì)部6個樣品光譜的平均紅外光譜及其一階導數(shù)光譜、二階導數(shù)光譜、四階導數(shù)光譜組成。用樣品光譜及其導數(shù)光譜分別與光譜數(shù)據(jù)庫Paris0、Paris1、Paris2、Paris4中的光譜進行檢索匹配，通過匹配得分對滇重樓樣品的生長年限進行鑒別分析。

2結(jié)果與分析

2.1不同生長年限重樓的紅外光譜及其二階導數(shù)光譜特征

由圖1每種生長年限滇重樓主根木質(zhì)部任意6個樣品的平均紅外光譜可知，不同生長年限滇重樓主根木質(zhì)部紅外光譜的峰形基本相同，共顯示了3 400、2 929、1 740、1 640、1 417、1 357、1 320、1 240、1 153、1 077、1 050、1 018、926、860、768、706、577、525 cm-1附近等約20個較明顯的共有吸收峰；其中3 400 cm-1附近寬而強的吸收峰歸屬為多糖的羥基形成多種氫鍵O—H鍵和氨基N—H鍵的伸縮振動吸收；2 929 cm-1 附近的吸收峰是脂類、多糖等亞甲基C—H反對稱伸縮振動；1 740 cm-1附近的弱吸收峰，歸屬為脂類羰基 CO 伸縮振動吸收峰；1 640 cm-1附近的吸收峰主要為甾體苷、孕甾烷苷、黃酮苷和多糖類物質(zhì)中O—H彎曲振動和羰基CO 伸縮振動吸收峰[11]；1 417 cm-1附近的吸收峰歸屬為亞甲基變角振動；1 357、1 320 cm-1附近的吸收峰歸屬為亞甲基面外搖擺振動吸收峰；1 240 cm-1附近吸收峰主要來自羧酸中C—OH的伸縮振動；在1 200～950 cm-1多糖吸收區(qū)顯示了1 153、1 077、1 050、1 018 cm-1附近4個階梯增強的吸收峰，主要為苷類、醇類或糖類物質(zhì)C—O伸縮振動吸收峰[11]；其中1 153 cm-1附近的吸收峰是多糖和苷類物質(zhì)C—O鍵特征振動和甾體皂苷元中羥基O—H的彎曲振動[16]；1 024 cm-1附近吸收峰歸屬為直鏈C—C的伸縮振動；926、 860、768、706 cm-1附近的吸收峰為糖環(huán)中的C—C伸縮振動和甾體皂苷的特征吸收振動[11]。滇重樓主根木質(zhì)部的二階導數(shù)紅外光譜圖如圖2所示。比較圖1、圖2可知，二階導數(shù)紅外光譜明顯增強了樣品光譜的分辨力，原光譜中被掩蓋的子峰、各吸收峰的峰位、肩峰位置準確地展現(xiàn)出來。由圖2可知，二階導數(shù)光譜中1 162、1 108、1 078、1 058、1 016、985、922、861、764、710、572 cm-1附近等峰與淀粉二階導數(shù)光譜中的特征峰在峰形和峰位上都很一致，結(jié)合原光譜中 1 153、1 077、1 018、926、860、768、577 cm-1等吸收峰在峰形和峰位上也與淀粉紅外光譜特征峰的峰形和峰位很相似，說明滇重樓主根木質(zhì)部中含有大量的淀粉[9]。上述光譜特征表明，滇重樓主根木質(zhì)部中的主要物質(zhì)成分為淀粉，同時還含有少量的皂苷和脂肪酸類物質(zhì)。

觀察圖1和圖2，比較各生長年限的紅外光譜，其差異主要表現(xiàn)為：（1）紅外光譜中，生長年限為4年和5年的樣品光譜，在3 008、2 853 cm-1附近，顯示了比較明顯的吸收峰，同時在2 929、1 746 cm-1附近的吸收峰比其他生長年限的強；二階導數(shù)紅外光譜中，4、5年的樣品光譜還在2 960、2 896、2 875 cm-1附近顯示了吸收峰。3 008 cm-1附近的吸收峰歸屬為C—H伸縮振動，來自不飽和脂肪類物質(zhì)[16]；2 960 cm-1附近的吸收峰歸屬為甲基C—H反對稱伸縮振動；2 896 cm-1歸屬為次甲基C—H伸縮振動；2 875 cm-1歸屬為甲基C—H對稱伸縮振動。說明生長年限為4、5年的滇重樓主根木質(zhì)部中脂肪酸類物質(zhì)的含量比其他 生長年限的多。（2）在多糖類物質(zhì)的特征吸收區(qū)，隨著生長年限的增加，紅外光譜和二階導數(shù)紅外光譜均反映1 050 cm-1附近的吸收峰逐年增強；紅外光譜中1 103 cm-1附近的吸收峰在低生長年限被掩蓋，高生長年限有顯示，二階導數(shù)光譜中此峰生長年限為5年和2年的較強，其他年限基本一致。二階導數(shù)光譜在970～710 cm-1光譜范圍內(nèi)，2、4、5年的樣品光譜在781 cm-1位置上顯示了較明顯的吸收峰，其他生長年限較弱；此范圍不同生長年限的光譜在峰形和峰位上還顯示了一些微小差異，與不同生長年限樣品中皂苷類物質(zhì)類型差異有關(guān)。上述光譜差異說明隨著生長年限的增加，滇重樓主根皂苷類物質(zhì)的積累增加，不同生長年限滇重樓所含的皂苷類型存在差異。

2.2FTIR光譜結(jié)合光譜檢索對滇重樓生長年限的鑒別

光譜檢索是一種將紅外光譜數(shù)字化，然后利用某種算法對未知物的譜圖和光譜庫中的標準譜圖進行數(shù)據(jù)點對數(shù)據(jù)點的計算比對，得出匹配數(shù)值來確定最佳匹配，從而獲得對未知物鑒定的方法。采用光譜檢索方法對各生長年限樣品光譜與由相應的平均紅外光譜組成的光譜庫進行檢索匹配鑒別，匹配得分的大小表示彼此之間的親密程度，值越大匹配程度越高。樣品光譜與光譜庫中已知生長年限光譜匹配分值最大的，即視樣品為該生長年限。在Omnic 8.0軟件中，光譜檢索的算法設置有5種，其中相關(guān)性算法可以消除基線的影響；絕對差算法可以加大光譜圖與標準譜的小差別權(quán)重；平方差算法適合噪音較大的譜圖；絕對微分差算法可以消除光譜峰偏移的影響，有利于沒有獨特吸收峰的未知樣品光譜檢索；平方微分差算法強調(diào)大峰和峰形的差異。微分算法有利于基線漂移或傾斜的未知樣品光譜檢索，也有利于信噪比差的未知樣品光譜檢索[12]。本試驗的樣品是不同生長年限滇重樓的主根木質(zhì)部，由“2.1”節(jié)中的光譜分析可知，不同生長年限樣品光譜的差異主要體現(xiàn)在組成物質(zhì)的含量及微量成分的差異方面，因此本試驗主要采用絕對微分差算法來進行光譜檢索；同時比較了絕對微分差、平方微分差和相關(guān)性3種算法進行光譜檢索鑒別的情況。在鑒別研究中，所有樣品光譜均作為未知生長年限樣品光譜，用樣品光譜及其導數(shù)光譜分別與光譜數(shù)據(jù)庫Paris0、Paris1、Paris2、Paris4中的光譜進行檢索匹配，對不同級別光譜的檢索鑒別效果進行比較；同時還對1 800～900 cm-1、1 800～500 cm-1、全光譜范圍（4 000～400 cm-1）進行了檢索鑒別比較。由于篇幅限制，表2列出了樣品的紅外光譜及其導數(shù)光譜與相應光譜數(shù)據(jù)庫Paris0、Paris2、Paris4在全光譜范圍進行絕對微分差算法檢索匹配錯誤的樣品及匹配得分高的前3個樣品和分值；表3列出了四階導數(shù)光譜在全光譜范圍進行平方微分差和相關(guān)性算法檢索鑒別錯誤的樣品及得分高的樣品和分值。

2.2.1全光譜范圍絕對微分差算法的光譜檢索鑒別滇重樓主根木質(zhì)部樣品的紅外光譜由于物質(zhì)組成成分主要為糖苷類物質(zhì)，光譜振動帶重疊嚴重。導數(shù)光譜能將重疊的譜帶分開，消除光譜中背景吸收等影響，提高光譜的分辨能力。一階導數(shù)光譜能夠顯示出原光譜的吸收峰和肩峰；二階導數(shù)光譜有很強的分辨能力，光譜的負峰對應原光譜中吸收峰和肩峰的準確位置；四階導數(shù)光譜的分辨能力比二階導數(shù)光譜更強；但導數(shù)光譜也會降低光譜的信噪比[10，12]。本試驗在測試樣品光譜時，適當提高了樣品與溴化鉀的質(zhì)量比，測試光譜的信噪比相對較高，為利用樣品導數(shù)光譜提供了便利。將全部68株滇重樓主根木質(zhì)部樣品的紅外光譜、一階導數(shù)紅外光譜、二階導數(shù)紅外光譜、四階導數(shù)紅外光譜分別與光譜數(shù)據(jù)庫Paris0、Paris1、Paris2、Paris4在全光譜范圍進行絕對微分差算法的檢索鑒別。在紅外光譜檢索中，有36個樣品的檢索結(jié)果與自身所在生長年限匹配度最高，占總樣品數(shù)的52.9%；一階導數(shù)紅外光譜檢索中有43個樣品的檢索結(jié)果與自身所在生長年限匹配度最高，占總樣品數(shù)的63.2%；二階導數(shù)紅外光譜檢索中有52個樣品的檢索結(jié)果與自身所在生長年限匹配度最高，占總樣品數(shù)的76.4%；四階導數(shù)紅外光譜檢索中有59個樣品的檢索結(jié)果與自身所在生長年限匹配度最高，占總樣品數(shù)的86.8%。以上數(shù)據(jù)表明，絕對微分差算法的光譜檢索對滇重樓生長年限的鑒別中紅外光譜的正確率為 52.9%，一階導數(shù)紅外光譜的正確率為63.2%，二階導數(shù)紅外光譜的正確率為76.5%，四階導數(shù)紅外光譜的正確率為86.8%。說明導數(shù)紅外光譜檢索的正確率高于紅外光譜，且隨著導數(shù)紅外光譜級別的增加，檢索正確率增大；基于樣品四階導數(shù)紅外光譜進行絕對微分差算法的光譜檢索，對滇重樓生長年限的鑒別效果較好。

2.2.2四階導數(shù)光譜在全光譜范圍內(nèi)不同算法的檢索鑒別將全部68株滇重樓主根木質(zhì)部樣品的四階導數(shù)紅外光譜分別與光譜庫Paris4在全光譜范圍進行平方微分差算法檢索、相關(guān)性算法檢索的匹配鑒別。由表3、表2可知，在絕對微分差算法檢索中，有59個樣品的匹配結(jié)果與自身所在生長年限匹配度最高，占總樣品數(shù)的86.8%；在平方微分差算法檢索和相關(guān)性算法檢索中，均有56個樣品的匹配結(jié)果與自身所在生長年限匹配度最高，占總樣品數(shù)的82.4%。說明基于滇重樓樣品四階導數(shù)紅外光譜檢索對生長年限的鑒別，3種不同的檢索算法都有較好的效果，都可以鑒別不同生長年限的滇重樓。比較3種算法的檢索匹配得分結(jié)果，相關(guān)性算法檢索的匹配得分較高，其次為平方微分差算法檢索，絕對微分差算法檢索的最低，但從檢索匹配的正確率看，絕對微分差算法的檢索正確率最高，表明絕對微分差算法的光譜檢索更合適對滇重樓生長年限的鑒別。

2.2.3四階導數(shù)光譜在不同范圍絕對微分差算法的檢索鑒別比較將全部68株滇重樓主根木質(zhì)部樣品的四階導數(shù)紅外光譜與光譜庫Paris4分別在光譜范圍1 800～900、1 800～500 cm-1進行絕對微分差算法的檢索鑒別。檢索結(jié)果為：在1 800～900 cm-1光譜范圍有50個樣品檢索匹配正確，占總數(shù)的73.5%；在1 800～500 cm-1光譜范圍內(nèi)有56個樣品檢索匹配正確，占總數(shù)的82.4%。結(jié)合“2.2.1”節(jié)中在全光譜范

圍的檢索結(jié)果，說明在3個不同光譜范圍采用絕對微分差算法的光譜檢索來鑒別滇重樓的生長年限，全光譜范圍的效果較好。1 800～900 cm-1光譜范圍反映了脂類、蛋白質(zhì)、酮類、碳水化合物類物質(zhì)等的特征振動；1 800～500 cm-1光譜范圍除反映上述物質(zhì)的特征振動外，還反映多糖類物質(zhì)的糖環(huán)振動和皂苷類物質(zhì)的特征振動；全光譜范圍反映了樣品組成物質(zhì)成分的所有光譜信息。3個不同光譜范圍的鑒別結(jié)果表明，不同生長年限的滇重樓主根樣品，尤其是生長年限比較接近的，其物質(zhì)組分及含量差異很小，通過光譜檢索的方法來鑒別比對數(shù)據(jù)點的增加有利于微小差異的積累，提高鑒別正確率。

3結(jié)論與討論

利用傅里葉變換紅外光譜技術(shù)測試了68株7種不同生長年限滇重樓主根木質(zhì)部的紅外光譜，利用光譜軟件Omnic 8.0計算了各樣品紅外光譜的一階、二階、四階導數(shù)紅外光譜，各生長年限任意6個樣品光譜的平均紅外光譜及相應的平均導數(shù)紅外光譜；以平均紅外光譜及其平均導數(shù)光譜作為各生長年限標準光譜，在Omnic 8.0軟件中建立各生長年限不同級別光譜的標準光譜庫，各樣品光譜及其導數(shù)光譜分別與相應的光譜庫進行光譜檢索，通過檢索得到的匹配分值對滇重樓生長年限進行鑒別。比較了4種級別的光譜、3種不同檢索算法、3個不同光譜檢索范圍的鑒別效果，結(jié)果表明四階導數(shù)紅外光譜、絕對微分差算法、全光譜范圍的檢索鑒別效果較好?；谒碾A導數(shù)紅外光譜在全光譜范圍進行絕對微分差算法的光譜檢索鑒別，樣品生長年限的鑒別正確率為86.8%。

在鑒別研究中已注意到生長年限匹配錯誤的樣品，有較多的樣品鑒別結(jié)果與實際生長年限的差別僅為1年，這與滇重樓主根生長較緩慢，相鄰生長年限的滇重樓主根樣品的物質(zhì)組分及含量非常接近有關(guān)。如果在實際中允許鑒別的誤差為1年，那么本試驗的鑒別結(jié)果正確率將進一步提高。比如在基于樣品四階導數(shù)紅外光譜在全光譜范圍進行絕對微分差算法的檢索鑒別中，鑒別錯誤的樣品、鑒別生長年限與實際生長年限誤差超過1年的只有3個，鑒別的相對正確率增加為95.6%。利用滇重樓主根的紅外光譜結(jié)合Omnic 8.0中光譜檢索的方法對滇重樓生長年限進行鑒別是一種基于植物光譜信息的統(tǒng)計分類方法。重樓主根的化學成分及含量受品種、生態(tài)環(huán)境、栽培技術(shù)等因素的影響，本研究結(jié)果雖然有比較好的效果，但由于試驗中全部樣品均來自同一產(chǎn)地且樣品數(shù)量較少，因此所用鑒別方法的有效性還需進一步研究。盡管如此，本研究仍然為重樓藥材生長年限的鑒別提供了一種新思路。

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