譚琳++鄭曉燕++陳嬌+++鄭學勤+++馬蔚紅+艾斌凌++王朝政

摘要：為了探討諾麗果汁對過氧化氫誘導的PC12細胞氧化損傷的保護作用，本試驗采用H2O2造成PC12神經(jīng)細胞氧化損傷模型，通過熒光顯微鏡觀察細胞形態(tài)，MTT測定細胞存活率、乳酸脫氫酶（LDH）活力檢測法，Ho/PI染色檢測細胞凋亡和細胞壞死，研究的諾麗果汁對過氧化氫所致PC12 細胞氧化損傷的影響。結果發(fā)現(xiàn)，體積分數(shù)在1%～5%諾麗果汁均能不同程度地保護細胞形態(tài)，增加細胞的生存率，抑制過氧化氫誘導的PC12細胞壞死，減少損傷后LDH的生成。以上結果表明，1%～5%體積分數(shù)諾麗果汁對過氧化氫誘導的PC12細胞損傷有保護作用。

關鍵詞：諾麗果汁；H2O2；PC12細胞；細胞壞死；乳酸脫氫酶

中圖分類號： TS275.5文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）02-0317-03

收稿日期：2015-03-24

基金項目：中國熱帶農業(yè)科學院?？趯嶒炚究蒲袉禹椖浚ň幪枺篐KZKY140204）；農業(yè)部財政項目“熱帶野生果樹種子資源收集、利用和評價”。

作者簡介：譚琳（1974—），女，博士，副研究員，研究方向為食品分子營養(yǎng)。E-mail：tanlin7402@126.com。

通信作者：馬蔚紅，研究員，主要從事熱帶作物種質資源收集與評價研究，E-mail：zjwhma@163.com；鄭學勤，研究員，主要從事熱帶作物遺傳育種研究。E-mail：zhengxxxqin@126.com。氧化應激是由活性氧自由基和活性氮自由基產(chǎn)生和清除失衡引起的應激損傷狀態(tài)[1]，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病中起著重要作用[2-3]。近年來，越來越多的研究顯示植物多酚具有強抗氧化性，且在防治氧化損傷神經(jīng)退行性疾病有著重要的作用[4-5]。諾麗（Morinda citrifolia），又稱諾尼、海巴戟，屬茜草科巴戟天屬植物，主要分布在南太平洋諸島嶼以及中國的海南島、西沙群島和臺灣島等地[6]。早在2 000多年前，南太平洋島嶼的波利尼西亞人就發(fā)現(xiàn)諾麗果實具有天然的健康和醫(yī)學功效，經(jīng)常將諾麗果壓成汁液，作為日常飲品和用于治療癌癥、糖尿病、高血壓等多種疾病[7]?，F(xiàn)代醫(yī)學也表明諾麗具有抗氧化、抗癌、降糖等多種生物學活性[8-10]，但是關于其神經(jīng)保護方面的功能鮮見報道。前期研究表明諾麗果汁中多酚含量高達1.934 mg/mL，且對DPPH 自由基、ABTS 自由基、羥自由基、過氧化氫等均具有很好的清除活性[11]。本研究利用H2O2誘導類神經(jīng)細胞系PC12細胞產(chǎn)生氧化損傷模型，檢測諾麗果汁對PC12細胞的保護作用，旨在為新型諾麗果汁保健產(chǎn)品的開發(fā)奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞PC12高分化細胞（大鼠腎上腺髓質嗜鉻瘤分化細胞株）購于中國學科院典型培養(yǎng)物保藏委員會昆明細胞庫。

1.1.2諾麗果汁諾麗果由鄭學勤研究員采自海南陸僑集團三亞種植基地，將采來的新鮮諾麗果實去皮和去籽，果肉用醫(yī)用紗布包裹，擠壓，得到諾麗果汁，果汁再用一次性0.22 μm 濾膜（milipore）進行過濾除菌，備用。

1.1.3藥品和試劑RMPI1640培養(yǎng)液購自北京索萊寶公司；無支原體胎牛血清為杭州四季清生物工程材料有限公司產(chǎn)品；Trypsin為 Amersco 公司產(chǎn)品；DMSO、LDH 脫氫酶試劑盒購自Promega公司；MTT、Hoechst33342/PI細胞凋亡測定試劑盒上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司。

1.1.4主要儀器超凈工作臺（蘇凈安泰VS-840K-U，蘇州），二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermo/Forma3111，美國），倒置熒光顯微鏡（Zeiss/Axiovert 40CFL，德國），全自動酶標儀（Thermo Multiskan FC，美國）；細胞培養(yǎng)瓶，細胞培養(yǎng)板（康寧）。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)PC12細胞培養(yǎng)用含10%胎牛血清 RMPI 1640 培養(yǎng)液，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，每2 d傳代1次。待細胞增長至80%融合時，用0.25%胰酶消化細胞，調整細胞密度至1 × 105 個/mL 后傳代或接種于細胞培養(yǎng)板進行各項指標測定。

1.2.2細胞形態(tài)檢測取對數(shù)生長期的PC12細胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL。培養(yǎng)24 h后吸棄培養(yǎng)液。試驗分為對照組、損傷組、預防組，每組設3個復孔。對照組細胞按常規(guī)方法培養(yǎng)，預防組用終體積分數(shù)分別為1%、2.5%、5%的諾麗果汁培養(yǎng)24 h后，吸棄培養(yǎng)液，PBS沖洗1～2次，加入H2O2終濃度為0.3 mmol/L的培養(yǎng)液，培養(yǎng)4 h，損傷組用不含諾麗果汁的培養(yǎng)液培養(yǎng)，其余處理方法與預防組細胞相同，熒光倒置顯微鏡檢查細胞形態(tài)。

1.2.3MTT檢測諾麗果汁對氧化應激損傷PC12 細胞活力的影響按照“1. 2 .2”節(jié)進行試驗分組、給藥處理及培養(yǎng)，然后用MTT法測定細胞活力，向各孔加入5 g/L的MTT后繼續(xù)培養(yǎng)4 h，小心吸棄所有培養(yǎng)液，每孔加入150 μL二甲基亞砜（DMSO） 振蕩10 min。在酶標儀上以560 nm 波長測定各孔吸光度D。按相對活力=（D處理-D空白）/（D正常平均-D空白） × 100%公式計算細胞相對活力。

1.2.4細胞凋亡和細胞壞死檢測根據(jù)Hoechst33342/PI試劑盒說明書進行細胞凋亡和細胞壞死檢測。先配制好染色緩沖液，然后對各處理組進行離心收集懸浮細胞，用PBS洗滌細胞2次。取適量離心收集好的細胞用0.5～1 mL 染色緩沖液將細胞重懸，使其濃度大約為1 ×106 個/mL。加入5 μL Hoechst 33342染色液。 輕輕混勻后室溫避光孵育10～15 min。用PBS洗滌細胞1次，用0.5～1 mL染色緩沖液將細胞重懸，加入5 μ LPI染色液，輕輕混勻后室溫避光孵育10～15 min，再用PBS洗滌細胞1次，加PBS稀釋至適當濃度后熒光顯微鏡檢測結果。Hoechst33342-DNA的最大激發(fā)波長為350 nm，最大發(fā)射波長為460 nm，PI的最大激發(fā)和最大發(fā)射波長分別為488、615 nm。

1.2.5LDH檢測諾麗果汁對PC12 細胞的保護作用細胞凋亡或壞死而造成的細胞膜結構的破壞時，細胞內的LDH會釋放到培養(yǎng)基中，而活細胞則不會，所以培養(yǎng)上清中LDH的活性可以反映細胞的死亡或損傷程度。各組細胞經(jīng)相應處理后，吸取細胞培養(yǎng)上清，按照試劑盒說明書操作檢測LDH含量。

1.2.6數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析采用SAS 9.0統(tǒng)計分析軟件分析試驗數(shù)據(jù)，處理組之間差異顯著性分析采用鄧肯氏（Duncans）多重比較法，以P<0.05為差異顯著。

2結果

2.1諾麗果汁對PC12細胞形態(tài)的影響

本研究發(fā)現(xiàn)，對照組細胞呈長梭形或多角形鑲嵌狀排列，細胞邊界清晰，大小均勻，細胞豐滿，無重疊生長現(xiàn)象（圖1-A）。而H2O2損傷組細胞出現(xiàn)收縮、變圓、體積變小，細胞間隙增寬，大部分細胞破碎、脫落，但細胞輪廓尚較清晰（圖1-B）。用不同劑量諾麗果汁預處理后均有不同程度的保護作用，細胞形態(tài)好于損傷組（圖1），其中10%諾麗果汁預處理組細胞形態(tài)與對照組接近（圖1-E）。

2.2諾麗果汁對H2O2氧化損傷PC12細胞存活率的影響

不同質量濃度諾麗果汁均可減小H2O2對細胞的增殖抑制作用，細胞存活率從120%增加到166%，與H2O2損傷組比，差異極顯著（P<0.01）（圖2）。此結果表明，在一定濃度范圍內，諾麗果汁不僅有保護細胞免受損傷的作用，而且還有促進細胞增殖的作用。

2.3諾麗果汁對H2O2氧化損傷PC12細胞壞死的影響

Hoechst33342是一種可以穿透細胞膜的藍色熒光染料，與DNA結合，凋亡細胞有膜通透性改變，主要攝取Hoechst染料，凋亡細胞中的凝聚染色質會比正常細胞中的染色質染色更深、更加明亮，表現(xiàn)為強藍色熒光。壞死細胞由于有很強的PI嗜染性并可覆蓋Hoechest染色，故呈強紅色熒光。本研究發(fā)現(xiàn)，對照組有少數(shù) PI染色陽性細胞（橘黃色），300 μmol/L H2O2處理組PI染色陽性細胞顯著增加，而經(jīng)諾麗果汁預處理后PI陽性細胞完全沒有，但有少量凋亡細胞（亮藍色）（圖3）。以上結果表明，諾麗果汁可顯著地減少H2O2誘導的細胞壞死。

2.4諾麗果汁對H2O2氧化損傷PC12細胞LDH漏出率的影響

研究發(fā)現(xiàn)對照組中的LDH含量較低，而模型組中的LDH含量極顯著高于對照組。經(jīng)諾麗果汁保護后，LDH含量下降，并隨諾麗果汁濃度的增加而顯著降低（（圖4）。結果表明，諾麗果汁有效降低H2O2對PC12細胞的氧化損傷，且在1%～5%的濃度范圍內其保護效果與諾麗果汁濃度呈正相關。

3結論與討論

本研究用H2O2造成PC12神經(jīng)細胞氧化損傷模型，通過熒光顯微鏡觀察細胞形態(tài)，MTT測定細胞存活率、乳酸脫氫酶（LDH）活力檢測法，Ho/PI染色檢測細胞凋亡探討諾麗果汁對過氧化氫所致PC12細胞氧化損傷的影響，發(fā)現(xiàn)1%～5%體積分數(shù)諾麗果汁均能不同程度地保護細胞形態(tài)，增加細胞的生存率，抑制過氧化氫誘導的PC12細胞壞死，減少損傷后LDH的生成，表明1%～5%體積分數(shù)諾麗果汁對過氧化氫誘導的PC12細胞損傷有保護作用，這將為諾麗果用于開發(fā)神經(jīng)保護方面的保健品奠定了理論依據(jù)。

自1983年Mosmann創(chuàng)立了MTT比色法以來，由于其經(jīng)濟、靈敏、無放射性污染等特點，使之成為細胞生物學及相關研究領域一種常用的細胞活性檢測方法[12]。本研究采用MTT 比色法分析了1%～5%范圍內諾麗果汁對過氧化氫誘導PC12損傷存活率的影響，發(fā)現(xiàn)其不僅有保護細胞免受損傷的作用，而且還有促進細胞增殖的作用，但有研究顯示，10%諾麗果汁能降低Hela細胞（宮頸癌細胞）22.3%的生存率，具有抗癌作用[13]，這表明不同濃度范圍的諾麗果汁對細胞的增殖作用不同。

雖然本研究首次報道了1%～5%體積分數(shù)諾麗果汁具有神經(jīng)保護作用，但是在更大濃度的范圍內，諾麗果汁對過氧化氫誘導的PC12細胞損傷是否還存在保護作用尚不得而

知。此外，1%～5%體積分數(shù)諾麗果汁產(chǎn)生的保護作用機制尚不清楚。因此，今后將在更廣的濃度范圍內研究諾麗果汁對PC12細胞的保護作用，并探究其作用機制。

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