張跡紀俊賓 于晗 李智

（淮陰師范學院生命科學學院/江蘇省環(huán)洪澤湖生態(tài)農(nóng)業(yè)生物技術重點實驗室 江蘇淮安 223300）

多菌靈微生物降解研究進展

張跡*紀俊賓 于晗 李智

（淮陰師范學院生命科學學院/江蘇省環(huán)洪澤湖生態(tài)農(nóng)業(yè)生物技術重點實驗室 江蘇淮安 223300）

多菌靈是一種高效廣譜的內(nèi)吸性殺菌劑，廣泛應用于作物的病害防治和工業(yè)殺菌。其化學性質(zhì)穩(wěn)定，在環(huán)境中殘留期較長，對環(huán)境和人類的健康均構成嚴重威脅。本文從微生物菌株資源、代謝途徑及關鍵酶和基因等幾個方面綜述了國內(nèi)外對多菌靈微生物降解的最新研究進展。為多菌靈污染環(huán)境的微生物修復提供參考。

多菌靈 降解途徑 生物修復

農(nóng)藥在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中發(fā)揮了重要的作用,但農(nóng)藥的大量生產(chǎn)和使用也造成了嚴重的環(huán)境污染。多菌靈又名棉萎靈、苯并咪唑44號,是一種廣譜、內(nèi)吸性殺菌劑,對多種由真菌（如半知菌、多子囊菌）引起的作物病害有防治效果。多菌靈目前已成為我國產(chǎn)量最大的內(nèi)吸殺菌劑品種［1］,廣泛應用于果樹、蔬菜等多種農(nóng)作物真菌病害的防治［2］。多菌靈的化學性質(zhì)穩(wěn)定,在環(huán)境中殘留期較長,屬于持久性污染物［3］。由多菌靈引起的環(huán)境污染和危害正日益受到關注,據(jù)研究,高濃度的多菌靈對植物體內(nèi)的多種酶存在影響,對哺乳動物也存在一定的毒害作用,可損傷某些動物的生殖系統(tǒng)導致不孕不育,可引起動物的內(nèi)分泌紊亂和哺乳動物肝病、存在潛在的致癌、致畸、致突變的“三致”作用,導致染色體畸變而影響后代繁衍等［4-6］。在美國和歐盟國家是禁用農(nóng)藥,在我國和其他一些國家則允許使用［1］。2002年被我國列為環(huán)境激素類化學農(nóng)藥［7］。

微生物修復是經(jīng)濟可行的污染環(huán)境修復技術,具有成本低廉,無二次污染等優(yōu)點,是具有較好發(fā)展前景的污染環(huán)境修復技術［8-10］。關于多菌靈微生物降解和污染環(huán)境生物修復的研究報道越來越多,相關研究成為近年來國內(nèi)外環(huán)境微生物領域的研究熱點之一。然而到目前為止,筆者尚未見有關多菌靈微生物降解相關的綜述報道。為讓讀者方便了解目前國內(nèi)外多菌靈微生物降解研究現(xiàn)狀,并對多菌靈微生物降解和污染環(huán)境生物修復研究提供借鑒,本文將從微生物菌株資源、代謝途徑及關鍵酶和基因等幾個方面綜述國內(nèi)外對多菌靈微生物降解的最新研究進展。

1 降解多菌靈的微生物

環(huán)境中多菌靈主要通過生物降解［6］。分離篩選多菌靈高效降解菌株是研究多菌靈降解及其污染環(huán)境生物修復的關鍵所在。目前國內(nèi)外已報道多個屬的菌株可以高效降解多菌靈,這些菌株分別屬于紅球菌屬［2,11-14］、諾卡氏菌屬［15］、假單孢菌屬［16］、芽孢桿菌屬［17］和羅爾斯通氏菌屬［18,19］。然而,在數(shù)量上仍以紅球菌屬等革蘭氏染色陽性菌株為主。

許敬亮等分離了一株紅球菌屬（Rhodococcus sp.）菌株djl-6［11］,該菌株對M9培養(yǎng)基中得多菌靈具有較高的降解效率,降解率可達到55.56mg·L-1·d-1。Holtman M.A.和Kobayashi D.Y.分離純化了6株能夠降解多菌靈的菌株［12］,經(jīng)鑒定,這些菌株均為紅球菌屬（Rhodococcus sp.）菌株,且其中5株為Rhodococcus erythropolis。王志春等研究報道了多菌靈高效降解菌株Rhodococcus jialingiae djl-6-2［13］,該菌株能多菌靈為唯一碳氮源生長,并能高效地降解液體培養(yǎng)基和土壤中的多菌靈,硝酸銨的添加能夠明顯抑制菌株對多菌靈的降解。Pandey G.等從多菌靈污染土壤中分離了一株諾卡氏菌屬Nocardioides sp.高效多菌靈降解菌株SG-4G［15］,該菌株能夠通過2-氨基苯并咪唑和2-羥基苯并咪唑等中間代謝產(chǎn)物礦化多菌靈。Fang Hua 等從土壤中分離純化了一株能以多菌靈為唯一碳源和能源生長的假單孢菌Pseudomonas sp.CBW［16］。張麗珍等分離篩選了一株能高效降解多菌靈的芽孢桿菌菌株NY97-1［17］,該菌株被鑒定為短小芽孢桿菌Bacillus Pumilus。張桂山等報道了一株革蘭氏陰性細菌Ralstonia sp.1-1［18,19］,該菌株能夠以多菌靈為唯一碳源和能源生長,并能在含有酵母膏時高效地降解多菌靈。

2 微生物降解多菌靈的代謝途徑

目前為止,還沒有較完整的代謝途徑被闡述清楚,在已報道的多菌靈降解菌株中,研究者檢測到了一些代謝產(chǎn)物,并推測了部分代謝途徑。其中菌株Rhodococcus erythropolis djl-11［14］、Nocardioides sp.Strain SG-4G［15］、Pseudomonas sp. CBW［16］在降解多菌靈的過程中均檢測到了2-氨基苯并咪唑和2-羥基苯并咪唑兩種中間代謝產(chǎn)物；菌株Rhodococcus jialingiae djl-6-2［13］降解過程中除了檢測到上述兩種中間代謝產(chǎn)物外,還檢測到了苯并咪唑；菌株Rhodococcus sp. djl-6［11］降解多菌靈的過程中檢測到了2-氨基苯并咪唑和苯并咪唑。

基于上述檢測到的幾種中間代謝產(chǎn)物和推測的各菌株降解多菌靈的部分代謝途徑,可將目前知道的微生物降解多菌靈的途徑大致歸納為3條途徑：首先各菌株均先將多菌靈轉(zhuǎn)化成2-氨基苯并咪唑,之后的途徑便有所差異。1.菌株SG-4G、djl-11、CBW等將2-氨基苯并咪唑轉(zhuǎn)化成2-羥基苯并咪唑,進而再通過一些未知的途徑進一步徹底降解多菌靈；2.菌株djl-6將2-氨基苯并咪唑脫氨基,轉(zhuǎn)化成苯并咪唑,再經(jīng)未知途徑徹底降解多菌靈；3.菌株djl-6-2將2-氨基苯并咪唑轉(zhuǎn)化生成2-羥基苯并咪唑或直接脫氨基生成苯并咪唑,苯并咪唑也將轉(zhuǎn)變成2-羥基苯并咪唑然后再轉(zhuǎn)化為鄰苯二酚結構,并通過鄰苯二酚開環(huán)途徑將多菌靈中的苯環(huán)結構開環(huán)并降解。

3 多菌靈微生物降解過程中的關鍵酶和基因

從酶以及基因水平上闡明菌株降解多菌靈的分子機理可為菌株進行穩(wěn)定性遺傳改造及環(huán)境修復提供參考。目前國內(nèi)外有關多菌靈降解基因-酶的報道極少。Pandey等［15］通過酶蛋白純化和N末端測序等技術手段從多菌靈降解菌株Nocardioides sp.SG-4G中首次克隆到了多菌靈水解酶基因mheI,該基因編碼的多菌靈水解酶MheI含有242個氨基酸殘基,負責催化多菌靈降解第一步反應,即將多菌靈水解成2-氨基苯并咪唑?；騧heI經(jīng)密碼子優(yōu)化后在大腸桿菌中異源表達,并純化了含6*His標簽的多菌靈水解酶MheI,生物化學特性研究表明該酶水解多菌靈的Km和Kcat值分別為6.1μM和170/min。此外,zhang等［14］從菌株djl-11的基因組DNA上克隆了一個疑似多菌靈水解酯酶基因,該基因與上述克隆自菌株SG-4G中的多菌靈水解酶基因mheI具有高達99%的同源性。

4 多菌靈污染環(huán)境微生物修復研究

研究者們對多菌靈在環(huán)境中的危害及其去向開展了廣泛的研究,分離了一些多菌靈降解菌株,并對其降解特性和機理開展了較全面的研究和探索。在多菌靈污染環(huán)境微生物修復方面也開展了積極的研究和嘗試。

王志春等［13］研究了菌株djl-6-2降解土壤中多菌靈的特性,其研究結果顯示：經(jīng)過20天的降解,滅菌土壤中的多菌靈降解率只有約5%；未滅菌土壤中的多菌靈降解率約為15%；不論是滅菌土壤還是未滅菌的土壤,在添加了菌株djl-6-2之后,樣品中的大部分多菌靈被降解,降解率超過90%,而二者之間沒有顯著區(qū)別。該研究結果表明：1.多菌靈在土壤中比較穩(wěn)定；2.土著微生物對多菌靈只有較低的降解率；3.菌株djl-6-2具有對多菌靈污染土壤生物修復的能力,且不會受到土著微生物的影響。

Pandey等［15］將菌株SG-4G滅活后對其降解污染水體中多菌靈的特性開展了一些研究。結果表明,1.菌株SG-4G經(jīng)發(fā)酵和放射殺菌并冷凍干燥后,能有效地降解MM中的多菌靈和2-氨基苯并咪唑；2.24小時內(nèi)能有效地去除自來水中的高濃度多菌靈（500mg/L）；3.在添加劑量為0.05-1g/L時,該滅活菌株能夠在16小時以內(nèi)有效去除農(nóng)業(yè)廢水中初始濃度為207mg/L的多菌靈。

5 存在問題和展望

在許多國家和地區(qū),多菌靈仍被大量生產(chǎn)和廣泛應用,其對環(huán)境造成的污染和危害仍在繼續(xù)。用于其污染環(huán)境微生物修復的菌株資源仍有一定的局限性,目前雖有不少多菌靈降解菌株的報道,但大多是紅球菌屬等革蘭氏陽性細菌,且許多菌株獨立降解多菌靈的效率不高,需要借助外源有機碳氮源才能實現(xiàn)高效降解?，F(xiàn)有的多菌靈降解菌株資源依然有限,遠不能滿足相關研究及污染環(huán)境修復的需求,需要進一步豐富高效多菌靈降解菌株資源庫。

微生物降解多菌靈在代謝途徑和基因水平上的機理還遠沒有闡明,對多菌靈污染環(huán)境微生物修復的指導意義有限。目前研究者只檢測到少數(shù)幾個中間代謝產(chǎn)物,推測了部分代謝途徑。

mheI-MheI是目前報道的唯一明確功能的多菌靈降解關鍵基因-酶系統(tǒng),而且也只負責催化多菌靈降解的第一步水解反應,有關多菌靈微生物降解在基因水平上的分子機理還遠沒有闡述清楚,因此還有必要對微生物降解多菌靈的基因進行全面深入的研究。此外,由于不同菌株降解多菌靈的代謝途徑不盡相同,故而不同的微生物菌株中編碼多菌靈降解酶系的基因也應具有多樣性,需要廣大研究者進一步深入研究。

筆者認為,在未來相當長的時間內(nèi),多菌靈的污染和危害還將持續(xù)存在。環(huán)境微生物研究者還需要通過不懈的努力,分離獲得更多更穩(wěn)定高效的多菌靈降解菌株,并清晰地闡明微生物降解多菌靈的代謝途徑及相關的酶和基因。亦可在此基礎之上,通過基因工程的手段構建更加穩(wěn)定高效的多菌靈降解基因工程菌。最終將這些菌株應用于多菌靈污染環(huán)境的微生物修復中,有效地解決多菌靈對環(huán)境的污染等問題。

［1］巍中華，徐娟，郭明霞，等.國內(nèi)多菌靈的研究進展［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學，2015，43（3）：125-141.

［3］International programme on chemical safety.Environmental health criteria 149：carbendazim ［EB/OL］.http：//www.inchem.org/ documents/ehc/ehc/ehc149.htm，2005-09-10.

［4］Pan S.R.，Shao H.S.，Jing X.A.，et a1.，The fate of ［2-14C］carbendazim in rats［J］.Nuclear Techniques，1989，12（6）： 376-379.

［5］Sarrif A.M.，Arce G.T.，Krahn D.F.，et a1.，Evaluation of carbendazim for Gene mutations in the Salmonella/Ames plateincorporation assay：the Role of aminophenazine impurities［J］. Mutat.Res.，1994，32（6）：43-56.

［6］Pattanasupong A.，Nagase H.，Inoue M.，et a1.，Ability of a microbial consortium to remove pesticide，carbendazim and 2，4-dichlorophenoxyacetic acid［J］.World J.Microbiol. Biotechnol.，2004，20（5）：517-522.

［7］馬承鑄，顧真榮.環(huán)境激素類化學農(nóng)藥污染及其監(jiān)控［J］. 上海農(nóng)業(yè)學報，2003，19（4）：98-103.

［8］滕應，駱永明，李振高.污染土壤的微生物修復原理與技術進展［J］.土壤，2007，39（4）：497-502.

［9］陶雪琴，黨志，盧桂寧，等.污染土壤中多環(huán)芳烴的微生物降解及其機理研究進展［J］.礦物巖石地球化學通報，2003，22（4）：356-360.

［10］溫小樂，楊燕娜.有機污染土壤的生物修復實踐及其發(fā)展前景［J］. 環(huán)境科學與技術，2008，7（31）：62-67.

［11］Xu J.L.，Gu X.Y.，Shen B.，et a1.，Isolation and characterization of a carbendazim-degrading Rhodococcus sp. djl-6［J］. Curr.Microbiol.，2006，53，72-76.

［12］Holtnan M.A.，Kobayashi D.Y..Identification of Rhodococcus erythropolis isolates capable of degrading the fungicide carbendazim［J］.Appl.Miccrobiol.Biotechnol.，1997， 47：578-582.

［13］Wang Z.C.，Wang Y.Y.，Gong F.F.，et al.，Biodegradation of carbendazim by a novel actinobacterium Rhodococcus jialingiae djl-6-2［J］.Chemosphere，2010，81：639--644.

［14］Zhang X.，Huang Y.，Harvey P.R.，et al.，Isolation and Characterization of Carbendazim degrading Rhodococcus erythropolis djl-11［J］.Plos one，2013，8（10）：e74810.

［15］Pandey G.，Dorrian S.J.，Russell R.J.，et a1.， Cloning and biochemical characterization of a Novel Carbendazim （Methyl-1-H-Benzimidazol-2-ylearbamate）-Hydrolyzing esterase from the newly isolated Nocardioides sp. strain SG-4G and its potential for use in enzymatic bioremediation［J］. Appl. Environ. Microbiol.，2010，76（9）：2940-2945.

［16］Fang H.，Wang Y.Q.，et al.，Isolation and characterization of Pseudomonas sp.CBW capable of degrading carbendazim［J］. Biodegradation，2010，21：939-946.

［17］張麗珍，喬雄梧，馬利平，等.多菌靈降解菌NY97-1的鑒定及降解條件［J］.環(huán)境科學學報，2006，26（9）：1440-1444.

［18］張桂山，賈小明，馬曉航，等.一株多菌靈降解細菌的分離、鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析［J］.微生物學報，2004，44（4）：417-421.

［19］Zhang G.S.，Jia X.M.，Cheng T.F.，et al.，Isolation and characterization of a new carbendazim degrading Ralstonia sp.Strain［J］.World J.Microbiol. Biotechnol.，2005，21：265-269.

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A

1674-2060（2016）03-0013-02

國家自然科學基金青年基金項目 （編號：31300099）；江蘇省高等學校大學生創(chuàng)新訓練計劃（ 編號：201310323046X）。

張跡，博士，講師，研究方向：環(huán)境污染物微生物降解及污染環(huán)境微生物修復。