夏金成 闕彤彤 張文君 趙聰 楊秦
(邵陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等??茖W(xué)校 湖南邵陽(yáng) 422000)
不同營(yíng)養(yǎng)條件下維羅納氣單胞菌菌毛表達(dá)與生物膜形成能力的比較
夏金成 闕彤彤 張文君 趙聰 楊秦*
(邵陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校 湖南邵陽(yáng) 422000)
目的:檢測(cè)不同培養(yǎng)基條件下(即不同營(yíng)養(yǎng)條件下)維羅納氣單胞菌菌毛動(dòng)力和生物膜生成能力(即致病能力)。方法:半固體培養(yǎng)基穿刺陽(yáng)培養(yǎng)檢測(cè)細(xì)菌動(dòng)力,喉上皮細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)生物膜形成能力,最后統(tǒng)計(jì)分析差異性。結(jié)果:BHIB培養(yǎng)基比LBA培養(yǎng)基中,野生型都比菌毛缺失的MSHB突變維羅納氣單胞菌有更高的動(dòng)力和生物膜形成能力,但之間都無(wú)顯著差異(P<0.05)。結(jié)論:不同培養(yǎng)基基條件對(duì)菌毛動(dòng)力有影響,而菌毛表達(dá)對(duì)生物膜致病性有一定關(guān)系。
維羅納氣單胞 菌毛 半固體穿刺 粘附
生物膜多細(xì)胞結(jié)構(gòu)的形成是一個(gè)復(fù)雜且高度規(guī)律的動(dòng)態(tài)過(guò)程,包括細(xì)菌起始黏附、生物膜黏附期、生長(zhǎng)期、成熟和播散期等階段[1]。首先, 游動(dòng)細(xì)胞接受環(huán)境中的營(yíng)養(yǎng)信號(hào), 通過(guò)鞭毛或菌毛等附著結(jié)構(gòu)黏附于表面; 附著于表面后的細(xì)菌不斷繁殖并吸引其他細(xì)菌繼續(xù)附著, 使該附著位點(diǎn)細(xì)菌呈高密度狀態(tài)從而產(chǎn)生抗生素抵抗性[2]。鞭毛、菌毛介導(dǎo)的動(dòng)力性和黏附性在細(xì)菌致病性中發(fā)揮重要作用, 其與細(xì)菌的生物膜形成、耐藥性和慢性感染中的相關(guān)性日益受到醫(yī)學(xué)界的重視[3]。本次實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)不同培養(yǎng)基條件下(即高低營(yíng)養(yǎng)差別條件下)維羅納菌菌毛對(duì)動(dòng)力和有機(jī)體細(xì)胞粘附的作用,探討細(xì)菌菌毛對(duì)生物膜形成的起始黏附、生物膜黏附期的意義。為抗菌,制藥做出基礎(chǔ)貢獻(xiàn)。
1.1 菌種
本次采用的是兩種維羅納氣單胞菌:MSHB+(野生型有菌毛)和MSHB-(基因突變型無(wú)菌毛)。這兩種細(xì)菌均來(lái)源以前研究工作的保種。它們有鞭毛表達(dá),只在菌毛表達(dá)上有差異。
1.2 細(xì)菌培養(yǎng)基和生長(zhǎng)條件
BHIB和LBA培養(yǎng)基分別是相對(duì)高和相對(duì)低營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)的培養(yǎng)基。維羅納氣單胞菌被分別放在不同培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng),等到細(xì)菌長(zhǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后,用于接下來(lái)的半固體培養(yǎng)基穿刺和生物膜形成能力實(shí)驗(yàn)。
1.2 免疫印跡
1.2.1 細(xì)菌菌毛蛋白的收集
首先將兩種培養(yǎng)細(xì)菌用PBS洗滌三次,再將每種細(xì)菌懸浮在1mlPBS溶液中。把此PBS溶液吸入皮下注射器,并對(duì)著eppendorf管壁反復(fù)擠出和吸入。最后在13200轉(zhuǎn)/分鐘,室溫條件下離心25分鐘,以分離細(xì)菌和菌毛蛋白。緊接著加入緩沖溶液,煮沸變性。最后再離心一分鐘,把上層溶液用于跑膠。
1.2.2 SDS-PAGE電泳
按照普通的8%的膠的方法配制凝膠,跑膠。
1.3 半固體培養(yǎng)基穿刺培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)
1.3.1 半固體培養(yǎng)基配制
瓊脂4g/l,牛肉膏粉末3 g/l,蛋白胨5g/l,氯化鈉5 g/l,調(diào)節(jié)pH=7.4?;靹蛉芙夂?以3厘米為高度分裝于玻璃試管中。將分裝后的玻璃試管用錫箔紙包住封口。高溫高壓滅菌,放涼。
1.3.2 細(xì)菌接種
在超凈工作臺(tái)中,用接種針將不同的細(xì)菌分別接種在滅菌后的半固體培養(yǎng)基中。穿刺深度以試管中瓊脂高度的1/2-3/4為宜。穿刺軌跡你應(yīng)循原路退出,刺入及拔出時(shí)要接種針不向穿刺線外擺動(dòng)。穿刺后封口,37℃培養(yǎng),72小時(shí)觀察結(jié)果。如有細(xì)菌沿著穿刺線擴(kuò)散,那么細(xì)菌就有動(dòng)力。每種菌株重復(fù)50次。
1.4 喉上皮細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)(生物膜形成能力檢測(cè))
將兩種不同細(xì)菌接種在兩種不同培養(yǎng)基中。喉上皮細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)的方法與之前報(bào)道的方法一致[4]。
1.5 SPSS統(tǒng)計(jì)分析。
使用SPSS19.0軟件進(jìn)行相關(guān)統(tǒng)計(jì)分析。
結(jié)果表明野生型(MSHB+)有菌毛而突變型(MSHB-)沒(méi)有。βactin是內(nèi)參。
表1 半固體培養(yǎng)基穿刺實(shí)驗(yàn)
圖1 菌毛蛋白表達(dá)的免疫印跡
圖2 喉上皮細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)
結(jié)果表明野生型(MSHB+)比突變型(MSHB-)維羅納氣單胞菌有更強(qiáng)動(dòng)力,但之間并無(wú)顯著區(qū)別(p<0.05)。
結(jié)果表明在兩種不同培養(yǎng)基中(相對(duì)高營(yíng)養(yǎng)的BHIB和相對(duì)低營(yíng)養(yǎng)的LBA),野生型(MSHB+)比突變型(MSHB-)維羅納氣單胞菌都具有更強(qiáng)粘附能力,但無(wú)論哪一種之間并無(wú)顯著區(qū)別(p<0.05)。
生物膜是細(xì)菌在表面生活時(shí)采取的一種生長(zhǎng)方式, 它是細(xì)菌的一種本能, 尤其適合細(xì)菌在不利環(huán)境中生存,對(duì)細(xì)菌產(chǎn)生保護(hù)作用; 生物膜最重要的特性是對(duì)抗生素的高度耐藥性[5],它能夠有效地阻擋藥物作用于膜內(nèi)的細(xì)菌。生物膜與臨床中、西藥耐藥性是目前研究的熱點(diǎn)。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表1)證明,有菌毛表達(dá)的維羅納氣單胞菌有更強(qiáng)的動(dòng)力,而更強(qiáng)動(dòng)力的細(xì)菌更能粘附宿主細(xì)胞(圖2)?;诰⒄掣胶蜕锬ば纬芍g的關(guān)系。通過(guò)本次研究,我們揭示了維羅納菌菌毛部分的致病能力,為藥物開發(fā)等研究奠定一定基礎(chǔ)。
[1]Butler M T,Wang Q,Harshey R M.Cell density and mobility protect swarming bacteria against antibiotics.J Proc Natl Acad Sci U S A,2010,107(8):3776-81.
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Q2
A
1674-2060(2016)03-0005-01
課題來(lái)源: 2015年度湖南省大學(xué)生研究性學(xué)習(xí)和創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)計(jì)劃項(xiàng)目(653);2015年度湖南省教育廳科研項(xiàng)目(15C1255)。
夏金成, 闕彤彤, 張文君, 趙聰,邵陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校2014級(jí)檢驗(yàn)專業(yè)學(xué)生。
楊秦(1981—),男,講師,主要研究方向?yàn)樯锘瘜W(xué)與分子生物學(xué)。