二苯并噻吩脫硫菌Rhodopseudomonas sp.AS-21的脫硫條件優(yōu)化

韓 康，谷朝陽，趙朝成

(中國石油大學(華東)化學工程學院，山東 青島 266580)

二苯并噻吩脫硫菌Rhodopseudomonas sp.AS-21的脫硫條件優(yōu)化

韓 康，谷朝陽，趙朝成

(中國石油大學(華東)化學工程學院，山東 青島 266580)

以二苯并噻吩(DBT)為模式物篩選得到專一性脫硫菌Rhodopseudomonas sp.AS-21。通過單因素考察實驗結果分析溫度、pH、碳源、氮源和DBT初始濃度對脫硫率和細胞濃度的影響，得出菌株的最適宜生長和脫硫條件：培養(yǎng)溫度為30 ℃，初始pH為7.5，碳源為10 g/L甘油，氮源為2 g/L的氯化銨，DBT初始濃度為100 mg/L。利用Design-Expert軟件進行顯著性分析，結果表明溫度、pH、DBT濃度影響的顯著性較高。采用Box-Behnken Design(BBD)響應曲面法設計三因素三水平共20組實驗，得到脫硫率和細胞質(zhì)量濃度的二次回歸模型。在Design-Expert軟件模擬的條件下，以響應值最大為目標進行優(yōu)化求解，結果表明在溫度為29.70 ℃、pH為7.43、DBT初始濃度為105.47 mg/L時可得到最大脫硫率(72.32%)及最大菌株生長量(2.311 g/L)。經(jīng)實驗驗證，所求最優(yōu)解正確。

生物脫硫 二苯并噻吩 脫硫條件 優(yōu)化

自1976年以來，全球低硫原油探明儲量占原油總儲量的15%～27%，并且以每年1.1%的速率下降，但石油需求量卻在增長，因此高硫原油的開采量逐年上升，硫污染帶來的問題凸顯[1-2]。加氫脫硫是石油加工中的主要脫硫方法，但是近年來工業(yè)發(fā)展所產(chǎn)生的污染物已經(jīng)遠遠超出了環(huán)境容量，開發(fā)新的脫硫方式迫在眉睫[3]。生物脫硫作為新的脫硫方式備受青睞。生物脫硫是指在常溫常壓狀態(tài)下，利用微生物體內(nèi)產(chǎn)生的特殊酶分解石油中的硫化合物，將其轉(zhuǎn)化為易分離的物質(zhì)，最后通過物理方法進行分離[4-6]。國內(nèi)外關于生物脫硫的研究雖然已步入正軌，但脫硫菌種仍然較少，生存環(huán)境變化對菌種自身脫硫效果的影響尚不明確。目前發(fā)現(xiàn)的主要脫硫菌有芽孢桿菌屬、紅球菌屬、節(jié)桿菌屬和棒桿菌屬等，但數(shù)量仍然較少。這些菌株可在不打開苯環(huán)的情況下脫除二苯并噻吩(DBT)中的硫，最大限度地保留燃料的熱值[7-12]。

本課題以DBT作為硫源，對實驗室篩選得到的脫硫菌株Rhodopseudomonas sp. AS-21(簡稱AS-21)的脫硫條件進行優(yōu)化，考察溫度、pH、碳源、氮源及初始DBT濃度對脫硫過程的影響，以DBT脫硫率和細胞質(zhì)量濃度作為考察指標。

1 實 驗

1.1 原 料

硝酸銨、氯化銨、硫酸銨、葡萄糖、牛肉膏、蔗糖、淀粉、正十六烷、乙酸鈉、磷酸二氫鉀、十二水合磷酸氫二鈉、六水合氯化鎂、二水合氯化鈣、四水合氯化錳、六水合三氯化鐵，分析純，國藥集團化學試劑有限公司生產(chǎn)；氫氧化鈉，分析純，天津市博迪化工有限公司生產(chǎn)；鹽酸，分析純，開封東大化工有限公司試劑廠生產(chǎn)；二苯并噻吩，分析純，美國SIGMA公司生產(chǎn)。

1.2 儀 器

SPX-250型生化培養(yǎng)箱，上海躍進醫(yī)療器械廠生產(chǎn)；HZQ-QX/QG全溫振蕩器，哈爾濱市東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司生產(chǎn)；雷磁PHS-25型pH計，上海儀電科學儀器有限公司生產(chǎn)；BCM-1000型生物凈化工作臺。

1.3 實驗過程

取1.00 g DBT溶于100 mL丙酮溶液配制成濃度為10 g/L DBT丙酮溶液，將配制好的DBT溶液放入冰箱冷藏。

將磷酸二氫鉀2.44 g、十二水合磷酸氫二鈉14.03 g、六水合氯化鎂0.36 g、二水合氯化鈣1 mg、六水合三氯化鐵1 mg、四水合氯化錳4 mg、碳源10 g、氮源2 g溶于1 L去離子水，配制成液體培養(yǎng)基。碳源分別為甘油、葡萄糖、蔗糖、淀粉、正十六烷，氮源分別為牛肉膏、酵母膏、胰蛋白胨、硫酸銨、硝酸銨、氯化銨。在碳源為甘油、氮源為氯化銨時，所配制的液體培養(yǎng)基被稱為基礎培養(yǎng)基。

將液體培養(yǎng)基在121 ℃高溫下滅菌20 min，冷卻后取100 mL裝入250 mL錐形瓶中，加入一定量的硫源(DBT丙酮溶液)，用鹽酸溶液或NaOH溶液調(diào)節(jié)初始pH，并以5%的接種量接種菌株，然后將錐形瓶放入全溫振蕩器中，在一定溫度、180 r/min的條件下培養(yǎng)3天，得到細菌發(fā)酵液。

取細菌發(fā)酵液25 mL于分液漏斗中，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至2.0，采用等體積的正己烷萃取發(fā)酵液中剩余的DBT，靜置20 min后收集萃取液。由于培養(yǎng)液中的部分無機鹽和水懸浮在萃取液中，將萃取液在8 000 r/min的條件下離心分離10 min，收集正己烷萃取液，用氣相色譜定量分析DBT濃度，并計算脫硫率。

取8 mL細菌發(fā)酵液，在8 000 r/min的條件下離心分離10 min，分離后得到的沉淀為菌體，將其烘干、稱重。配制0.1 mol/L的NaOH溶液，將6.8 g磷酸二氫鉀溶于291 mL NaOH溶液中，用蒸餾水定容至1 L，然后將烘干的菌體加入其中，得到菌懸液。采用分光光度計，通過測定菌懸液在620 nm處的吸光度來確定細胞濃度。菌懸液在620 nm處有特征吸收峰，在一定的吸光度范圍內(nèi)，吸光度跟菌株細胞質(zhì)量濃度有良好的線性關系，可以通過吸光度和菌株細胞質(zhì)量濃度的關系繪出標準曲線。

2 結果與討論

2.1 溫度對脫硫菌生長和脫硫效果的影響

采用基礎培養(yǎng)基，在100 mg/L DBT為唯一硫源、pH為7的條件下，考察溫度對AS-21生長及脫硫效果的影響，結果見圖1。由圖1可以看出：溫度對AS-21生長量和脫硫率的影響趨勢大致相同；低溫時菌株生長量較低，隨著溫度上升，菌株生長量逐漸增大，在30 ℃左右達到最大值，此時細胞質(zhì)量濃度為2.41 g/L，當溫度超過30 ℃時，隨著溫度上升，菌株生長量顯著下降，這說明高溫和低溫都不利于菌株的生長；隨溫度升高，脫硫率呈先增加后降低的變化趨勢，在30 ℃左右時，脫硫效果最好，脫硫率達到78.55%，35 ℃以后脫硫率明顯下降。這是由于脫硫作用依賴細菌中酶的作用，低溫時，菌株生長量處于較低水平，酶的含量低，其活性也較低，隨著溫度升高，酶的含量增加且活性逐漸恢復，在30 ℃時，菌株生長量最大且酶活性較高，此時脫硫率達到最大值；當溫度繼續(xù)升高時，菌株對高溫耐受力較差，同時酶由于空間結構的破壞而活性降低，所以高溫時脫硫率明顯下降。在40 ℃時，菌株生長量較低，雖然菌株生長受到抑制，但仍在產(chǎn)生酶，且由于酶具有一定的積累量，此時菌株的脫硫率仍可達30%以上。AS-21的適宜培養(yǎng)溫度和適宜脫硫溫度均為30 ℃左右。

圖1 溫度對AS-21生長和脫硫效果的影響■—脫硫率；▲—細胞質(zhì)量濃度。 圖2、4、6同

2.2 pH對脫硫菌生長和脫硫效果的影響

采用基礎培養(yǎng)基，在100 mg/L DBT為唯一硫源、溫度為30 ℃的條件下，用鹽酸溶液或NaOH溶液調(diào)整初始pH，考察pH對AS-21生長及脫硫效果的影響，結果見圖2。由圖2可知：pH對AS-21生長量和脫硫率的影響趨勢大致相同，隨pH增加，兩者均呈先增加后降低的變化趨勢；pH為4～6時，AS-21生長量和脫硫率均較低，在pH大于6.5后，AS-21生長速率急劇增大，當pH上升到7.5時，AS-21生長量和脫硫率都達到最大值，脫硫率為74.58%，細胞質(zhì)量濃度達到2.36 g/L，當pH大于7.5時，脫硫率和AS-21生長量都漸漸下降。由圖3還可知，堿性環(huán)境對AS-21生長量和脫硫率的影響弱于酸性環(huán)境，該菌株顯然對堿性環(huán)境的耐受力更強，因此AS-21中的酶對堿性環(huán)境的適應性更強。因此，AS-21的適宜培養(yǎng)pH和適宜脫硫pH均在7.5左右。

圖2 pH對AS-21生長和脫硫效果的影響

2.3 碳源對脫硫菌生長和脫硫效果的影響

在DBT初始濃度為100 mg/L、溫度為30 ℃、pH為7.5、氮源為氯化銨的條件下，考察液體培養(yǎng)基中的碳源種類對AS-21生長及脫硫效果的影響，結果見圖3。由圖3可知，以甘油作為碳源時，AS-21的生長量和脫硫率都大于其它碳源條件下的相應值，此時脫硫率為69.59%，細胞質(zhì)量濃度為2.21 g/L。因此，AS-21培養(yǎng)基的適宜碳源為甘油。

圖3 不同碳源對AS-21生長和脫硫效果的影響■—脫硫率；■—細胞質(zhì)量濃度。 圖5同

在DBT初始濃度為100 mg/L、溫度為30 ℃、pH為7.5的條件下，甘油濃度對AS-21生長及脫硫效果的影響，結果見圖4。由圖4可以看出:在甘油濃度為10 g/L時，AS-21的生長量和脫硫率均達到最大值，細胞質(zhì)量濃度和脫硫率分別為2.11 g/L和71.35%;在甘油濃度較低時，碳源量不足，AS-21因缺少碳源而無法持續(xù)增殖，菌株生長量較低，酶含量較低，脫硫效果較差；隨著甘油濃度的增加，菌株生長量增加，在甘油濃度為10 g/L時達到最大值，此時也達到最佳脫硫效果；但當甘油濃度繼續(xù)增加到一定程度時，由于微生物的不斷增殖，其代謝產(chǎn)物會對微生物產(chǎn)生不利影響，反過來會遏制微生物的生長，使微生物生長量開始下降，脫硫率也隨之降低。因此，最佳甘油濃度為10 g/L。

圖4 甘油濃度對AS-21生長和脫硫效果的影響

2.4 氮源對脫硫菌生長和脫硫效果的影響

圖5 不同氮源對AS-21生長和脫硫效果的影響

在DBT初始濃度為100 mg/L、溫度為30 ℃、pH為7.5、碳源為甘油的條件下，考察液體培養(yǎng)基中的氮源種類對AS-21生長及脫硫效果的影響，結果見圖5。由圖5可知：不同氮源對AS-21生長和脫硫效果的影響是不同的，其中酵母膏、牛肉膏、胰蛋白胨等有機氮源比硝酸銨、硫酸銨、氯化銨等無機氮源更有利于菌株的生長，采用有機氮源時AS-21的細胞質(zhì)量濃度均在1.90 g/L以上，采用無機氮源時AS-21的細胞質(zhì)量濃度均在1.50 g/L以下；然而，不同氮源對脫硫率的影響與對AS-21生長量的影響恰恰相反，無機氮源比有機氮源更有利于菌株的脫硫，其中氯化銨的效果最佳，脫硫率可達76.55%。這是由于不同氮源對AS-21菌株酶的合成作用效果不同，而酶對脫硫效果的影響十分顯著，盡管有機氮源使菌株生長量較高，但不利于酶的合成，因此脫硫率和細胞質(zhì)量濃度沒有呈現(xiàn)正相關關系。對于這種情形，可能是由于有機氮源中含有能干擾微生物脫硫的含硫氨基酸(如蛋氨酸、半胱氨酸等)，抑制了菌株脫硫活性的發(fā)揮。

2.5 DBT初始濃度對脫硫菌生長和脫硫效果的影響

采用基礎培養(yǎng)基，在溫度為30 ℃、pH為7.5的條件下，考察DBT初始濃度對AS-21生長及脫硫效果的影響，結果見圖6。由圖6可知：隨著DBT初始濃度的增加，AS-21生長量和脫硫率均呈先增加后降低的變化趨勢，當DBT初始濃度為100 mg/L左右時，AS-21生長和脫硫效果均達到最佳狀態(tài)，細胞質(zhì)量濃度和脫硫率分別為2.56 g/L和76.58%。這是由于當DBT初始濃度較低時，DBT作為唯一硫源，其量較少，阻礙了AS-21的生長，菌株中酶的合成也受到影響；但是當DBT初始濃度過高時，過量的DBT對AS-21產(chǎn)生毒害作用，抑制了脫硫菌株的生長，導致菌株生長量下降，同時酶的量也隨之減少。因此，適宜的DBT初始濃度為100 mg/L。

圖6 DBT初始濃度對AS-21生長和脫硫效果的影響

2.6 培養(yǎng)條件的優(yōu)化

2.6.1 顯著性因子篩選實驗(PB) 在單因素實驗結果的基礎上，依據(jù)實驗過程中每個因素的取值范圍，對每個因素取高水平和低水平進行試驗，高水平對應實驗條件的最大值，低水平對應實驗條件的最小值，如表1所示。

表1 PB實驗因素與水平

通過利用Design-Expert軟件對表1中5個因素進行顯著性分析，結果如表2所示。由表2可知，貢獻值較大的影響因素有3個，分別為溫度、pH、DBT初始濃度。

表2 影響因子的顯著性分析結果

2.6.2 BBD實驗設計及結果 以溫度、pH、DBT初始濃度為考察因素，即自變量，以菌株生長量和脫硫率為響應值，即因變量，采用Box-Behnken Design(BBD)響應曲面法設計三因素三水平共20組實驗，各因子水平如表3所示，實驗方案及結果如表4所示。

表3 BBD響應曲面法的因子水平

表4 BBD響應曲面法的實驗方案及結果

利用Design-Expert軟件對表4中實驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，獲得二次多項式回歸方程預測模型，如式(1)和式(2)所示。

(1)

(2)

式中：Y1為脫硫率，%；Y2為細胞質(zhì)量濃度，mg/L；X1為溫度，℃；X2為pH；X3為DBT初始濃度，mg/L。

在Design-Expert軟件模擬的條件下，以響應值最大為目標進行優(yōu)化求解，結果表明，在溫度為29.70 ℃、pH為7.43、DBT初始濃度為105.47 mg/L時可得到最大脫硫率(72.32%)及最大細胞質(zhì)量濃度(2.311 g/L)。采用上述最優(yōu)脫硫條件和生長條件進行實驗，在溫度為29.70 ℃、pH為7.43、DBT初始濃度為105 mg/L、碳源為10 g/L甘油、氮源為2 g/L氯化銨的條件下培養(yǎng)3天后，測得脫硫率為74.00%、細胞質(zhì)量濃度為2.49 g/L，與預測結果接近，說明該回歸模型有效。

3 結 論

(1) 通過單因素考察實驗得出AS-21菌株的最適宜生長和脫硫條件：培養(yǎng)溫度為30 ℃，初始pH為7.5，碳源為10 g/L甘油，氮源為2 g/L的氯化銨，DBT初始濃度為100 mg/L。

(2) 利用Design-Expert軟件進行影響因素顯著性分析，結果表明溫度、pH、DBT初始濃度影響的顯著性較高。

(3) 采用BBD響應曲面法設計了三因素三水平共20組實驗，得到脫硫率和細胞質(zhì)量濃度的二次回歸模型。在Design-Expert軟件模擬的條件下，以響應值最大為目標進行優(yōu)化求解，得到最優(yōu)條件為溫度29.70 ℃、pH為7.43、DBT初始濃度105.47 mg/L，在該條件下脫硫率為72.32%、細胞質(zhì)量濃度為2.311 g/L；對上述最優(yōu)條件進行實驗驗證，脫硫率為74.00%、細胞質(zhì)量濃度為2.49 g/L，與模型預測結果十分接近。

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OPTIMIZATION OF DIBENZOTHIOPHENE DESULFURIZATION CONDITIONS OF BACTERIUM RHODOPSEUDOMONAS SP. AS-21

Han Kang，Gu Zhaoyang，Zhao Chaocheng

(CollegeofChemicalEngineeringofChinaUniversityofPetroleum，Qingdao，Shandong266580)

The specific DBT desulfurization bacterium Rhodopseudomonas sp. AS-21 was selected. The effects of temperature，pH，carbon source，nitrogen source，and initial concentration of DBT on S removal rate and cell concentration were investigated by single-factor experiments. The best conditions for the growth and desulfurization of AS-21 is 30 ℃，initial pH 7.5，concentration of glycerin as carbon source 10 g/L，concentration of NH4Cl as nitrogen source 2 g/L and initial concentration of DBT 100 mg/L. The significance analysis results with Design-Expert show that temperature，pH and initial concentration of DBT have higher effects on desulfurization. Box-Behnken Design (BBD) response surface methodology was used to design total 20 experiments with three factors and three levels to obtain quadratic regression model for desulfurization rate and cell mass concentration. The optimization solution of the maximum response values under the simulated conditions by Design-Expert software predicts that the best factors for the highest desulfurization rate and strain growth are 29.70 ℃，pH 7.43，initial concentration of DBT 105.47 mg/L. The highest desulfurization rate and strain growth are 72.32% and 2.311 g/L，respectively，which are proven to be right through experiments.

biodesulfurization；dibenzothiophene；desulphurization condition；optimization

2015-12-14；修改稿收到日期：2016-03-29。

韓康，碩士研究生，主要研究方向為原油生物脫硫和廢水同步脫硫脫氮。

趙朝成，E-mail：zhaochch@upc.edu.cn。