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電刺激抗胃食管反流的作用及其相關(guān)神經(jīng)通路的初步探討*

杜植鵬#王斌&張偉劉晟宋鑫仇明&

第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長征醫(yī)院普外三科(200003)

背景：局部電刺激下食管括約肌(LES)作為治療胃食管反流病的新理念正處于起步階段。目的：探索局部電刺激的理想?yún)?shù)，并初步探討抑制LES收縮的局部神經(jīng)反射通路。方法：構(gòu)建抗胃食管反流的電刺激活體動(dòng)物模型。觀察胃食管反流量變化，探索電刺激抗胃食管反流的理想?yún)?shù)。在理想?yún)?shù)刺激下，分別加入不同藥物干預(yù)，觀察對胃食管反流量的影響。結(jié)果：頻率10 Hz和脈沖0.4 ms時(shí)，電壓10 V或15 V的胃食管反流量明顯減少(P<0.001)；電壓10 V和脈沖0.4 ms時(shí)，頻率10 Hz的胃食管反流量明顯減少(P<0.001)；電壓10 V和頻率10 Hz 時(shí)，脈沖0.4 ms的胃食管反流量顯著降低(P<0.001)。食管壁局部浸潤筒箭毒堿或辣椒素可顯著提高胃食管反流量(P<0.05)；給予NK1受體阻斷劑L-732,138或NO合酶抑制劑L-NAME后，胃食管反流量顯著減少(P<0.05)。結(jié)論：考慮到電能對組織的損傷，理想電刺激參數(shù)為電壓10 V、頻率10 Hz和脈沖0.4 ms。食管壁內(nèi)TRPV-1陽性的初級傳入速激肽類神經(jīng)元與肌間氮能神經(jīng)元組成的局部反射通路可削弱電刺激誘發(fā)的LES收縮。

關(guān)鍵詞胃食管反流??；電刺激；食管括約肌，下段；反射通路；辣椒素

Effect of Electrical Stimulation on Anti-reflux of Gastroesophageal Junction and Preliminary Exploration of Related Neural Pathway

DUZhipeng,WANGBin,ZHANGWei,LIUSheng,SONGXin,QIUMing.DepartmentofGeneralSurgery,ChangzhengHospital,theSecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai(200003)

Co-correspondence to: WANG Bin, Email: wangbin12048@163.com; QIU Ming, Email: qium127@sina.com

Background: As a new concept of treatment for gastroesophageal reflux disease (GERD), local electrical stimulation on lower esophageal sphincter (LES) is still in a preliminary stage. Aims: To explore the ideal local electrical stimulation parameters for LES contraction and the local neural reflex path that inhibits LES contraction. Methods: Anti-gastroesophageal reflux model with electrical stimulationinvivowas established. The changes of gastroesophageal reflux were observed to explore the ideal electrical stimulation parameters for LES contraction. Effects of different drugs on gastroesophageal reflux in condition with ideal electrical stimulation parameters were observed. Results: When frequency was 10 Hz and pulse was 0.4 ms, gastroesophageal reflux in voltage 10 V or 15 V groups was significantly decreased (P<0.001). When voltage was 10 V and pulse was 0.4 ms, gastroesophageal reflux in frequency 10 Hz group was significantly decreased (P<0.001). When voltage was 10 V and frequency was 10 Hz, gastroesophageal reflux in pulse 0.4 ms group was significantly decreased (P<0.001). Local infiltration of tubocurarine or capsaicin on LES could significantly increase gastroesophageal reflux (P<0.05). The administration of NK1 receptor blocker L-732,138 or NO synthase inhibitor L-NAME could significantly decrease gastroesophageal reflux (P<0.05). Conclusions: In view of the injury of electrical energy on tissue, the ideal electrical stimulation parameters are voltage of 10 V, frequency of 10 Hz and pulse of 0.4 ms. Local neural reflex path consisted of primary TRPV-1-positive tachykininergic neurons and nitrergic neurons in the muscle layer of esophagus could inhibit LES contraction evoked by electrical stimulation

Key wordsGastroesophageal Reflux Disease;Electric Stimulation;Esophageal Sphincter, Lower;

Reflex Path;Capsaicin

下食管括約肌(lower esophageal sphincter, LES)松弛是胃食管反流病(gastroesophageal reflux disease, GERD)的重要發(fā)病機(jī)制之一[1]。針對這一病因，目前最常用的抗反流術(shù)式為腹腔鏡下胃底折疊術(shù)，抗反流效果較好，但術(shù)后可發(fā)生嚴(yán)重的并發(fā)癥如吞咽困難、上腹部飽脹感、打嗝困難等。最近有學(xué)者提出新的治療理念，即對LES行局部電刺激迷走神經(jīng)末梢釋放乙酰膽堿，引起括約肌收縮，提高LES壓力(LES pressure, LESP)，進(jìn)而加強(qiáng)胃食管的抗反流屏障功能[2]。該方法符合生理解剖特點(diǎn)，強(qiáng)度可調(diào)控，同時(shí)具有手術(shù)時(shí)間短、不會(huì)影響術(shù)后正常吞咽功能的優(yōu)勢。但這種治療理念目前仍處于起步階段，引起LES收縮的理想?yún)?shù)(頻率、電流、脈沖、持續(xù)時(shí)間等)仍鮮有文獻(xiàn)報(bào)道。有研究發(fā)現(xiàn)，在GERD發(fā)病機(jī)制中，LES松弛可能與抑制性神經(jīng)遞質(zhì)如一氧化氮(nitric oxide, NO)、血管活性肽、神經(jīng)肽等有關(guān)，這些神經(jīng)遞質(zhì)與乙酰膽堿共同作用于食管運(yùn)動(dòng)終板，拮抗乙酰膽堿的作用[3]。這些分泌抑制性神經(jīng)遞質(zhì)的神經(jīng)元分布于食管壁肌層。由此推測，食管壁肌層可能存在抑制LES收縮的局部反射通路，但目前該通路的神經(jīng)元組成尚不清楚。既往相關(guān)研究均在離體條件下完成，本研究通過構(gòu)建電刺激抗胃食管反流的活體動(dòng)物模型，旨在探索局部電刺激抗胃食管反流的理想?yún)?shù)，以及在理想?yún)?shù)刺激和不同藥物的干預(yù)下，初步探討抑制LES收縮的肌間神經(jīng)反射通路。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要器材

健康5月齡新西蘭大白兔30只(第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，雌雄不拘，體質(zhì)量2.5~3.0 kg；置于普通級動(dòng)物飼養(yǎng)室，室溫20~24 ℃，光照和黑暗各12 h交替，自由進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料和飲水。

電刺激系統(tǒng)采用生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)BL-420F(成都泰盟科技有限公司)。

二、研究方法

1. 電刺激模型的建立：大白兔術(shù)前48 h禁食，禁水6 h，腹腔注射10%水合氯醛(3 mL/kg)進(jìn)行麻醉。取劍突下正中切口，充分暴露并游離食管下端和胃食管交界區(qū)，經(jīng)口插入10 Fr雙腔導(dǎo)尿管，手指探查確認(rèn)導(dǎo)尿管末端至胃賁門處，向外拔出4 cm至LES上方1~2 cm處，氣囊內(nèi)注入3 mL 0.9% NaCl溶液固定導(dǎo)尿管。導(dǎo)尿管的另一端在體外接延長管，延長管的出水口置于電子天平上換藥碗上方3 cm 處。結(jié)扎胃幽門，灌洗清除胃腔內(nèi)食物殘?jiān)?。靜脈輸液管一端置入胃腔內(nèi)，另一端連接輸液袋(500 mL 0.9% NaCl溶液)。電刺激開始前，將0.9% NaCl溶液以恒定的壓力(280~300 mm Hg)(1 mm Hg=0.133 kPa)灌胃，并排空輸液管和導(dǎo)尿管中的殘留氣體。將兩個(gè)電極針(長約0.5 cm，直徑0.3 mm)沿食管縱軸方向固定于食管壁LES肌層中，兩個(gè)電極針呈180°對稱。電極針外接金屬導(dǎo)線，連于脈沖發(fā)生器。按照預(yù)先設(shè)定的參數(shù)進(jìn)行電刺激，刺激時(shí)間為20 s，記錄每次電刺激期間從胃腔反流至食管的0.9% NaCl溶液的流量(精確到0.01 g)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。每次電刺激間隔約 3 min。術(shù)后處死動(dòng)物。

2. 理想?yún)?shù)的設(shè)置：取15只新西蘭大白兔，按照不同的電刺激參數(shù)采集三組數(shù)據(jù)。A組固定頻率和脈沖(頻率10 Hz，脈沖0.4 ms)，改變電壓：A0無電刺激(生理?xiàng)l件下)；A1電壓5 V；A2電壓10 V；A3電壓15 V。B組固定電壓和脈沖(電壓10 V，脈沖0.4 ms)，改變頻率：B0無電刺激(生理?xiàng)l件下)；B1頻率5 Hz；B2頻率10 Hz；B3頻率20 Hz。C組固定電壓和頻率(電壓10 V，頻率10 Hz)，改變脈沖：C0無電刺激(生理?xiàng)l件下)；C1脈沖0.4 ms；C2脈沖0.8 ms；C3脈沖1.2 ms。

3.藥物干預(yù)效果：取剩余15只大白兔，用浸泡藥物溶液的紗布條(3 cm×1 cm)覆蓋于大白兔腹段食管上，充分接觸并浸潤食管壁10 min后去除紗條，然后進(jìn)行電刺激，電刺激方法和設(shè)備同前，參數(shù)為上文得到的理想電刺激參數(shù)。15只大白兔按不同的藥物干預(yù)分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組，每組各5只。Ⅰ組采集2組數(shù)據(jù)，Ⅰa為空白對照組(電刺激+無藥物干預(yù))；Ⅰb為筒箭毒堿干預(yù)組[電刺激+5 μmol/L筒箭毒堿溶液(上海思域化工科技有限公司)]。Ⅱ組采集3組數(shù)據(jù)，Ⅱa為空白對照組(電刺激+無藥物干預(yù))；Ⅱb為辣椒素干預(yù)組[電刺激+10 μmol/L辣椒素(美國Sigma公司)]；Ⅱc為NK1受體阻斷劑L-732,138干預(yù)組[電刺激+10 μmol/L辣椒素+1 μmol/L L-732,138(美國Sigma公司)]。Ⅲ組采集3組數(shù)據(jù)，Ⅲa為空白對照組(電刺激+無藥物干預(yù))；Ⅲb組為辣椒素干預(yù)組(電刺激+10 μmol/L辣椒素)；Ⅲc組為NO合酶抑制劑L-NAME干預(yù)組[電刺激+10 μmol/L辣椒素+ 100 μmol/L L-NAME(上海北諾生物科技有限公司)]。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié)果

一、理想電刺激參數(shù)

A0、B0、C0三組胃食管反流量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.975)。給予電刺激后，除A1組與A0組無明顯差異外，A2、A3、B1、B2、B3、C1、C2、C3組的胃食管反流量均顯著低于各自對照組(P<0.05)(表1)。

1. 電壓：給予電刺激后，A1組與A0組胃食管反流量無明顯變化(t=0.245，P=0.810)，A2組和A3組胃食管反流量顯著降低(P<0.05)，而A2組和A3組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.755，P=0.101)。說明固定頻率10 Hz和脈沖0.4 ms的條件下，電壓10 V和15 V均能使胃食管反流量減少，考慮電壓越大，對活體損傷越大，可認(rèn)為10 V為較適宜的刺激電壓。

2. 頻率：B1、B2、B3三組胃食管反流量相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=6.860，P=0.001)，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，B2組又顯著低于B1和B3組(t=-24.40,P<0.001；t=-27.05,P<0.001)。說明在固定電壓10 V和脈沖0.4 ms的條件下，10 Hz為較適宜的刺激頻率；

3. 脈沖：C1、C2、C3三組胃食管反流量相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2.055，P<0.038)，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，C1組又顯著低于C2和C3組(t=-15.13,P<0.001；t=-25.03,P<0.001)。說明在固定電壓10 V和頻率10 Hz的條件下，0.4 ms為較適宜的刺激脈沖。

二、藥物干預(yù)效果

在理想電刺激參數(shù)(電壓10 V、頻率10 Hz和脈沖0.4 ms)的刺激下，Ⅰa組胃食管反流量顯著低于Ⅰb組(t=-37.658，P<0.001)(圖1)，說明筒箭毒堿可顯著抑制電刺激誘導(dǎo)的LES收縮。Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc組之間胃食管反流量相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=103.893，P<0.001)，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，Ⅱa組顯著低于Ⅱc組(t=-14.573，P<0.001)，Ⅱc組顯著低于Ⅱb組(t=3.097，P=0.036)(圖2)，說明辣椒素可顯著抑制電刺激誘導(dǎo)的LES收縮，而NK1受體抑制劑可明顯削弱辣椒素對LES收縮的抑制作用。Ⅲa、Ⅲb、Ⅲc組之間胃食管反流量相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=46.913，P<0.001)，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，Ⅲa組顯著低于Ⅲc組(t=-6.690，P=0.003)，Ⅲc組顯著低于Ⅲb組(t=4.233，P=0.013)(圖3)，說明NO合酶抑制劑同樣可顯著降低辣椒素對LES收縮的抑制作用。

表1　各組胃食管反流量

**P<0.01

*P<0.05，**P<0.01

*P<0.05，**P<0.01

目前食管括約肌的局部電刺激療法在國內(nèi)外還處于探索階段，一些問題仍尚待解決，如引起LES收縮的理想?yún)?shù)(頻率、電流、脈沖、持續(xù)時(shí)間等)、電極片植入食管的解剖層面、距離LES的距離以及兩個(gè)電極片之間的距離等。刺激能量過小達(dá)不到提高LESP的效果，能量過大會(huì)產(chǎn)生致命性心律失常的風(fēng)險(xiǎn)。國外研究[4-6]采用的電刺激參數(shù)差異較大，刺激電流為3~15 mA，電波脈沖為200 μs~375 ms，刺激頻率更是從6次/min至20 Hz不等。食管環(huán)肌收縮可提高LESP，縱肌則反之。兩者對電流頻率的反應(yīng)不同，引起環(huán)肌收縮的頻率為5~20 Hz，高于20 Hz則環(huán)肌的收縮效應(yīng)會(huì)降低，而引起縱肌收縮的頻率為10~40 Hz[7]，因此5~10 Hz的頻率可能同時(shí)引起環(huán)肌收縮和縱肌松弛，對于提高LESP也許是理想的頻率。本研究證實(shí)電壓10 V、頻率10 Hz、脈沖0.4 ms是理想的電刺激參數(shù)。

GERD是一種典型的食管活動(dòng)異常，主要病因?yàn)槲杆岣叻置?、LES異常松弛以及食管體部廓清能力降低[8]。食管動(dòng)力受迷走運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元與肌間神經(jīng)元雙重支配，特別是興奮性膽堿能神經(jīng)元和抑制性氮能神經(jīng)元。一些食管疾病的病理機(jī)制可能與神經(jīng)調(diào)控失調(diào)有關(guān)，尤其是興奮性神經(jīng)元和抑制性神經(jīng)元的失衡[9]。食管肌層收縮主要受中樞神經(jīng)系統(tǒng)的迷走神經(jīng)支配，而食管蠕動(dòng)主要由外源性神經(jīng)元而非內(nèi)源性神經(jīng)元調(diào)控[10-11]。本研究結(jié)果顯示，局部濕敷乙酰膽堿受體抑制劑筒箭毒堿可顯著抑制LES收縮，導(dǎo)致胃食管反流量增多，證實(shí)削弱迷走神經(jīng)釋放乙酰膽堿，可有效抑制LES收縮，降低LESP。有研究顯示，給予游離大鼠食管電刺激迷走神經(jīng)，可誘發(fā)食管肌肉的收縮反應(yīng)；而在離體條件下，在浸有食管的溶液中加入辣椒素和胡椒堿，可削弱迷走神經(jīng)釋放乙酰膽堿，從而阻斷迷走神經(jīng)介導(dǎo)的食管收縮[12]。

本研究還發(fā)現(xiàn)，局部濕敷辣椒素同樣可有效抑制LES收縮。辣椒素為速激肽類傳入神經(jīng)元和肌間氮能神經(jīng)元的激動(dòng)劑，可激活食管壁肌間抑制性神經(jīng)元，說明速激肽類傳入神經(jīng)元和肌間氮能神經(jīng)元可拮抗乙酰膽堿的功能。辣椒素并非直接作用于乙酰膽堿和迷走神經(jīng)，由此推測，哺乳動(dòng)物食管肌層內(nèi)可能存在局部神經(jīng)反射通路，該通路雖不能直接阻斷迷走運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元釋放乙酰膽堿，但可拮抗乙酰膽堿對LES運(yùn)動(dòng)終板的興奮作用。該反射弧包括對辣椒素敏感的初級傳入神經(jīng)元。而有研究發(fā)現(xiàn)，食管肌層中的初級神經(jīng)元為速激肽類傳入神經(jīng)元，該神經(jīng)元表達(dá)瞬時(shí)感受器電位香草酸受體1(transient receptor potential vanilloid-1, TRPV-1)[13]。辣椒素為TRPV-1高選擇性激動(dòng)劑[13]，通過激活TRPV-1促進(jìn)速激肽類神經(jīng)元釋放速激肽，介導(dǎo)LES舒張[9]。本研究加入速激肽NK1受體阻滯劑L-732,138后，胃食管反流量明顯減小，證實(shí)速激肽類神經(jīng)元參與該局部反射通路；而加入NO合酶抑制劑L-NAME可大大降低辣椒素對LES收縮的抑制效應(yīng)，說明NO參與調(diào)節(jié)LES的松弛，進(jìn)而證實(shí)肌間氮能神經(jīng)元為肌間局部反射通路的組成部分。該肌間局部反射通路包括TRPV-1陽性的初級傳入速激肽類神經(jīng)元和肌間氮能神經(jīng)元，可拮抗乙酰膽堿能神經(jīng)元對LES的收縮效應(yīng)。

本研究首次構(gòu)建活體胃食管反流測量模型，通過實(shí)驗(yàn)中的觀察和體會(huì)，總結(jié)以下經(jīng)驗(yàn)：①本實(shí)驗(yàn)大白兔的LES較適宜的電刺激參數(shù)為經(jīng)驗(yàn)數(shù)據(jù)，并未考慮電壓、頻率和脈沖同時(shí)改變的相互影響，將在進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)中完善這一數(shù)據(jù)；②因考慮Forley導(dǎo)尿管氣囊過分充盈會(huì)對食管功能產(chǎn)生影響，前期出現(xiàn)氣囊灌注不足，造成1只大白兔誤吸；1只過量灌注(8 mL)導(dǎo)致食管破裂，后改為以最小灌注量(約3 mL)使導(dǎo)尿管固定為宜；③實(shí)驗(yàn)過程中，嘗試電刺激迷走神經(jīng)使LES收縮，2 min后1只大白兔心跳呼吸驟停死亡，考慮電刺激迷走神經(jīng)存在較大風(fēng)險(xiǎn)，不建議在活體行迷走神經(jīng)電刺激法；④結(jié)扎幽門處不宜過低，實(shí)驗(yàn)中1只大白兔結(jié)扎位置位于幽門遠(yuǎn)端2 cm處，后在測反流過程中，由于十二指腸壁壓力過大，造成十二指腸壁破裂，需再次調(diào)整結(jié)扎位置，建議于幽門處結(jié)扎為宜；⑤雖然禁食48 h可排空大部分胃內(nèi)容物，但仍會(huì)存留少部分殘?jiān)?，若殘?jiān)w粒較大，會(huì)封堵Forley導(dǎo)尿管開口，影響反流液體的流動(dòng)。因此，測量數(shù)據(jù)前，務(wù)必將胃腔殘?jiān)鼜氐浊謇怼?/p>

總之，本研究成功地構(gòu)建了抗胃食管反流的電刺激活體動(dòng)物模型，并探索了電刺激的理想?yún)?shù)，初步探討了抑制LES收縮的局部神經(jīng)通路；為進(jìn)一步探索GERD的發(fā)病機(jī)制和局部電刺激治療的療效提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

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(2015-10-12收稿；2015-10-22修回)

*基金項(xiàng)目：上海市衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)科研課題青年項(xiàng)目(20144Y0199)；長征醫(yī)院青年啟動(dòng)基金(2013czqn08)

DOI:10.3969/j.issn.1008-7125.2016.02.004

#Email: dolivy@163.com

&本文共同通信作者，王斌，Email: wangbin12048@163.com；仇明，Email: qium127@sina.com