劉浩然， 范新榮， 李鵬云， 李濤， 曾博

(西南醫(yī)科大學(xué)心血管醫(yī)學(xué)研究所，醫(yī)學(xué)電生理教育部重點實驗室，四川瀘州646000)

溫度敏感型離子通道基因在哺乳動物內(nèi)臟器官和血管中的表達(dá)研究

劉浩然， 范新榮， 李鵬云， 李濤， 曾博*

(西南醫(yī)科大學(xué)心血管醫(yī)學(xué)研究所，醫(yī)學(xué)電生理教育部重點實驗室，四川瀘州646000)

溫度敏感型離子通道廣泛存在于哺乳動物內(nèi)臟器官和血管組織，在多種生理功能的調(diào)節(jié)中起重要作用。本研究以雄性比格犬和雄性SD大鼠的心臟、肝、脾、腎、肺、主動脈、肺動脈、肺靜脈、股動脈、股靜脈及頸總動脈為材料提取RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄PCR以及半定量方法獲得這些通道基因的表達(dá)情況。結(jié)果顯示：TRPV1在2種動物的上述組織中均有表達(dá)，而TRPV2和TRPM5在所有組織中均無表達(dá)；TRPV3僅表達(dá)在大鼠的肝、肺及肺動脈中，在狗的所有組織中均無表達(dá)；TRPV4在狗的肺中無表達(dá)，在2種動物的其他組織中均有表達(dá)；TRPM2在大鼠的主動脈、心臟、肺動脈中無表達(dá)，在2種動物的其他組織中均有表達(dá)；TRPM3在狗的肺、肺動脈及大鼠的肺、心臟、主動脈中無表達(dá)，在2種動物的其他組織中均有表達(dá)；TRPM4在狗的肺動脈以及大鼠的脾、腎、心臟中沒有檢測到表達(dá)，在2種動物的其他組織中均有表達(dá)；TRPM8在狗的肝、脾、腎以及大鼠的腎中無表達(dá)，在2種動物的其他組織中均有表達(dá)；TRPA1僅在大鼠的肺和脾中有表達(dá)。本研究比較全面地展示了溫度敏感型離子通道基因在哺乳動物內(nèi)臟器官和血管中的表達(dá)情況，為進(jìn)一步探究其在哺乳動物生理調(diào)節(jié)中的功能奠定基礎(chǔ)。

溫度敏感；瞬時電位受體通道；哺乳動物；基因表達(dá)；內(nèi)臟器官；血管

瞬時電位受體通道(transient receptor potential channels，TRP channels)是一類具有多種調(diào)控方式的非選擇性陽離子通道，這是一個擁有7大亞科(TRPC、TRPV、TRPA、TRPM、TRPML、TRPP、TRPN)共30余種通道蛋白的總家族(Venkatachalam & Montell，2007)，最早于1979年在黑腹果蠅Drosophilamelanogaster的視覺傳導(dǎo)系統(tǒng)中被發(fā)現(xiàn)，此類離子通道廣泛地參與到機(jī)體生理和病理水平調(diào)控中，如介導(dǎo)免疫(Zhaoetal.，2015)、異常的痛覺感應(yīng)(Julius，2013)、腎臟疾病(Tomilinetal.，2015)及神經(jīng)水平調(diào)控(Tomilinetal.，2015)、先天性心臟疾病(Yue & Xie，2015)、癌癥(Fiorioetal.，2012)等的發(fā)生。在TRP家族離子通道中含有1組分別可以感受熱刺激的TRPV1、TRPV2、TRPV3、TRPV4、TRPM2(Togashietal.，2006)、TRPM3(Vriensetal.，2011)、TRPM4(Vennekens & Nilius，2007)、TRPM5 (Talaveraetal.，2005)離子通道和感受冷刺激的TRPM8、TRPA1(Madrid & Pertusa，2014)離子通道。此類蛋白在受到環(huán)境溫度變化等刺激后會開放通道并導(dǎo)致鈣離子內(nèi)流，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)平衡從而廣泛地參與到哺乳動物生理及病理水平的調(diào)控中，如TRPV1參與介導(dǎo)急性結(jié)腸炎后的內(nèi)臟疼痛(Lapointeetal.，2015)，TRPV2參與維持心肌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)及功能(Katanosakaetal.，2014)，TRPV3參與介導(dǎo)口腔上皮創(chuàng)傷后灼熱感覺的形成(Aijimaetal.，2015)，TRPV4介導(dǎo)調(diào)控大腦微血管在機(jī)械牽張條件下相關(guān)酶的表達(dá)(蒲九君等，2015)，TRPM2參與介導(dǎo)腎臟缺血后的氧化應(yīng)激及損傷(Gaoetal.，2014)，TRPM3參與感受傷害性熱刺激(Vriensetal.，2011)，TRPM4和TRPM5參與介導(dǎo)胰島素分泌(Shigetoetal.，2015)，TRPM8參與介導(dǎo)腫瘤發(fā)生機(jī)制(Liuetal.，2016)等。溫度敏感型離子通道在生理水平調(diào)控及疾病發(fā)生發(fā)展中均起到重要的作用，但在目前國內(nèi)外的相關(guān)文獻(xiàn)報道中，對于此類溫度敏感型離子通道基因在哺乳動物內(nèi)臟器官和血管中的具體表達(dá)情況尚未有系統(tǒng)性的研究。因此，本文較為系統(tǒng)地檢測了溫度敏感型離子通道基因在哺乳動物內(nèi)臟器官和部分血管中的表達(dá)情況，為此類通道在哺乳動物體內(nèi)的功能以及在人體內(nèi)的后續(xù)研究做鋪墊。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗使用的3只未成年雄性比格犬和3只成年雄性SD大鼠均購自西南醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心[實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(川)2013-17，實驗動物使用許可證號：SYXK(川)2013-181]，取狗和大鼠的心臟、脾、肝、腎、肺、主動脈、肺動脈、肺靜脈、股動脈、股靜脈、頸總動脈，并存入RNALater (Qiagen)后-80 ℃保存；PCR中所使用的Goldstar Best MasterMix高保真聚合酶(CW0960A)、總RNA提取所用的超純RNA提取試劑盒(CW0581)以及逆轉(zhuǎn)錄所用HiFi-script cDNA第一鏈合成試劑盒(CW2569-100)均購自康為世紀(jì)公司(北京)；引物由成都擎科梓熙生物技術(shù)公司合成。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取 取狗和大鼠相關(guān)組織約500 μg，按照超純RNA提取試劑盒說明方法進(jìn)行，收集RNA溶液，-80 ℃保存。

1.2.2 反轉(zhuǎn)錄 以各組織總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA序列。按照HiFi-script cDNA第一鏈合成試劑盒說明方法合成cDNA，-20 ℃保存。

1.2.3 引物設(shè)計 根據(jù)GenBank中狗和大鼠的TRPV1、TRPV2、TRPV3、TRPV4、TRPM2、TRPM3、TRPM4、TRPM5、TRPM8、TRPA1基因序列，設(shè)計可以擴(kuò)增2種動物相應(yīng)基因的跨物種通用引物(表1)。

表1 溫度敏感型離子通道基因的引物Table 1 Primers of genes encoding temperature-sensitive ion channel

1.2.4 溫度敏感型離子通道基因的PCR擴(kuò)增 溫度敏感型離子通道基因的逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)以狗和大鼠相關(guān)組織的cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，PCR體系為：10 μL Goldstar Best MasterMix，1 μL cDNA模板，1 μL 5’端引物以及1 μL 3’端引物，加水補(bǔ)足至20 μL體系。將PCR體系混合均勻后，95 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃變性30 s，在各基因的特有退火溫度下退火30 s，72 ℃延伸2 min，35個循環(huán)；72 ℃最后延伸5 min。反應(yīng)完成后，取3 μL PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測。

1.2.5 表達(dá)水平的計算 參照表1中各目的基因的擴(kuò)增產(chǎn)物長度，鑒別瓊脂糖凝膠電泳中的正確條帶(圖1)，用Quantity One測量目的基因和內(nèi)參基因的條帶亮度，用二者的比值作為目的基因的相對表達(dá)量，比值≥1為高表達(dá)，1>比值≥0.5為中等表達(dá)，比值<0.5為低表達(dá)。

2 結(jié)果

TRPV1在狗的相關(guān)組織中均有表達(dá)，且在肺靜脈和股靜脈中表達(dá)水平較高，在股動脈中有中等水平的表達(dá)，在肺、肝、脾、主動脈、頸總動脈、腎、心臟和肺動脈中的表達(dá)水平較低；TRPV2、TRPV3、TRPM5和TRPA1在以上組織中均沒有表達(dá)；TRPV4在肺中沒有表達(dá)，在肺靜脈、股動脈中的表達(dá)水平較高，在肝、脾、頸總動脈、股靜脈中有中等水平的表達(dá)，在主動脈、腎、心臟和肺動脈中的表達(dá)水平較低；TRPM2在肺動脈、股動脈、頸總動脈、股靜脈中有較高水平的表達(dá)，在肝、主動脈中有中等水平的表達(dá)，在肺、腎、心臟和肺動脈中的表達(dá)水平較低；TRPM3除了在肺和肺動脈中沒有表達(dá)以外，在其他組織中均有表達(dá)，且在肺靜脈、股動脈中的表達(dá)水平較高，在肝、脾、頸總動脈、股靜脈、腎中有中等水平的表達(dá)，在主動脈和心臟中的表達(dá)水平較低；TRPM4在肺動脈中沒有檢測到表達(dá)，在脾、肺靜脈、股動脈、股靜脈中有中等水平的表達(dá)，在肺、肝、主動脈、頸總動脈、腎、心臟中的表達(dá)水平較低；TRPM8在肝、脾、腎中沒有檢測到表達(dá)，在肺靜脈、股動脈和股靜脈中有中等水平的表達(dá)，在肺、主動脈、頸總動脈、心臟和肺動脈中的表達(dá)較低(表2)。

表2 溫度敏感型離子通道基因在狗內(nèi)臟器官及血管中的表達(dá)水平， n=3)Table 2 Relative expression of genes encoding temperature-sensitive ion channels in internal organs and blood vessels of dog ， n=3)

TRPV1在大鼠的上述組織中均有表達(dá)且在肝和心臟中的表達(dá)水平較高，在肺、頸總動脈和肺動脈中有中等水平的表達(dá)，在脾、肺靜脈、股動脈、主動脈、股靜脈和腎中的表達(dá)水平較低；TRPV2和TRPM5在所有組織中均沒有檢測到表達(dá)；TRPV3在肺、肝和肺動脈中檢測到有表達(dá)但表達(dá)水平較低，在脾、肺靜脈、股動脈、主動脈、頸總動脈、股靜脈、腎和心臟中未檢測到表達(dá)；TRPV4在所有組織中均有表達(dá)，在肺、股動脈和頸總動脈中的表達(dá)水平較高，在肝、肺靜脈、主動脈、股靜脈、腎、心臟和肺動脈中有中等水平的表達(dá)，在脾中的表達(dá)水平較低；TRPM2在肺、肝、脾、腎中有高水平的表達(dá)，在股動脈、頸總動脈和股靜脈中有中等水平的表達(dá)，在肺靜脈中的表達(dá)水平較低，而在主動脈、心臟和肺動脈中沒有檢測到表達(dá)；TRPM3在肺、主動脈和心臟中沒有檢測到表達(dá)，在其他組織中均有表達(dá)且在頸總動脈中有高水平表達(dá)，在肝、脾、腎中有中等水平的表達(dá)，在肺靜脈、股動脈、股靜脈和肺動脈中的表達(dá)水平較低；TRPM4在脾、腎和心臟中沒有檢測到表達(dá)，在其他組織中均有表達(dá)，且在肺、肝、股動脈、主動脈、頸總動脈中的表達(dá)水平較高，在股靜脈中有中等水平的表達(dá)，在肺靜脈和肺動脈的表達(dá)水平較低；TRPM8在腎中沒有檢測到表達(dá)，在其他組織中均有表達(dá)且在股動脈及頸總動脈中的表達(dá)水平較高，在股靜脈中有中等水平的表達(dá)，在肺、肝、脾、肺靜脈、主動脈、心臟、肺動脈中的表達(dá)水平較低；TRPA1在肺和脾中有表達(dá)但是水平較低，在肝、肺靜脈、股動脈、主動脈、頸總動脈、股靜脈、腎、心臟和肺動脈中均未檢測到表達(dá)(表3)。

表3 溫度敏感型離子通道基因在大鼠內(nèi)臟器官及血管中的表達(dá)水平， n=3)Table 3 Relative expression of genes encoding temperature-sensitive ion channels in internal organs and blood vessels of rat ， n=3)

圖1 溫度敏感型離子通道基因在狗和大鼠內(nèi)臟器官及血管中的PCR檢測結(jié)果Fig. 1 PCR results of genes encoding temperature-sensitive ion channels in internal organs and blood vessels of dog and ratV1. TRPV1， V2. TRPV2， V3. TRPV3， V4. TRPV4， M2. TRPM2， M3. TRPM3， M4. TRPM4， M5. TRPM5， M8. TRPM8， A1. TRPA1， Act. β-actin.

3 討論

TRP通道家族尤其是對溫度敏感的離子通道在哺乳動物體內(nèi)廣泛分布，本文對溫度敏感型TRP通道基因在以比格犬和大鼠為代表的較大型和小型哺乳動物內(nèi)臟器官和部分血管的表達(dá)情況進(jìn)行了較全面的研究。其中，TRPV1被證實參與大鼠心臟急性缺血的血管調(diào)節(jié)(Gaoetal.，2015)，本實驗檢測到TRPV1在大鼠和狗的心臟和主動脈中都有表達(dá)，表明這一離子通道同樣也參與到狗心臟急性缺血時的血管調(diào)節(jié)中；而對于缺血后灌注的心肌有保護(hù)作用的TRPM2被發(fā)現(xiàn)在狗心臟中有表達(dá)而在大鼠心臟中幾乎沒有表達(dá)(Zhan & Yu，2016)，表明這一通道不會參與到大鼠心肌缺血后的灌注保護(hù)作用中；TRPV4和TRPV3在大鼠體內(nèi)參與肺動脈的收縮(Yooetal.，2012; Sureshetal.，2015)，但在狗的肺動脈中幾乎沒有表達(dá)，表明狗肺動脈壓的調(diào)控中沒有TRPV3和TRPV4的參與；TRPM4在大鼠的心臟中對心肌肥厚有抑制作用(Kecskesetal.，2015)，其被檢測到在狗心臟中有表達(dá)表明TRPM4亦參與到狗的心肌保護(hù)機(jī)制中；TRPM8被證實參與到降低大鼠腎缺血后灌注損傷作用中(Dusmezetal.，2014)， 其在狗腎中幾乎沒有表達(dá)，表明其不會參與狗腎缺血后的保護(hù)機(jī)制。

不僅如此，在諸如人類視網(wǎng)膜這樣的器官中都能夠檢測到TRPV4等基因的表達(dá)(Zhaoetal.，2015)，對于這一系列通道功能的探索一直以來都是研究熱點，在細(xì)胞層面和個體層面均得到廣泛開展，在其他器官及血管的生理調(diào)控機(jī)制研究中，研究人員都發(fā)現(xiàn)了溫度敏感型離子通道的參與，如：TRPA1被發(fā)現(xiàn)參與聽力及疼痛的形成(Wuetal.，2016)，TRPV1被發(fā)現(xiàn)對于預(yù)防阿爾茲海默癥有保護(hù)作用(Jayantetal.，2016)等，這些結(jié)果對于了解溫度敏感型離子通道對于生理和疾病的影響以及探索疾病治療的新方法都有非常大的研究和應(yīng)用前景(Santoni & Farfariello，2011)。

以上部分溫度敏感型離子通道基因在狗和大鼠體內(nèi)不同部位表達(dá)情況的差異或許揭示了體型大小不同的哺乳動物在溫度感受和體溫調(diào)控上的區(qū)別，總體看來，在大鼠各種組織中表達(dá)的溫度敏感型離子通道基因種類更多，或許表明相對于比格犬這樣體型較大的動物，大鼠的生理活動更容易受到溫度的影響。同時，對于這一系列基因的表達(dá)強(qiáng)弱情況與功能的相關(guān)性還有待進(jìn)一步探索。

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Expression Profiles of Genes Encoding Temperature-Sensitive Ion Channels in Mammalian Internal Organs and Blood Vessels

LIU Haoran， FAN Xinrong， LI Pengyun， LI Tao， ZENG Bo*

(Key Laboratory of Medical Electrophysiology， Ministry of Education， Insitute of Cardiovascular Research，Southwest Medical University， Luzhou， Sichuan Province 646000， China)

Temperature-sensitive ion channels widely exist in internal organs and blood vessels of mammals and play important roles in the regulation of various physiological functions. In this study， we collected tissues including the heart， liver， spleen， kidney， lung， aorta， pulmonary artery/vein， femoral artery/vein， and carotid artery from dogs and rats， respectively. Subsequently， the expression of genes encoding temperature-sensitive ion channels were detected using reverse transcription PCR and agarose gel electrophoresis. The results showed that TRPV1 existed in all the tissues of the two species examined， while TRPV2 and TRPM5 were undetectable in all the examined tissues. TRPV3 was expressed in the liver， lung and pulmonary artery of rat but absent in all canine tissues. TRPV4 existed in all the tissues of both species except in the lung of dog. TRPM2 was expressed in all the tissues of both species except in the aorta， heart and pulmonary artery of rat. TRPM3 expression was absent in the lung and pulmonary artery of dog and the lung， heart and aorta of rat， but presented in all other tissues. TRPM4 existed in all the tissues of both species except the pulmonary artery of dog and spleen， kidney and heart of rat. TRPM8 existed in all the tissues of both species except the liver， spleen and kidney of dog and kidney of rat. TRPA1 expressoin was found only in the lung and spleen of rat. These results provided detailed information for the expression of genes encoding temperature-sensitive ion channels in mammalian internal organs and blood vessels， which were essential for further exploration of physiological regulation by these channels.

temperature-sensitive; transient receptor potential channels; mammal; gene expression; internal organ; blood vessel

2016-03-14 接受日期：2016-05-11

劉浩然(1994—)， 男， 本科生， E-mail:oromis@foxmail.com

*通信作者Corresponding author， E-mail:zengbo@swmu.edu.cn

10.11984/j.issn.1000-7083.20160052

Q24; Q959.8

A

1000-7083(2016)04-0517-06