陳國娟，袁莉剛，李聰，閆振龍

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州　730070)

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不同繁殖季節(jié)牦牛睪丸組織VEGF及其受體分布比較

陳國娟，袁莉剛，李聰，閆振龍

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州730070)

摘要：【目的】 探索VEGF及其受體(VEGFR2)在繁殖期和繁殖間期成年牦牛睪丸組織中的分布特點(diǎn)并進(jìn)行比較分析.【方法】 應(yīng)用免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)VEGF及其受體(VEGFR2)分布特征并通過IPP圖像分析軟件進(jìn)行定量統(tǒng)計(jì).【結(jié)果】 免疫組織化學(xué)顯示，成年牦牛睪丸中，VEGF表達(dá)于各級(jí)生精細(xì)胞以及Sertoli細(xì)胞和Leydig細(xì)胞，強(qiáng)表達(dá)于長形精子，小血管內(nèi)皮細(xì)胞見強(qiáng)陽性表達(dá)，肌樣細(xì)胞未見表達(dá)；其受體VEGFR2表達(dá)于各級(jí)生精細(xì)胞及Sertoli細(xì)胞，且Leydig細(xì)胞內(nèi)強(qiáng)表達(dá)，小血管弱表達(dá)；性成熟牦牛睪丸組織中VEGF和 VEGFR2的表達(dá)繁殖期高于繁殖間期，但無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05).【結(jié)論】 VEGF及其受體在性成熟牦牛睪丸組織中表達(dá)豐富，表明其參與精子發(fā)生及局部微環(huán)境的調(diào)節(jié)，不同繁殖期有一定的表達(dá)差異，提示其表達(dá)與牦牛發(fā)情活動(dòng)密切相關(guān).

關(guān)鍵詞：牦牛；繁殖期；免疫組織化學(xué)；血管內(nèi)皮生長因子；血管內(nèi)皮生長因子受體2

血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是血管生成的主要調(diào)節(jié)者；它們不僅在內(nèi)皮細(xì)胞上有表達(dá)，在非內(nèi)皮細(xì)胞上也有表達(dá)[1].研究表明，在人體內(nèi)許多與生殖有關(guān)的細(xì)胞都有VEGF及其受體(VEGFR)的表達(dá)，是體內(nèi)與生殖有關(guān)的重要生長因子之一[2].VEGF及其受體作為血管形成和生成的主要調(diào)節(jié)者，在哺乳動(dòng)物的睪丸血管發(fā)生及微環(huán)境維持中有重要作用[3].Caires等[4]在牛睪丸中研究發(fā)現(xiàn)，VEGF維持生殖細(xì)胞存活和調(diào)節(jié)精子發(fā)生.研究報(bào)道，高原低氧誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞VEGF表達(dá)量增加，VEGF特異作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，使血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，促進(jìn)新生血管形成，改善微循環(huán)并增加血管的通透性，使高原動(dòng)物生殖器官對(duì)低氧的適應(yīng)能力顯著加強(qiáng)[5].Wu等[6]對(duì)牦牛血管內(nèi)皮生長因子基因的研究表明，血管內(nèi)皮生長因子作為一種血管生成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)器和一個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂原，在高海拔適應(yīng)性中起著重要作用.牦牛作為青藏高原的特產(chǎn)家畜，對(duì)高寒低氧環(huán)境具有極強(qiáng)的適應(yīng)性.姚紀(jì)元[7]研究發(fā)現(xiàn)，VEGF基因表達(dá)隨絨山羊毛囊周期性變化，且在生長旺盛期表達(dá)明顯升高，具有一定的季節(jié)性表達(dá)規(guī)律.Wagener等[8]研究表明，VEGF在麆鹿繁殖期精子表達(dá)為高峰期，繁殖期結(jié)束開始回歸.牦牛作為典型的季節(jié)繁殖動(dòng)物[9]，VEGF及其受體在其睪丸的表達(dá)是否呈季節(jié)性變化，目前尚未見相關(guān)報(bào)道.鑒于此，本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)比較性成熟時(shí)的繁殖期及繁殖間期牦牛睪丸組織中VEGF及VEGFR2的分布特征并對(duì)其進(jìn)行定量分析，探討VEGF及其受體與睪丸生精功能和高原適應(yīng)性之間的關(guān)系以及季節(jié)性表達(dá)的意義，進(jìn)一步了解牦牛睪丸高原適應(yīng)性的原理.

1材料與方法

1.1試驗(yàn)動(dòng)物

牦牛睪丸樣品采自青海省西寧市屠宰場(chǎng)，參照趙光前等[10]牦牛年齡門齒鑒別法，所采樣品均為性成熟牦牛睪丸，分繁殖期(7～9月)5、7、8歲各兩對(duì)，繁殖間期(1～2月)5歲3對(duì)，7歲和8歲各兩對(duì).以4%中性福爾馬林溶液固定3 d后備用.

1.2試驗(yàn)試劑

VEGF兔抗鼠多克隆抗體(bs-1313R)和VEGFR2兔抗鼠多克隆抗體(bs-0565R)購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；免疫組化染色試劑盒(sp-0023，由美國ZYMED公司生產(chǎn))購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；DAB顯色試劑盒(ZLI-9018和ZLI-9502)購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司.

1.3切片制備

樣品固定和切片制備：新鮮組織樣品稱質(zhì)量測(cè)量，記錄解剖數(shù)據(jù)，福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片(片厚 5 μm)，相鄰切片3套分別用于VEGF和VEGFR2免疫組織化學(xué)SP法染色及陰性對(duì)照.

1.4免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)VEGF和VEGFR2分布

免疫組織化學(xué)SP法進(jìn)行染色；切片脫水、脫蠟后，進(jìn)行高溫高壓抗原修復(fù)，后加一抗，一抗用VEGF和VEGFR2兩種多克隆抗體均按1∶400比例稀釋，陰性對(duì)照組用0.01 mol/L的PBS代替一抗(VEGF、VEGFR2)，4 ℃過夜，后孵育、清洗、顯色、脫水、透明、封片.然后顯微鏡進(jìn)行觀察、照相.

1.5圖像分析

光鏡下觀察免疫組織化學(xué)切片，每組切片中隨機(jī)選取5張，在400倍顯微鏡(OlympusDP71)下進(jìn)行拍照，每張切片采集5個(gè)視野，用Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行圖像分析，測(cè)定陽性反應(yīng)物的平均光密度，并用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示.

2結(jié)果與分析

2.1不同繁殖季節(jié)牦牛睪丸組織中VEGF及其受體的分布

VEGF與VEGFR2免疫組織化學(xué)陽性反應(yīng)呈棕黃色，在不同繁殖季節(jié)性成熟(5、7、8歲)牦牛睪丸中均有表達(dá).VEGF繁殖間期與繁殖期表達(dá)定位相同，主要定位于各級(jí)生精細(xì)胞(精原細(xì)胞、初級(jí)精母細(xì)胞、精子細(xì)胞及多種形態(tài)精子)、血管內(nèi)皮細(xì)胞、Sertoli細(xì)胞和Leydig細(xì)胞，肌樣細(xì)胞未見表達(dá)(圖1A-F)；其受體VEGFR2表達(dá)定位與VEGF相同，表達(dá)于繁殖間期與繁殖期性成熟牦牛睪丸各級(jí)生精細(xì)胞、Sertoli細(xì)胞、Leydig細(xì)胞強(qiáng)表達(dá)，血管弱表達(dá)(圖1G-L)；兩種因子均在精子變態(tài)期表達(dá)較強(qiáng).

A-C：繁殖間期牦牛睪丸VEGF表達(dá)；D-F：繁殖期牦牛睪丸VEGF表達(dá)；G-I：繁殖間期牦牛睪丸VEGFR2表達(dá)；J-L：繁殖期牦牛睪丸VEGFR2表達(dá)。免疫組織化學(xué)染色，標(biāo)尺示20 μm；CV：微血管；LC：Leydig細(xì)胞；ST：生精小管.圖1　不同繁殖季節(jié)牦牛睪丸VEGF及其受體(VEGFR2)的表達(dá)Fig.1　The expresstion of VEGF in yak testis in different breeding season

2.2不同繁殖季節(jié)牦牛睪丸VEGF及其受體免疫組織化學(xué)檢測(cè)比較

VEGF與VEGFR2在性成熟牦牛(5、7、8歲)睪丸免疫組織化學(xué)表達(dá)平均光密度統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，二者在睪丸表達(dá)定位基本相同，同一繁殖期與不同繁殖期睪丸內(nèi)表達(dá)均無統(tǒng)計(jì)差異(P>0.05)，但繁殖期VEGF及其受體表達(dá)檢測(cè)數(shù)值均略高于繁殖間期(表1-2、圖2).

表1　高原牦牛睪丸VEGF及其受體VEGFR2平均

表2　不同繁殖季節(jié)牦牛睪丸VEGF及其受體

圖2　不同繁殖季節(jié)VEGF及VEGFR2在高原牦牛睪丸中免疫組織化學(xué)表達(dá)的變化Fig.2　The immunohistochemistry expression of VEGF and VEGFR2 in yak testis in different breeding season

3討論與結(jié)論

睪丸局部微環(huán)境受到各類細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)，VEGF作為內(nèi)皮細(xì)胞特異性強(qiáng)效有絲分裂原，被公認(rèn)為是作用最強(qiáng)的血管通透因子，在體內(nèi)VEGF只有通過與其受體相結(jié)合才能發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，VEGFR2是其最主要的受體之一，VEGFR2是血管生成和發(fā)育的主要調(diào)節(jié)者，它們不僅在內(nèi)皮細(xì)胞上有表達(dá)，在非內(nèi)皮細(xì)胞上也有表達(dá)[11].研究發(fā)現(xiàn)，VEGF及其受體在雄性生殖系統(tǒng)中通過刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，血管生成及其內(nèi)皮細(xì)胞遷移，增加血管通透性等來調(diào)節(jié)睪丸功能[12].有關(guān)嚙齒類動(dòng)物睪丸的研究發(fā)現(xiàn)[13]，VEGF 表達(dá)量減小可抑制睪丸微血管的生成，進(jìn)而影響睪丸微環(huán)境的調(diào)節(jié).本研究發(fā)現(xiàn)牦牛睪丸中VEGF及其受體廣泛表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞，提示VEGF可通過與VEGFR2相結(jié)合，作用于睪丸間質(zhì)毛細(xì)血管，影響睪丸微環(huán)境循環(huán)，為生精細(xì)胞的增殖和分化創(chuàng)造條件.已有研究發(fā)現(xiàn)，缺氧時(shí)有機(jī)體局部氧化與抗氧化作用失衡，引起氧化應(yīng)激，導(dǎo)致組織損傷[14].Verratti等[15]對(duì)不同年齡大鼠睪丸蔓狀靜脈叢的細(xì)胞氧化應(yīng)激研究表明，高原環(huán)境中大鼠可能存在特殊的適應(yīng)性機(jī)制，表現(xiàn)為對(duì)氧化應(yīng)激反應(yīng)降低.本研究牦牛睪丸中VEGF及其受體廣泛表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞，結(jié)合VEGF及其受體的生理作用，提示VEGF及其受體在牦牛睪丸微血管系統(tǒng)高原適應(yīng)性調(diào)節(jié)中發(fā)揮一定作用.

研究證實(shí)，VEGF及其受體能夠維持牛睪丸生殖細(xì)胞的存活和調(diào)節(jié)精子的發(fā)生，對(duì)其生精過程也起著很重要的作用[4].Korpelainen等[16]曾報(bào)道VEGF轉(zhuǎn)基因小鼠的生精細(xì)胞內(nèi)有VEGF基因信號(hào)且出現(xiàn)于各級(jí)精子細(xì)胞.本研究發(fā)現(xiàn)牦牛睪丸中VEGF及其受體表達(dá)于各級(jí)生精細(xì)胞，提示其可能與精子發(fā)生密切相關(guān)，參與精子發(fā)生的整個(gè)過程；其在長形精子的強(qiáng)表達(dá)則表明VEGF可能參與精子變態(tài)過程.王訓(xùn)立等[17]研究雄性恒河猴性成熟的睪丸發(fā)現(xiàn)，生精小管內(nèi)繁殖期較非繁殖期各級(jí)生精細(xì)胞豐富.研究報(bào)道，VEGF在麆鹿繁殖期精子表達(dá)為高峰期，繁殖期結(jié)束開始回歸[8].劉輝等[18]研究報(bào)道，季節(jié)性繁殖動(dòng)物生精功能在繁殖期出現(xiàn)高峰.牦牛為典型的季節(jié)繁殖動(dòng)物，其繁殖季節(jié)為6～11月份[9].本研究中，性成熟期牦牛睪丸VEGF 及其受體在不同繁殖季節(jié)表達(dá)略有差異，呈現(xiàn)繁殖期略高于繁殖間期，提示VEGF及其受體對(duì)睪丸局部微環(huán)境的調(diào)節(jié)存在一定季節(jié)差異，這可能與牦牛進(jìn)入繁殖期密切相關(guān).

Ai等[19]在大鼠睪丸中的研究顯示，VEGF同時(shí)表達(dá)于Sertoli細(xì)胞和Leydig細(xì)胞，Collin等[20]在人睪丸Sertoli細(xì)胞和Leydig細(xì)胞的研究亦有相同結(jié)果.劉輝等[18]研究綿羊睪丸顯示，其Sertoli細(xì)胞和Leydig細(xì)胞呈現(xiàn)一定的季節(jié)性變化，表現(xiàn)為繁殖季節(jié)兩種細(xì)胞形態(tài)和數(shù)量上均優(yōu)于非繁殖季節(jié).朱俊峰等[12]研究不同年齡段牦牛睪丸時(shí)發(fā)現(xiàn)，Leydig細(xì)胞在牦牛睪丸生精過程中發(fā)揮重要作用.本研究中VEGF及其受體同時(shí)表達(dá)于Sertoli細(xì)胞和Leydig細(xì)胞，且受體強(qiáng)表達(dá)于Leydig細(xì)胞，提示VEGF及其受體可能通過自分泌或旁分泌的形式，參與精子發(fā)生及局部微環(huán)境的調(diào)節(jié)，對(duì)Leydig細(xì)胞也有一定調(diào)節(jié)作用，在維持繁殖期睪丸功能的正常發(fā)揮中有著至關(guān)重要的地位.

綜上所述，VEGF及其受體在性成熟牦牛睪丸組織中表達(dá)豐富，通過調(diào)節(jié)血管發(fā)生及其通透性，從而降低低氧對(duì)睪丸的影響，以自分泌或旁分泌形式參與精子發(fā)生及睪丸局部微環(huán)境調(diào)節(jié)，影響睪丸的功能，不同繁殖期存一定表達(dá)差異，這與牦牛發(fā)情活動(dòng)密切相關(guān).

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(責(zé)任編輯趙曉倩)

Distribution characteristics of VEGF and its receptor (VEGFR2) in adult yak testis in breeding and non-breeding seasons

CHEN Guo-juan,YUAN Li-gang,Li Cong,YAN Zhen-long

(College of Veterinary Medicine,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China)

Abstract：【Objective】To explore and analyze the distribution characteristics of VEGF and its receptor (VEGFR2) in adult yak testis in breeding and non-breeding seasons.【Method】 This study used immunohistochemical SP technique to identify the distribution of VEGF and its receptor (VEGFR2) ,and IPP (Image-Pro Plus) statistics method was used to quantitative statistics.【Result】 Immunohistochemistry showed that VEGF was expressed in the spermatogenic cells,sertoli cells ,and leydig cells,and strongly expressed in the elongated sperma and vascular endothelial,no expressed in the muscle cells.VEGF' receptor (VEGFR2) was expressed in the spermatogenic cells and sertoli cells,strongly expressed in leydig cells.While weakly expressed in vessel weakly.The data showed that the average optical density of VEGF and VEGFR2 was higher in breeding season than non-breeding season in adult yak testis,but there was no significantly difference(P>0.05).【Conclusion】 VEGF and its receptors were expressed in abundance in adult yak testis,it showed that they participate in the spermatogenesis and regulate the local microenvironment.While there was certain difference in expression in different breeding season,it indicated that it closely related to the oestrous period in different seasons.

Key words：yak;breeding season;immunohistochemistry;VEGF;VEGFR2

通信作者：袁莉剛，女，教授，博士，主要研究方向?yàn)閯?dòng)物發(fā)育生物學(xué).E-mail:yuan2918@126.com

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目“牦牛睪丸高原適應(yīng)性形態(tài)學(xué)研究”(31160488)；甘肅省自然科學(xué)研究基金“雙峰駝隱睪神經(jīng)遞質(zhì)分布及調(diào)控機(jī)理研究”(145RJZA223).

收稿日期：2015-03-03；修回日期：2015-04-23

中圖分類號(hào)：S 852.16

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1003-4315(2016)01-0013-05

第一作者：陳國娟(1990-)，女，主要研究方向?yàn)閯?dòng)物發(fā)育生物學(xué).E-mail:hopeissnow@163.com