王　麗，王　笛，俞心愉，代家勇，李　磊（南京醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院，江蘇南京211100）

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洋河微分子酒健康功能活性物質(zhì)研究

王麗，王笛，俞心愉，代家勇，李磊
（南京醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院，江蘇南京211100）

摘要：利用高分辨質(zhì)譜聯(lián)用技術，探索洋河微分子酒中存在的微量功能活性物質(zhì)。微分子酒樣品經(jīng)頂空固相微萃取和低溫水浴蒸發(fā)濃縮處理后，采用氣相色譜-質(zhì)譜及高分辨超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術進行檢測。經(jīng)SIEVE提取、NIST和HMDB庫搜索、匹配，初步篩查解析出近2000種微量物質(zhì)。這些微量物質(zhì)中，發(fā)現(xiàn)460多種特定功能性微分子，如核苷類似物、圣草酚、4-羥基-3,5-二甲氧基肉桂酸等。微分子酒中存在的多種功能活性物質(zhì)，豐富了綿柔型白酒的內(nèi)含，順應了“健康飲酒，飲酒健康”的新型理念。

關鍵詞：微分子酒；功能活性物質(zhì)；白酒

2014年8月，洋河股份有限公司隆重推出了一款全新產(chǎn)品——微分子酒。微分子酒是洋河利用5年時間專門研發(fā)的一款全新健康白酒產(chǎn)品，它采用固態(tài)雙邊發(fā)酵工藝及平衡酒體風格的精湛勾兌技術，目標在于使酒體中的分子變小，賦予其不上頭、醒酒快，且含有多種活性微量成分，酒質(zhì)既豐滿綿柔，又多飲不醉的特點。

本研究利用質(zhì)譜聯(lián)用技術，研究微分子酒中的微量物質(zhì)、尋找其中的生物活性物質(zhì)，為飲酒健康提供相關的基礎數(shù)據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

樣品：洋河微分子酒。

氣相色譜質(zhì)譜儀（TSQ 8000，美國Thermo）；超高壓液相色譜（UPLC）和質(zhì)譜儀（Q-Exactive，美國Thermo）；TG-WAX毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25μm，美國Thermo）；數(shù)控型磁力加熱攪拌器；20 mL螺紋頂空萃取瓶及配套螺紋鋁蓋和聚四氟乙烯墊（美國Agilent）；SPME手動進樣手柄及50μm DVB/CAR/PDMS（美國Supelco）。

1.2實驗方法

1.2.1氣相色譜質(zhì)譜檢測

采用頂空固相微萃取，萃取條件為：取7 mL稀釋至15％vol酒精度的白酒樣品、2 g氯化鈉（馬弗爐烘烤）和一粒攪拌子置于20 mL頂空瓶中，以DVB/CAR/PDMS萃取纖維在45℃恒溫條件培養(yǎng)5 min，以1500 r/min轉(zhuǎn)速攪拌萃取20 min后，迅速將萃取纖維插入氣質(zhì)聯(lián)用儀的進樣口中以220℃解吸3min測定。氣相參數(shù)：進樣口溫度220℃；不分流進樣（不加玻璃棉）；載氣為高純氦氣，流速1 mL/min；程序升溫，35℃起始，保持3 min，然后以5℃/min升到150℃保留2 min，再以8℃/min升到220℃保留2 min。質(zhì)譜參數(shù)：傳輸線溫度為250℃，EI源，溫度230℃。電子轟擊能量為70 eV，發(fā)射電流為100 μA，預四級桿電壓為-7.8 V，采用全掃描模式，掃描范圍35～500 m/z。

在上述萃取過的酒樣基礎上，再以DVB/CAR/PDMS萃取纖維在80℃恒溫條件培養(yǎng)5 min，以1500 r/min轉(zhuǎn)速攪拌萃取30 min后，迅速將萃取纖維插入氣質(zhì)聯(lián)用儀的進樣口中于220℃解吸3 min測定。氣相參數(shù)：進樣口溫度220℃；不分流進樣（不加玻璃棉）；載氣為高純氦氣，流速1 mL/min；程序升溫，70℃起始，保持3 min，然后以5℃/min升到150℃保留2 min，再以8℃/min升到230℃保留2 min。質(zhì)譜參數(shù)：同上。

1.2.2液相色譜質(zhì)譜檢測

樣品處理：取500 mL酒樣置于蒸發(fā)皿中，50℃水浴蒸干后，用乙醇-水溶液500 μL復溶，溶液轉(zhuǎn)移至棕色樣品瓶待測。同時用45％vol乙醇溶液500 mL水浴蒸發(fā)做程序空白，檢測結果扣除空白值。液質(zhì)檢測參數(shù)：液相參數(shù)，Hypersil GOLD C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）色譜柱；流動相為0.1％甲酸水(A)和0.1％甲酸乙腈(B)；采用梯度洗脫（表1）；流速0.3 mL/min；進樣盤溫度4℃；進樣量5 μL；柱溫40℃。梯度洗脫為5％ B（0～5min），5％～95％ B（5～15 min），95％ B（15～20min），5％～95％ B（20～21 min），5％ B（21～23 min）。質(zhì)譜參數(shù)，鞘氣流量為50 mL/min；輔助氣流量為13 mL/min；毛細管溫度為300℃；ESI源；掃描范圍正、負離子模式均為100～1050 m/z。一級掃描分辨率為70000。

1.3數(shù)據(jù)處理

氣相色譜質(zhì)譜數(shù)據(jù)根據(jù)色譜峰對應的質(zhì)譜圖進行NIST庫搜索匹配；液相色譜質(zhì)譜數(shù)據(jù)根據(jù)采集的圖譜，利用SIEVE軟件進行精確分子量提取，所得精確分子量再進行HMDB庫搜索匹配，正離子模式質(zhì)量精度小于5mg/L、負離子模式質(zhì)量精度小于10mg/L納入統(tǒng)計范圍，篩選出的部分物質(zhì)最終經(jīng)標準對照確認。

2　結果與分析

2.1洋河微分子酒質(zhì)譜全掃圖

分別采用氣相色譜質(zhì)譜（GC/MS）和高分辨串聯(lián)液相質(zhì)譜(UPLC/Q-obitrap)探索洋河微分子酒中的功能活性物質(zhì)。在質(zhì)譜檢測基礎上結合相關軟件和標準譜庫，共定性出4683種微量物質(zhì)，其中氣味微量物質(zhì)166種（其中，28種屬于特定功能性微分子），滋味微量物質(zhì)4517種（其中，432種屬于特定功能性微分子）。圖1（A,B,C,D）展示了質(zhì)譜檢測的峰響應信號，可以看出洋河微分子酒中蘊含了大量的微量物質(zhì)，其中有許多微量物質(zhì)具有生物活性，這些活性物質(zhì)在酒中的存在不一定說明酒本身具有某種生理功能，但這些成分可能在減弱酒精對人體損傷方面有輔助作用，有益于人體健康。

2.2洋河微分子酒中核苷類活性物質(zhì)

圖1　洋河微分子酒質(zhì)譜全掃圖

經(jīng)標準物質(zhì)對照和UPLC/MS檢測，洋河微分子酒中發(fā)現(xiàn)有核苷類似物。微分子酒中核苷類似物的生成與核苷功能菌的生長代謝有關。釀酒工藝過程中，通過優(yōu)化原料配比結構和調(diào)整工藝參數(shù)，為酵母等釀酒微生物提供生長繁殖與代謝的同時，也為核苷功能菌提供相對合適的培養(yǎng)載體，通過核苷曲的形式在發(fā)酵前期利用酒醅中保留的氧氣實現(xiàn)增殖與代謝，產(chǎn)生核苷類似物。研究表明，核苷類似物能抵抗酒精氧化性肝損傷，對腸粘膜免疫屏障功能損傷發(fā)揮保護作用。核苷類似物可以增加白細胞介素-10和增強白細胞介素-10的mRNA的表達，同時可以減少白細胞介素-2的產(chǎn)生、減少外周血單核細胞的增殖等作用[1]。不同濃度的核苷類似物對HepG-2有明顯抑制作用，且呈劑量依賴性[2]。核苷類似物抗白血病與其抑制白血病細胞中末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶的活性有關。最新研究證實，核苷類似物誘導的DNA損傷引發(fā)了細胞周期阻滯和凋亡，導致了白血病NB-4 和U937細胞生長抑制。

2.3洋河微分子酒中有機酸類活性物質(zhì)

洋河微分子酒中除含有白酒中常見的乙酸、L-乳酸外，還含有組氨酸、亞油酸、甲酪氨酸、3-羥基-L-酪氨酸、2,3-二羥基-4-(9-腺嘌呤)丁酸、十八碳四烯酸、香豆素-3-羧酸、4-羥基-3,5-二甲氧基肉桂酸、齊墩果酸等有機酸。乙酸、乳酸等低分子有機酸具有殺菌抗病毒功能，乙酸具有擴張血管、延緩血管硬化的功能。L-乳酸是人體必需的有機酸，能促進雙歧桿菌生長從而使體內(nèi)微生態(tài)保持平衡。組氨酸是人體半必需營養(yǎng)物質(zhì)。亞油酸是人體必需脂肪酸，它具有預防膽固醇過高、改善高血壓、預防心肌梗死、預防膽固醇造成的膽結石和動脈硬化等作用。甲酪氨酸為新發(fā)現(xiàn)的具有輔助降低血管壓力的物質(zhì)。該物質(zhì)可能是微分子酒的健康功能因子。3-羥基-L-酪氨酸本身為體內(nèi)合成去甲腎上腺素、多巴胺等的前體物質(zhì)之一，屬兒茶酚胺，具有治療震顫麻痹的功效。2,3-二羥基-4-(9-腺嘌呤)丁酸是由腺嘌呤上接一個丁酸組成的一種腺嘌呤衍生物，因為該物質(zhì)在香菇中被發(fā)現(xiàn)，也稱其香菇嘌呤。研究表明，2,3-二羥基-4-(9-腺嘌呤)丁酸降血脂作用比常用降血脂藥安妥明強10倍，且口服有效。同時具有降低血漿中高半胱氨酸濃度的作用，從而可以防治高半胱氨酸濃度過高引發(fā)的血栓和血管疾病。其作用機制是通過調(diào)控脂肪酸代謝及改變磷脂酰膽堿分子譜圖的組成，來降低血液膽固醇的含量。在谷物發(fā)酵后蒸餾生產(chǎn)的微分子酒中發(fā)現(xiàn)2,3-二羥基-4-(9-腺嘌呤)丁酸具有重要的健康意義。十八碳四烯酸是人體必需的典型多不飽和脂肪酸。香豆素-3-羧酸是一種具有較強抗氧化作用，且具有呈香作用的物質(zhì)。4-羥基-3,5-二甲氧基肉桂酸為咖啡酸反式異構體，具有重要抗氧化損傷作用。齊墩果酸具有香辣氣味，除了具有抗氧化損傷作用外，還有鎮(zhèn)靜的功能。此外，微分子酒中還含有多種氨基酸，為人體健康提供營養(yǎng)。

圖2　核苷類似物色譜圖（a）及質(zhì)譜圖（b）

2.4洋河微分子酒中酚類活性物質(zhì)

酚類物質(zhì)為優(yōu)良的自由基清除劑，具有抗氧化、清除活性氧自由基、抗腫瘤等功能。洋河微分子酒中含有多種酚類物質(zhì)，如圣草酚、兒茶酚、愈創(chuàng)木酚、麝香草酚等。其中的圣草酚對酒精氧化損傷有特殊的保護作用。具有抑制AAPH誘導牛血清白蛋白BSA蛋白羰基化的能力，具有抑制AAPH誘導肝勻漿MDA的生成能力，具有抑制HepG2癌細胞活性的能力，具有抑制AAPH誘導pBR322DNA氧化損傷的能力等[3]。

2.5洋河微分子酒中酯類活性物質(zhì)

洋河微分子酒中除含有乙酯類，如乙酸乙酯、己酯乙酯、乳酸乙酯、亞油酸乙酯等外，還含有一些內(nèi)酯類物質(zhì)，如山萵苣素等。乙酸乙酯對乙醛有制約作用，可通過腎調(diào)動體液來排除酒中對人體不適反應的物質(zhì)，加速人體新陳代謝。己酸乙酯具有降肺火、穩(wěn)定心肺的功能。乳酸乙酯有促進乙醇刺激大腦皮層使人體產(chǎn)生興奮的作用。同時乙酸乙酯、乳酸乙酯又會水解或酶解成乙酸、乳酸等小分子有機酸，起到擴張血管的作用。酒中的亞油酸乙酯等酯類物質(zhì)進入人體后又水解為多不飽和脂肪酸，達到抑制膽固醇合成的作用。山萵苣素又稱萵苣苦內(nèi)酯，具有鎮(zhèn)咳、鎮(zhèn)靜作用，此外還顯示較強的細胞毒作用，具有抗癌活性。

2.6洋河微分子酒中吡嗪類活性物質(zhì)

洋河微分子酒中檢測出了8種以上微量吡嗪類物質(zhì)，如四甲基吡嗪等。研究表明，酒中的吡嗪主要由“美拉德反應”、微生物的代謝產(chǎn)物、蛋白質(zhì)和氨基酸的加熱分解產(chǎn)生。吡嗪是構成酒類風味的重要成分之一。相關報道顯示，四甲基吡嗪具有擴張血管、改善微循環(huán)及抑制血小板積聚的作用[4-5]，賦予了白酒健康的功能。

2.7洋河微分子酒中其他活性物質(zhì)

洋河微分子酒中存在微量的煙酰胺核糖，為維生素B3的一種衍生物。對這種物質(zhì)功能的研究主要集中在兩個方面，一是在牛奶中發(fā)現(xiàn)天然存在的煙酰胺核糖，該物質(zhì)能幫助對抗肥胖，其作用方式可能是直接靶向SIRT1，就像紅葡萄酒中的成分白藜蘆醇一樣，也可能通過提高SIRT1粘附分子，輔因子NAD+的表達水平；另一方面，科學家們最近發(fā)現(xiàn)，通過飲食補充煙酰胺核糖，能夠提高細胞內(nèi)的NAD+水平，從而阻止小鼠肝癌的發(fā)展，誘使腫瘤退縮。本研究在滋味微分子中發(fā)現(xiàn)了煙酰胺核糖，對于說明微分子酒的生物功能具有重要意義。

微分子酒中發(fā)現(xiàn)了微量的倍他洛爾，該物質(zhì)有調(diào)整血壓的作用，尤其對中度高血壓和無嚴重并發(fā)癥的年輕高血壓患者效果最佳。也適用于治療開角型青光眼和眼高壓。對解釋微分子酒的舒壓作用具有重要參考。

微分子酒中的洛伐他汀，原為紅曲中發(fā)現(xiàn)的成分，可通過抑制HMG-CoA還原酶，抑制內(nèi)源性TC合成，肝內(nèi)膽固醇減少，可使肝細胞表面的LDL受體增加，血液中的LDL-C被肝細胞攝取增多，從而使血漿TC下降，TG、LDL-C濃度亦降低，HDL-C升高。對高膽固醇血癥、原發(fā)性高膽固醇血癥、Ⅲ型高脂蛋白血癥以及糖尿病性、腎性高脂蛋白血癥有效[6]。微分子酒中洛伐他汀的發(fā)現(xiàn)是否與其生物功能相關，有待進一步研究說明。

微分子酒中發(fā)現(xiàn)的熊果苷物質(zhì)能夠通過抑制體內(nèi)酪氨酸酶的活性，阻止黑色素的生成，從而減少皮膚色素沉積，祛除色斑和雀斑[7]，同時還有殺菌、消炎的作用。

微分子酒中發(fā)現(xiàn)的2-氨基-6-羥基嘌呤屬嘌呤類有機化合物，是重要的生命物質(zhì)，能抵抗免疫受損。此外，微分子酒中還存在多元醇類、呋喃類、萜烯類等一些具有生物活性的物質(zhì)。從質(zhì)譜檢測所響應的大量信號來看，洋河微分子酒中蘊含的其他許多生物活性物質(zhì)還有待進一步探索、發(fā)掘。

3　結論

通過質(zhì)譜聯(lián)用技術對洋河微分子酒中功能活性物質(zhì)進行探索研究，初步發(fā)現(xiàn)含有核苷類似物、組氨酸、圣草酚、4-羥基-3,5-二甲氧基肉桂酸等460多種活性物質(zhì)。這些功能物質(zhì)的存在，單獨或協(xié)同發(fā)揮作用，以抵抗機體的氧化損傷，賦予了微分子酒一定的健康功能。質(zhì)譜檢測發(fā)現(xiàn)微分子酒中含有大量微量物質(zhì)，其中蘊含的許多生物活性物質(zhì)有待進一步發(fā)掘、確認。

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Functional Active Substances in Yanghe Micro-molecular Liquor

WANG Li,WANG Di,YU Xinyu,DAI Jiayong and LI Lei
(School of Public Health,Nanjing Medical University,Nanjing,Jiangsu 211100,China)

Abstract:Hyphenated mass spectrometry was applied to explore the functional active substances in Yanghe micro-molecular liquor.Fristly,liquor samples were processed by SPME and low-temperature water bath evaporation,and then detected by GC/MS and UPLC/MS (high resolution).About two thousand functional active substances were screened out by SIEVE extraction,and NIST and HMDB searching and matching.Among these functional substances,460 kinds had specific functions including cordycepin,saint grass phenol,and 4-hydroxy-3,5-dimethoxy cinnamic acid etc.The existence of multiple functional substances in micro-molecular liquor could enrich the features of soft-type Baijiu,which met the new concept of healthy drinking.

Key words:micro-molecular liquor;functional active substance;Baijiu

作者簡介：王麗(1985-)，女，碩士，實驗師，研究方向為營養(yǎng)與食品衛(wèi)生。

收稿日期：2015-11-25

中圖分類號：TS262.3；TS261.4；TS971

文獻標識碼：A

文章編號：1001-9286（2016）02-0125-04

DOI：10.13746/j.njkj.2015445

優(yōu)先數(shù)字出版時間：2016-01-21；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160121.0910.001.html。