藁本內(nèi)酯對(duì)低灌注大鼠水迷宮成績(jī)的改善和對(duì)海馬神經(jīng)元保護(hù)作用

王成牛，馮展波，彭彬，李潔佳，陸亞鵬，朱俐

(1.南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中心，江蘇 南通　226001; 2.南通大學(xué) 航海醫(yī)學(xué)研究所，江蘇 南通　226001)

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藁本內(nèi)酯對(duì)低灌注大鼠水迷宮成績(jī)的改善和對(duì)海馬神經(jīng)元保護(hù)作用

王成牛1，馮展波2，彭彬2，李潔佳1，陸亞鵬2，朱俐2

(1.南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中心，江蘇 南通226001; 2.南通大學(xué) 航海醫(yī)學(xué)研究所，江蘇 南通226001)

[摘要]目的：研究藁本內(nèi)酯對(duì)低灌注大鼠水迷宮成績(jī)的改善和對(duì)海馬神經(jīng)元的保護(hù)作用，探討其神經(jīng)元保護(hù)的作用機(jī)制。方法：取健康雄性SD大鼠24只(體重260～280 g)，隨機(jī)分為對(duì)照組、低灌注組和藁本內(nèi)酯組，每組8只。對(duì)低灌注組和藁本內(nèi)酯組大鼠行雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久性結(jié)扎術(shù)，對(duì)照組不結(jié)扎。術(shù)后第8天，藁本內(nèi)酯組大鼠灌胃給予藁本內(nèi)酯(以大豆油為溶劑，每日劑量80 mg·kg(-1))，另外兩組大鼠予相同體積的大豆油灌胃。所有大鼠連續(xù)灌胃21 d后進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)，觀察各組大鼠水迷宮成績(jī)(即潛伏期的長(zhǎng)短)的差異。水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死大鼠，采用尼氏染色觀察各組大鼠海馬CA1和CA3區(qū)神經(jīng)元尼氏小體陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量的變化，采用免疫熒光和免疫組化法觀察各組大鼠海馬CA1和CA3區(qū)神經(jīng)元的神經(jīng)元特異性核蛋白(NeuN)、神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)和半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶3(Caspase3)表達(dá)變化。結(jié)果:藁本內(nèi)酯組大鼠水迷宮成績(jī)較低灌注組明顯提高(P<0.05)，海馬CA1、CA3區(qū)尼氏小體陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量較低灌注組明顯增加，海馬CA1、CA3區(qū)GFAP和Caspase3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量較低灌注組明顯減少。結(jié)論:藁苯內(nèi)酯能夠改善低灌注大鼠水迷宮成績(jī),并對(duì)海馬區(qū)神經(jīng)元具有較好的保護(hù)作用。

[關(guān)鍵詞]藁本內(nèi)酯； 腦低灌注； 神經(jīng)保護(hù)； 海馬； 凋亡

藁本內(nèi)酯(Ligustilide)可透過(guò)血腦屏障，改善腦微循環(huán)、抗氧化損傷、抑制炎癥反應(yīng)，并可提高膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶活性，有利于改善記憶功能[1- 6]。本課題中，我們研究藁本內(nèi)酯對(duì)低灌注大鼠水迷宮成績(jī)的改善和對(duì)海馬神經(jīng)元的保護(hù)作用，并探討藁本內(nèi)酯神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)參考。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與模型制備

健康雄性清潔級(jí)SD大鼠24只(260～280 g)，由南通大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。將大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、低灌注組和藁本內(nèi)酯組，每組8只。對(duì)低灌注組和藁本內(nèi)酯組大鼠行雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久性結(jié)扎術(shù)，對(duì)照組不結(jié)扎。術(shù)后第8天，藁本內(nèi)酯組予藁本內(nèi)酯灌胃(以大豆油為溶劑，每日劑量80 mg·kg-1)，另外兩組大鼠予相同體積的大豆油灌胃。

1.2主要試劑和器材

藁本內(nèi)酯(本實(shí)驗(yàn)室制備，純度：95%～97%)，鼠抗GFAP一抗、鼠抗NeuN一抗(Millipore，美國(guó))，兔抗Caspase3一抗、FITC羊抗鼠二抗及TRITC 羊抗兔二抗(Bioworld，美國(guó))，抗鼠/兔二抗試劑盒(北京中杉金橋)，其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。熒光顯微鏡、冰凍切片機(jī)(萊卡，德國(guó))，水迷宮(北京，中國(guó)藥物科學(xué)院)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

大鼠連續(xù)灌胃21 d后進(jìn)行連續(xù)5 d的水迷宮實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)流程見本課題組前期報(bào)道[7]，由電腦自動(dòng)記錄大鼠潛伏期時(shí)間。水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死大鼠取腦，制備冰凍切片，切片厚度25 μm。取切片行尼氏染色，觀察各組大鼠海馬CA1和CA3區(qū)神經(jīng)元尼氏小體陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量的變化；采用免疫熒光和免疫組化法觀察各組大鼠海馬CA1和CA3區(qū)神經(jīng)元的神經(jīng)元特異性核蛋白(neuronal specific nuclear protein，NeuN)、神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)和半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶3(cysteinyl aspartate specific proteinase 3，Caspase3)表達(dá)變化。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2結(jié)果

2.1藁本內(nèi)酯能有效提高低灌注大鼠水迷宮成績(jī)見圖1。

與對(duì)照組比較，aP<0.01；與低灌注組比較，bP<0.05

圖1各組大鼠水迷宮潛伏期結(jié)果

圖1顯示，隨著實(shí)驗(yàn)天數(shù)的增加，各組大鼠的潛伏期出現(xiàn)差異。從第3天開始，低灌注組大鼠的潛伏期較對(duì)照組大鼠的潛伏期明顯延長(zhǎng)(P<0.01)，即水迷宮成績(jī)變差；從第4天起，藁本內(nèi)酯組大鼠的潛伏期較低灌注組大鼠的潛伏期明顯縮短(P<0.05)，即水迷宮成績(jī)提高。

2.2藁本內(nèi)酯能有效抑制低灌注大鼠海馬尼氏小體陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量的減少見表1。

表1各組大鼠海馬CA1、CA3區(qū)尼氏小體陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量與對(duì)照組平均值的比值

組 別海馬CA1區(qū)海馬CA3區(qū)對(duì)照組1±0.031±0.03低灌注組0.42±0.08a0.56±0.07a藁本內(nèi)酯組0.94±0.04b0.91±0.03b

與對(duì)照組比較，aP<0.01；與低灌注組比較，bP<0.01

表1顯示，低灌注組大鼠海馬CA1、CA3 區(qū)尼氏小體陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量與對(duì)照組平均值的比值較對(duì)照組明顯減小(P<0.01)，藁本內(nèi)酯組海馬CA1、CA3區(qū)尼氏小體陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量與對(duì)照組平均值的比值較低灌注組明顯增大(P<0.01)。

2.3藁本內(nèi)酯能有效抑制低灌注大鼠海馬GFAP陽(yáng)性細(xì)胞的增加見表2。

表2各組大鼠海馬CA1、CA3區(qū)GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量與對(duì)照組平均值的比值

組 別海馬CA1海馬CA3對(duì)照組1±0.061±0.08低灌注組1.65±0.12a1.5±0.12a藁本內(nèi)酯組1.09±0.07b1.14±0.11b

與對(duì)照組比較，aP<0.01；與低灌注組比較，bP<0.01

表2顯示，低灌注組大鼠海馬CA1、CA3區(qū)GFAP陽(yáng)性細(xì)胞與對(duì)照組平均值的比值較對(duì)照組明顯增大(P<0.01)，藁本內(nèi)酯組海馬CA1、CA3區(qū)GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量與對(duì)照組平均值的比值較低灌注組明顯減小(P<0.01，表2)。

2.4藁本內(nèi)酯能有效減少低灌注大鼠海馬Caspase3陽(yáng)性細(xì)胞的增加見表3、圖2。

表3各組大鼠海馬CA1、CA3區(qū)Caspase3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量與對(duì)照組平均值的比值

組 別海馬CA1海馬CA3對(duì)照組1±0.211±0.09低灌注組7.12±11.2a3.2±0.36a藁本內(nèi)酯組3.24±0.18b1.75±0.13b

與對(duì)照組比較，aP<0.01；與低灌注組比較，bP<0.01

A～C為海馬CA1區(qū)，D～F為海馬CA3區(qū)；A和D為對(duì)照組，B和E為低灌注組，C和F為藁本內(nèi)酯組

圖2大鼠海馬區(qū)NeuN和Caspase- 3免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果

表3顯示，低灌注組海馬CA1和CA3區(qū)Caspase3陽(yáng)性細(xì)胞與對(duì)照組平均值的比值較對(duì)照組明顯增大(P<0.01)；藁本內(nèi)酯組海馬CA1和CA3區(qū)Caspase3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量與對(duì)照組平均值的比值較低灌注組明顯減小(P<0.01)。NeuN和Caspase- 3免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果顯示，低灌注大鼠的Caspase3陽(yáng)性細(xì)胞與NeuN陽(yáng)性細(xì)胞基本重疊。

3討論

大鼠水迷宮成績(jī)(即潛伏期的長(zhǎng)短)是反映大鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能的一項(xiàng)重要指標(biāo)；而學(xué)習(xí)記憶功能的正常發(fā)揮與海馬神經(jīng)元的活力和數(shù)量密切相關(guān)。尼氏小體是神經(jīng)元糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的核糖體，也是神經(jīng)細(xì)胞功能活性的形態(tài)指標(biāo)。當(dāng)神經(jīng)元的軸突被切斷或受到過(guò)分的刺激時(shí)，尼氏小體會(huì)逐漸消失。NeuN是一種成熟的神經(jīng)元標(biāo)記物，不與星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生交叉反應(yīng)，其陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量的多少，能更加準(zhǔn)確地代表神經(jīng)元的數(shù)量。本實(shí)驗(yàn)中，藁本內(nèi)酯組大鼠海馬CA1、CA3區(qū)尼氏小體陽(yáng)性和NeuN陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量(數(shù)據(jù)未給出)與對(duì)照組平均值的比值明顯大于低灌注組大鼠，說(shuō)明藁本內(nèi)酯治療后的大鼠海馬CA1、CA3區(qū)神經(jīng)元的活力和數(shù)量指標(biāo)較低灌注大鼠更好。藁本內(nèi)酯組大鼠水迷宮成績(jī)較低灌注組大鼠明顯提高，正是這種生理性差異的直接體現(xiàn)。

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，炎癥因子NF- κB可廣泛表達(dá)于神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞。其在大鼠腦缺血神經(jīng)細(xì)胞中表達(dá)升高。有研究發(fā)現(xiàn)，在腦出血神經(jīng)元中Caspase3的表達(dá)與NF-κB的表達(dá)呈正相關(guān)[8]。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)藁本內(nèi)酯能夠有效減少低灌注大鼠海馬CA1、CA2區(qū)域GFAP和Caspase3陽(yáng)性細(xì)胞，推測(cè)藁本內(nèi)酯通過(guò)減少該區(qū)域Caspase3陽(yáng)性細(xì)胞使炎癥因子NF- κB的表達(dá)減少，但是其確切的機(jī)制還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

綜上所述，藁本內(nèi)酯能夠有效改善低灌注大鼠水迷宮成績(jī)，這種改善作用可能是通過(guò)抑制低灌注大鼠海馬CA1、CA3區(qū)域尼氏小體陽(yáng)性細(xì)胞的減少，并且抑制該區(qū)域GFAP和Caspase3陽(yáng)性細(xì)胞的增加實(shí)現(xiàn)的。雖然關(guān)于藁本內(nèi)酯的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制不斷被發(fā)現(xiàn)和闡明，但是更深入的藥理機(jī)制仍有待進(jìn)一步的研究，比如給藥后海馬區(qū)域正常神經(jīng)元是來(lái)自于缺血前，還是缺血后的再生，還是兩者都有的問(wèn)題尚未得到解決，這將是我們今后進(jìn)一步研究的課題。

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doi：10.3969/j.issn.1671- 6264.2016.02.019

[中圖分類號(hào)]R966

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1671- 6264(2016)02- 0228- 04

[通信作者]朱俐E- mail:zhulili65@126.com

[作者簡(jiǎn)介]王成牛(1985-),男，江蘇南京人，實(shí)驗(yàn)師，醫(yī)學(xué)碩士。E- mail:wangchengniu@163.com

[基金項(xiàng)目]江蘇省科技廳高技術(shù)研究計(jì)劃基金(BG2007607)；南通大學(xué)校級(jí)自然科學(xué)類科研基金一般項(xiàng)目(12Z020)

[收稿日期]2015- 10- 10[修回日期] 2015- 12- 01

[引文格式] 王成牛，馮展波，彭彬，等.藁本內(nèi)酯對(duì)低灌注大鼠水迷宮成績(jī)的改善和對(duì)海馬神經(jīng)元保護(hù)作用[J].東南大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2016,35(2)：228- 231.

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