邵明英　王　皓　葛長(zhǎng)利　陳其美　董　彬李訓(xùn)碧

（1海南職業(yè)技術(shù)學(xué)院，海南?？?70000；2中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京100193；3山東藍(lán)思種業(yè)股份有限公司，山東日照276800；4全國(guó)畜牧總站，北京100124）

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中國(guó)實(shí)驗(yàn)用小型豬生化標(biāo)記檢測(cè)研究

邵明英1,2*王皓2,4*葛長(zhǎng)利3陳其美3董彬3李訓(xùn)碧2#

（1海南職業(yè)技術(shù)學(xué)院，海南?？?70000；2中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京100193；3山東藍(lán)思種業(yè)股份有限公司，山東日照276800；4全國(guó)畜牧總站，北京100124）

摘要：本試驗(yàn)采用聚丙烯酰氨凝膠電泳法，對(duì)我國(guó)實(shí)驗(yàn)用小型豬生化標(biāo)記實(shí)行相應(yīng)的探究。收集五指山小型豬、貴州小型豬、廣西巴馬小型豬和山東萊蕪豬等的血液樣品，檢測(cè)了不同品種豬堿性磷酸酶（APK）、轉(zhuǎn)鐵蛋白（Tf）、蛋白抑止物（Pi-1）、后白蛋白（Po-2）、葡萄糖6磷酸脫氫酶（G6PD）、乙醇脫氫酶（ADH3）、醛縮酶（ALDA）、碳酸酐酶（Ca）和谷氨酸脫氫酶（GLD）等9個(gè)生化標(biāo)記位點(diǎn)。結(jié)果顯示：所檢測(cè)的4個(gè)品種豬、9個(gè)生化標(biāo)記位點(diǎn)中的ADH3、GLD、ALDA三個(gè)位點(diǎn)電泳呈現(xiàn)單條帶，不存在多態(tài)性；其他6個(gè)位點(diǎn)都存在多態(tài)性。此外，還發(fā)現(xiàn)G6PD和Ca兩個(gè)位點(diǎn)在五指山小型豬、貴州小型豬、廣西巴馬小型豬品種和山東萊蕪豬中表現(xiàn)型有明顯不同。經(jīng)對(duì)所統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)與結(jié)果進(jìn)行相應(yīng)的分析與總結(jié)，確定了4個(gè)類型豬的遺傳性變異、體系構(gòu)造及種類之間的遺傳聯(lián)系等；并從此方向揭示了我國(guó)現(xiàn)存實(shí)驗(yàn)用小型豬的遺傳多樣性情況，豐富了我國(guó)地方豬種遺傳資源數(shù)據(jù)庫(kù)。

關(guān)鍵詞：實(shí)驗(yàn)用小型豬；遺傳多樣性；生化標(biāo)記；聚丙烯酰胺凝膠電泳；檢測(cè)

我國(guó)具有豐富的豬種質(zhì)資源，同時(shí)擁有獨(dú)特而又豐富的小型豬資源[1,2]。小型豬的應(yīng)用前景非常廣闊，尤其是在比較醫(yī)學(xué)領(lǐng)域：實(shí)驗(yàn)用小型豬以其來源清楚、體型小、耐近交、遺傳穩(wěn)定及遺傳背景明確等獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，以及在心血管組織、消化組織、皮膚組織、骨組織生長(zhǎng)、營(yíng)養(yǎng)攝取、新陳代謝以及解剖結(jié)構(gòu)等環(huán)節(jié)和人體比較相像，已逐漸成為醫(yī)學(xué)研究中一種重要的動(dòng)物模型[3,4]。

自20世紀(jì)80年代以來，我國(guó)已開始對(duì)小型豬資源的多領(lǐng)域開展研究，包括近交系培育、分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)、生長(zhǎng)發(fā)育規(guī)律、飼料營(yíng)養(yǎng)代謝、血液生理生化指標(biāo)、組織器官生理解剖、比較醫(yī)學(xué)生物安全性及開發(fā)應(yīng)用等[5-7]?；谖覈?guó)地形、生態(tài)條件的多樣性，我國(guó)小型豬品種在經(jīng)過歷代人工和自然選擇后，已具有得天獨(dú)厚的資源和條件。我國(guó)小型豬主要的品種有：海南五指山小型豬、云南小耳豬、貴州香豬、廣西巴馬香豬、甘肅合作豬、滇南小耳豬、烏金豬、青海藏豬等。盡管全球小型豬資源主要集中在中國(guó)和越南，但缺乏符合國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)用豬，已成為制約小型豬及其生物制品開發(fā)應(yīng)用的主要因素。

生化標(biāo)記是根據(jù)動(dòng)物機(jī)體的生理情況作為遺傳標(biāo)記，基本上包含血型、血清蛋白以及同工酶等多個(gè)方面，是當(dāng)前四大主要遺傳標(biāo)記之一。通過對(duì)動(dòng)物體內(nèi)蛋白、同工酶等的檢測(cè)，評(píng)價(jià)動(dòng)物品種內(nèi)的遺傳變異和品種間的親緣關(guān)系。血液蛋白多態(tài)性（Protein Polymorphism）是一種常用的生化遺傳標(biāo)記，表示的是具備某一特定性能的血液蛋白質(zhì)或者酶具有兩種以上的遺傳變異體[8]。

電泳是生化標(biāo)記檢測(cè)最常用的方法[9]，根據(jù)支持物不同可分為：紙電泳與凝膠電泳。聚丙烯酰氨凝膠電泳方式是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的一種常用方法，它具備以下特點(diǎn)：⑴當(dāng)濃度含量達(dá)到一定程度時(shí)，凝膠呈現(xiàn)透明狀，彈性效果較佳，機(jī)械功能較好；⑵同被分離物質(zhì)不會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的化學(xué)效果；⑶對(duì)pH值以及溫度的范圍較為穩(wěn)固；⑷從大體上來看，基本不具有電滲效果，在濃度含量較高、操作流程相同的條件下，其樣品的分離重復(fù)性較好；⑸樣品極不容易進(jìn)行分散，且使用的數(shù)量較少，靈敏程度能夠達(dá)到1 μg；⑹凝膠的孔徑可以進(jìn)行調(diào)整，并可依照被分離物質(zhì)的分子量選取與其相適應(yīng)的濃度指標(biāo)；⑺分辨率高。

本試驗(yàn)采用聚丙烯酰氨凝膠電泳法，對(duì)中國(guó)實(shí)驗(yàn)用小型豬生化標(biāo)記進(jìn)行研究。收集五指山小型豬、貴州小型豬、廣西巴馬小型豬以及山東萊蕪豬等4個(gè)品種豬的血液當(dāng)做樣本，檢測(cè)了不同品種豬的9個(gè)生化標(biāo)記位點(diǎn)。本研究的開展將為我國(guó)矮小型豬種質(zhì)資源挖掘和保護(hù)提供基礎(chǔ)，為小型豬近交系的建立提供有力的參考依據(jù)，并促進(jìn)試驗(yàn)用小型豬生化標(biāo)記檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)的制定。

1　材料與方法

1.1采樣及樣品的分離方法

使用前腔靜脈采血法，收集五指山小型豬、貴州小型豬、廣西巴馬小型豬以及山東萊蕪豬等4個(gè)品種豬的血液當(dāng)做樣本（表1）。

表1　采樣品種及數(shù)量　（頭）

每頭豬采集血液10mL，肝素鈉抗凝（肝素為100U/mL全血），在4℃的條件下，以1 000轉(zhuǎn)/分鐘的速度離心10分鐘，并在此之后，獲取上層的血漿。把下層血細(xì)胞進(jìn)行洗滌，并以1 000轉(zhuǎn)/分鐘的速度進(jìn)行離心，持續(xù)時(shí)間為10分鐘，將上層液體除去，并再次進(jìn)行洗滌。以上血漿與溶血液均保存在-20℃冰箱中備用。

1.2標(biāo)記位點(diǎn)電泳檢測(cè)試驗(yàn)

本試驗(yàn)采用垂直板聚丙烯酰氨凝膠電泳法檢測(cè)了不同品種豬堿性磷酸酶（APK）、轉(zhuǎn)鐵蛋白（Tf）、蛋白抑止物（Pi-1）、后白蛋白（Po-2）、葡萄糖6磷酸脫氫酶（G6PD）、乙醇脫氫酶（ADH3）、醛縮酶（ALDA）、碳酸酐酶（Ca）和谷氨酸脫氫酶（GLD）等9個(gè)生化標(biāo)記位點(diǎn)。凝膠濃度、緩沖液系統(tǒng)和相關(guān)電泳條件詳見表2。

表2　凝膠濃度含量，緩沖液結(jié)構(gòu)以及有關(guān)的電泳條件

1.3數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用生物學(xué)軟件Mega3.1研究系統(tǒng)發(fā)生樹，用GENEPOP估算等位基因頻率等群體遺傳學(xué)參數(shù)，用PIC統(tǒng)計(jì)工具進(jìn)行多態(tài)性信息含量、位點(diǎn)雜合度等，用DISPAN軟件包計(jì)算遺傳分化系數(shù)、總?cè)豪镫s合度、亞群體雜合度和遺傳距離等。

2　結(jié)果與分析

2.1生化標(biāo)記功能分析

本研究遵循下述幾項(xiàng)規(guī)定選取了9個(gè)待測(cè)定的生化標(biāo)記位點(diǎn)（表3）：參考在豬種類中和別的實(shí)驗(yàn)型生物中已經(jīng)存在的生化標(biāo)記位點(diǎn)；綜合考察備選位點(diǎn)在染色體的分布，盡可能涵蓋全部染色體，以其代表該品種動(dòng)物的特點(diǎn)。

堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase,AKP）是目前免疫診斷試劑產(chǎn)品最常用的標(biāo)記酶之一，具有穩(wěn)定性高、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。作為一種非特異性磷酸單酯酶，AKP能催化磷酸單酯的水解反應(yīng)和磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移反應(yīng)[10]。

轉(zhuǎn)鐵蛋白（Transferrin,Tf）又稱運(yùn)鐵蛋白，是血漿中β球蛋白與鐵結(jié)合蛋白的一種復(fù)合物，最早是從豬的血清中提取。一個(gè)轉(zhuǎn)鐵蛋白分子可以和兩個(gè)Fe3+進(jìn)行融合，并把Fe傳遞至骨髓中，對(duì)血紅蛋白的形成起到一定的促進(jìn)作用。除此之外，轉(zhuǎn)鐵蛋白還可以起到抗微生物的效果，并因其具有多種分子體系，所以在進(jìn)行電泳之后，呈現(xiàn)出的區(qū)帶也是多樣化的[11]。

蛋白抑止物（Protease inhibitor,Pi-1），主要功能是中和由白細(xì)胞、肝臟和細(xì)菌釋放出來的蛋白酶[12]。

后白蛋白（Postalbumin,Po-2）又稱清蛋白，是血漿中含量最高的蛋白質(zhì)，主要作用是維持血漿中膠體的滲透壓。后白蛋白主要由肝臟合成，Po-2的濃度含量能夠體現(xiàn)出肝臟組織的主要性能，其濃度的變化可以引發(fā)相應(yīng)的繼發(fā)癥狀。對(duì)血清后白蛋白的檢測(cè)已廣泛應(yīng)用于生化標(biāo)記監(jiān)測(cè)[12]。

葡萄糖6磷酸脫氫酶（Glucose-6-phosphate dehydrogen ase,G6PD）存在于機(jī)體的血紅細(xì)胞中，并幫助葡萄糖進(jìn)行機(jī)體代謝，在此環(huán)節(jié)中將會(huì)生成NADPH，進(jìn)而避免血紅細(xì)胞受到氧化組織的侵害。G6PD可以協(xié)助血紅細(xì)胞正常運(yùn)行，保護(hù)血紅細(xì)胞抵抗物質(zhì)的積聚[13]。

乙醇脫氫酶（Alcohol dehydrogenase3,ADH3）基本上則是在肝臟部位產(chǎn)生，因此肝臟組織所患有的疾病或許同血清ADH活性存在密切的聯(lián)系。采用分光光度方式對(duì)血清內(nèi)ADH的活性進(jìn)行評(píng)測(cè)，并且對(duì)這一指標(biāo)進(jìn)行深入的探討，研究出其在疾病治療過程中所起的作用。通過血清ADH活性測(cè)定，可以明確肝臟組織的各項(xiàng)功能是否存在問題。在對(duì)患有肝臟疾病患者血清內(nèi)的ADH進(jìn)行檢測(cè)時(shí)我們可觀察到，最終結(jié)果顯著高于普通人群[14]。

谷氨酸脫氫酶（Glutamic acid dehydrogenase,GLDH）是眾多線粒體酶中的一類，其中含有部分鋅元素，該酶在人體內(nèi)的分布具有一定規(guī)律，多出現(xiàn)在肝臟、心肌以及腎細(xì)胞中，其中，肝細(xì)胞中的GLDH活性最高，它催化谷氨酸脫氨生成α-酮戊二酸和氨的反應(yīng)[15]。

醛縮酶（Aldolase,ALD）通常是指糖酵解途徑中的1,6-二磷酸果糖醛縮酶，是Meyerhof等于1936年首先發(fā)現(xiàn)的。自1950年起，有關(guān)人員對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的醛縮酶進(jìn)行了持續(xù)的探究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)動(dòng)物體內(nèi)共存在三類不同的ALD同工酶。血清ALD增高主要用于診斷肌肉和肝臟疾病，也可能是體內(nèi)某些組織或器官發(fā)生病變所致。每個(gè)細(xì)胞中存在的ALD同工酶都具備其各自不同的獨(dú)特性質(zhì)，因此檢測(cè)血清中的ALD同工酶能夠有效增強(qiáng)細(xì)胞的獨(dú)特性質(zhì)，從而可以相對(duì)精準(zhǔn)地找出發(fā)生病變反應(yīng)的區(qū)域，及該區(qū)域發(fā)生病變反應(yīng)的嚴(yán)重程度[16]。

表3　生化標(biāo)記位點(diǎn)

碳酸酐酶（Carbonic anhydrase,Ca）屬于金屬酶的范疇，其中含有一定量的鋅元素，這種酶的組成結(jié)構(gòu)有一個(gè)重要特性，即在它的活性區(qū)域存在一種特殊的鋅原子，且該鋅原子是其發(fā)揮催化效應(yīng)的必備元素。這種酶的催化機(jī)理為：促進(jìn)二氧化碳進(jìn)行水和反應(yīng)，且該反應(yīng)在一定條件下可逆，繼而減少二氧化碳在植物葉肉組織中的流通障礙，有效推動(dòng)二氧化碳向Rubi-sco的進(jìn)一步流通，從而保證植物體內(nèi)的羧化反應(yīng)能夠具備充足的反應(yīng)物質(zhì)。許多生物反應(yīng)都涉及到了碳酸酐酶的催化作用，其中主要有pH調(diào)節(jié)、離子轉(zhuǎn)換、CO2運(yùn)輸、呼吸作用及光合作用中的二氧化碳固定等[17]。

2.2生化位點(diǎn)遺傳變化和遺傳學(xué)差異

根據(jù)GENEPOP軟件工具，對(duì)樣品山東萊蕪豬43頭份、貴州小型豬44頭份、五指山小型豬43頭份、廣西巴馬小型豬73頭份的生化位點(diǎn)出現(xiàn)頻率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)（表4）。

表4　不同豬種生化位點(diǎn)的發(fā)生頻率

2.3不同品種豬的遺傳多樣性信息

根據(jù)生物學(xué)軟件pic統(tǒng)計(jì)工具，對(duì)樣品山東萊蕪豬43頭份、貴州小型豬44頭份、五指山小型豬43頭份、廣西巴馬小型豬73頭份的有效等位基因數(shù)（Ne）、多態(tài)信息含量（PIC）以及平均雜合度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)（表5）。

表5　四個(gè)品種的有效等位基因數(shù)、多態(tài)信息含量和雜合度

根據(jù)生物學(xué)軟件GENEPOP和PIC統(tǒng)計(jì)工具，對(duì)樣品山東萊蕪豬43頭份、貴州小型豬44頭份、五指山小型豬43頭份、廣西巴馬小型豬73頭份進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，得出不同豬品種的遺傳多樣性信息（表6）。

根據(jù)生物學(xué)軟件DISPAN，對(duì)樣品山東萊蕪豬43頭份、貴州小型豬44頭份、五指山小型豬43頭份、廣西巴馬小型豬73頭份得出4個(gè)品種豬的遺傳距離（表7）。

3　討論

3.1生化標(biāo)記位點(diǎn)多態(tài)性

本文針對(duì)4個(gè)不同種類豬的9個(gè)生化標(biāo)記位點(diǎn)進(jìn)行了探究，詳細(xì)敘述了中國(guó)4個(gè)不同區(qū)域性種類豬的遺傳構(gòu)型與遺傳變異。探究成果顯示，試驗(yàn)測(cè)定的9個(gè)生化標(biāo)記位點(diǎn)中的ADH3、GLD、ALDA等3個(gè)位點(diǎn)電泳呈現(xiàn)單條帶，不存在多態(tài)性；其他6個(gè)位點(diǎn)都存在多態(tài)性。此外，還發(fā)現(xiàn)G6PD和Ca兩個(gè)位點(diǎn)在五指山小型豬、貴州小型豬、廣西巴馬小型豬品種和一個(gè)普通豬品種山東萊蕪豬中表現(xiàn)型有明顯不同（表4）。

Pi-1有2種基因型，且呈多態(tài)性，不同品種豬的Pi-1A和Pi-1B等位基因的頻率有差異，在山東萊蕪豬中Pi-1A和Pi-1B等位基因的頻率分別為0.41666和0.58333，Pi-1B為優(yōu)勢(shì)基因；在貴州小型豬中Pi-1A 和Pi-1B等位基因的頻率分別為0.41666和0.58333，Pi-1B為優(yōu)勢(shì)基因；在五指山小型豬中Pi-1A和Pi-1B等位基因的頻率分別為0.82558和0.17441，Pi-1A為優(yōu)勢(shì)基因；在巴馬小型豬中Pi-1A和Pi-1B等位基因的頻率分別為0.77083和0.22916，Pi-1A為優(yōu)勢(shì)基因。

表6　遺傳多樣性信息

表7　4個(gè)品種豬的遺傳距離

Po-2有2種基因型，且呈多態(tài)性，在山東萊蕪豬中Po-2A和Po-2B等位基因的頻率分別為0.57142和0.4257，Po-2A為優(yōu)勢(shì)基因；在貴州小型豬中Po-2A 和Po-2B等位基因的頻率分別為0.15909和0.84090，Po-2B為優(yōu)勢(shì)基因；在五指山小型豬中Po-2A和Po-2B等位基因的頻率分別為0.77906和0.22093，Po-2A為優(yōu)勢(shì)基因；在巴馬小型豬中Po-2A和Po-2B等位基因的頻率分別為0.94444和0.05555，Po-2A為優(yōu)勢(shì)基因。

Tf有多種基因型，且呈多態(tài)性[18]，在山東萊蕪豬中，TfA、TfB、TfC和TfD的基因頻率分別為0.26744、0.65476、0.05952和0.01190，TfB為優(yōu)勢(shì)基因；在貴州小型豬中，TfA和TfB等位基因的頻率分別為0.32222和0.67045，TfB為優(yōu)勢(shì)基因；在五指山小型豬中，TfA、TfB、TfC和TfD的基因頻率分別為0.29545、0.32558、0.16279和0.20930，TfB為優(yōu)勢(shì)基因；在巴馬小型豬中，TfA、TfB、TfC和TfD的基因頻率分別為0.28767、0.59722、0.06250和0.04861，TfB為優(yōu)勢(shì)基因。

AKP有2種基因型，且呈多態(tài)性，不同品種豬的AKPA和AKPB等位基因的頻率有差異，在山東萊蕪豬中，AKPA和AKPB等位基因的頻率分別為0.13095和0.86904，AKPB為優(yōu)勢(shì)基因；在貴州小型豬中，AKPA 和AKPB等位基因的頻率分別為0.04545和0.95454，AKPB為優(yōu)勢(shì)基因；在五指山小型豬中，AKPA和AKPB等位基因的頻率分別為0.09302和0.90697，AKPB為優(yōu)勢(shì)基因；在巴馬小型豬中，AKPA和AKPB等位基因的頻率分別為0.10416和0.89583，AKPB為優(yōu)勢(shì)基因。

G6PD和Ca的分析同上。

3.2遺傳多樣性

已有研究表明，用于測(cè)量遺傳變化的生化標(biāo)記在種群內(nèi)的平均雜合度需要維持在0.3～0.8的范疇內(nèi)，否則就不具備一定的實(shí)踐價(jià)值[19]。在該探究中生化標(biāo)記在4個(gè)中國(guó)地方豬品種的平均雜合度維持在0.36～0.54的范疇內(nèi)（表6），所以該探究運(yùn)用采用的生化標(biāo)記，能夠有效適用于檢測(cè)生物遺傳多樣化的相關(guān)研究中。

3.3遺傳距離

遺傳距離能夠在一定程度上顯示不同種類或者不同品系間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近。按照有關(guān)遺傳距離計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)得到的規(guī)范距離為從0.0223～0.1112不等（表7），其中兩品種間距離最近的是廣西巴馬小型豬和五指山小型豬（0.0223），五指山小型豬與貴州小型豬距離最遠(yuǎn)（0.1112）。

4　結(jié)論

動(dòng)物生化標(biāo)記是家畜遺傳變異的直接反映。生化標(biāo)記多樣化和生物經(jīng)濟(jì)性狀在遺傳上具有一定的聯(lián)系，且在理論上通常體現(xiàn)為3類不同的形式。除此之外，生化標(biāo)記多樣化不僅在理論上具有前瞻性的引導(dǎo)價(jià)值，在經(jīng)濟(jì)生產(chǎn)方面還存在一定的實(shí)際意義，能夠適用于對(duì)生物種類的初期篩選及相關(guān)遺傳育種工作，從而可有效推動(dòng)我國(guó)遺傳育種的發(fā)展進(jìn)程。

本研究挑選了三個(gè)用于我國(guó)試驗(yàn)探究的小型豬品種，以及一個(gè)區(qū)域性品種豬的9個(gè)生化標(biāo)記位點(diǎn)作為探究對(duì)象，并對(duì)其實(shí)行有效測(cè)定，通過蛋白凝膠電泳梯度檢測(cè)了不同品種豬生化標(biāo)記位點(diǎn)。通過生化標(biāo)記檢測(cè)成果的統(tǒng)計(jì)剖析及聚類，確定了4個(gè)不同種類豬的遺傳變異、種群構(gòu)型及不同種類間的親緣關(guān)系。從生化標(biāo)記多樣化著手，深刻闡述了我國(guó)目前存在的小型品種豬的遺傳多樣化狀況，豐富了我國(guó)地方豬種遺傳資源數(shù)據(jù)庫(kù)。

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#通訊作者：李訓(xùn)碧，助理研究員，E-mail:lixunbi0214@163.com

作者簡(jiǎn)介：邵明英(1976-)，女，河北人，畜牧師，主要從事畜牧獸醫(yī)專業(yè)教學(xué)及科研工作；E-mail: mingshao2013@aliyun.com，Tel：0898-31930606

基金項(xiàng)目：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程"（ASTIP-IAS05）；山東省泰山學(xué)者種業(yè)計(jì)劃項(xiàng)目，863計(jì)劃項(xiàng)目（2013AA102502）

收稿日期：2015-08-28

中圖分類號(hào)：S828.8+9

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

文章編號(hào)：1673-4645(2016)02-0055-06

*共同第一作者：王皓（1981-），男，山東人，畜牧師，從事種畜禽遺傳改良和生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)管理工作，E-mail:2712wanghao@163.com，Tel：010-59194610