劉文營++張振琪++成曉瑜++李迎楠++賈曉云++李家鵬++陳文華++曲超

摘 要：運(yùn)用超聲輔助酶解進(jìn)行豬血血紅素的制備，并對豬血血紅素在不同環(huán)境下紫外-可見吸收光譜進(jìn)行分析。結(jié)果表明：超聲可以使酶活力提高25.5%，提高了酶解反應(yīng)效率，縮短了酶解反應(yīng)所需時間；對酶解產(chǎn)物pH值調(diào)節(jié)后進(jìn)行離心分離血紅素，并經(jīng)純水洗滌后再次離心，對血紅素樣品進(jìn)行真空冷凍干燥；通過與血紅素標(biāo)準(zhǔn)品比對，所得產(chǎn)品純度達(dá)到83.2%。在堿性條件下，血紅素溶液具有明顯的特征吸收光譜；在酸性條件下，血紅素溶液在300～400 nm和640 nm附近的特征吸收光譜發(fā)生了顯著變化，吸收值明顯降低。

關(guān)鍵詞：酶解；豬血；血紅素；吸收光譜

Ultrasonic-Assisted Enzymatic Extraction of Porcine Heme and Characterization by UV-Vis Absorption Spectroscopy

LIU Wenying1， ZHANG Zhenqi2， CHENG Xiaoyu1，*， LI Yingnan1， JIA Xiaoyun1， LI Jiapeng1， CHEN Wenhua1， QU Chao1

（1. Beijing Key Laboratory of Meat Processing Technology， China Meat Research Center， Beijing Academy of Food Sciences，

Beijing 100068， China； 2.Beijing Light Industry Polytechnic College， Beijing 100070， China）

Abstract： Porcine heme was prepared by ultrasonic-assisted enzymatic hydrolysis of porcine red blood cells with Protamex and its UV-Vis absorption characteristics under acidic and alkaline conditions were analyzed. Results revealed that ultrasonic treatment resulted in a 25.5% increase in the enzyme activity， augmenting the hydrolysis efficiency and shortening the hydrolysis time. After pH adjustment of the hydrolysate， centrifugal separation of heme was carried out， followed by washing with purified water， second centrifugation and vacuum freeze drying. The product purity was determined using heme standard to be 83.2%. Under alkaline condition， the heme exhibited the obvious characteristic absorption， whereas under acidic condition， its characteristic absorption in the region of 300–400 nm and near 640 nm changed noticeably， showing a pronounced decrease in absorbance values.

Key words： enzymatic hydrolysis； pig blood； heme； absorption spectrum

DOI：10.15922/j.cnki.rlyj.2016.03.001

中圖分類號：TS251.93 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-8123（2016）03-0001-04

引文格式：

劉文營， 張振琪， 成曉瑜， 等. 超聲輔助酶解制備豬血血紅素及紫外-可見吸收光譜分析[J]. 肉類研究， 2016， 30（3）：

1-4. DOI：10.15922/j.cnki.rlyj.2016.03.001. http：//rlyj.cbpt.cnki.net

LIU Wenying， ZHANG Zhenqi， CHENG Xiaoyu， et al. Ultrasonic-assisted enzymatic extraction of porcine heme and characterization by UV-Vis absorption spectroscopy[J]. Meat Research， 2016， 30（3）： 1-4. （in Chinese with English abstract） DOI：10.15922/j.cnki.rlyj.2016.03.001. http：//rlyj.cbpt.cnki.net

血是畜禽屠宰加工過程產(chǎn)生的主要副產(chǎn)物之一，我國2014年全年豬肉總產(chǎn)量為5 671萬 t，在滿足人們消費(fèi)需求的同時，產(chǎn)生了大量豬副產(chǎn)物，其中豬血占有重要部分[1]。血液中含有大量的蛋白質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)和其他物質(zhì)，被譽(yù)為“液體肉”，其中尤其以血細(xì)胞中蛋白質(zhì)和鐵含量最為豐富[1-2]。

目前人們對豬血的應(yīng)用集中在食品、飼料、化工和醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域，食品上主要是進(jìn)行血豆腐、血腸等的加工，或者利用血紅素增加肉制品的著色效果；在飼料應(yīng)用上主要是補(bǔ)充蛋白質(zhì)和礦物質(zhì)等，增加非反芻動物的免疫力；而醫(yī)學(xué)上主要是生物制劑的開發(fā)。但是鑒于其在食品加工上附加值較低，飼料利用上又考慮到物種的同源性，使其利用受到限制；而在醫(yī)學(xué)上進(jìn)行生物制劑的加工，包括血紅蛋白肽、血紅素等的加工，基于其來源廣、成本低廉和易于加工，將會產(chǎn)生良好的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益，應(yīng)用前景廣闊[3-4]。

缺鐵是當(dāng)今世界上最為嚴(yán)重的營養(yǎng)缺乏癥之一，缺鐵會對生物體產(chǎn)生各種損害[5]。傳統(tǒng)的補(bǔ)鐵制劑主要是二價的非血紅素鐵，如硫酸亞鐵和有機(jī)酸亞鐵鹽類等，這些補(bǔ)鐵制劑易受其他因素干擾，吸收效率不高，同時，體內(nèi)金屬鐵離子過多時，會誘發(fā)體內(nèi)產(chǎn)生大量自由基，對身體健康產(chǎn)生危害。因此尋找一種安全、高效的補(bǔ)鐵制劑迫在眉睫。血紅素是一類鐵卟啉化合物，結(jié)構(gòu)如圖1所示[6]，是紅細(xì)胞的主要成分之一，血紅素在小腸內(nèi)直接被上皮細(xì)胞吸收，不受植酸鹽等物質(zhì)影響，吸收率可達(dá)15%～20%[7-8]，為其作為一種安全有效的鐵制劑提供了方便。

血紅素的傳統(tǒng)制備方法，主要有冰醋酸法、酸性丙酮法、羧甲基纖維素法和蛋白酶水解法等。鑒于有機(jī)溶劑難以回收、產(chǎn)品純度較低、生產(chǎn)成本高和生產(chǎn)周期長等缺點(diǎn)，目前普遍采用酶解法[9-10]。本研究旨在通過超聲輔助酶解反應(yīng)制備血紅素，對其提取效果進(jìn)行分析，并針對血紅素在不同環(huán)境下的穩(wěn)定性進(jìn)行分析，以期對血紅素更好地提取、利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬血采自北京資源亞太食品有限公司，采血后加入5‰檸檬酸三鈉抗凝，充分混勻后冷藏備用。

二水合檸檬酸三鈉、氫氧化鈉、鹽酸、硝酸、鹽酸、硫酸、氯化鈉均為分析純 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；ProtamexTM復(fù)合蛋白酶 諾維信（中國）生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

CR21GⅢ離心機(jī) 日本日立株式會社；LCH-18恒溫水槽 日本三洋株式會社；BSA822-CW天平、PB-10

pH計 德國賽多利斯集團(tuán)；F6/10-10G超細(xì)勻漿器

上海Fluko流體機(jī)械制造有限公司；Agilent 7700電感耦合等離子體質(zhì)譜儀 美國安捷倫科技公司；Cary 50 spectrophotometer紫外-可見分光光度計 美國Varian公司；Cascada BIO純水機(jī) 美國Pall公司；UP-400S手

提式超聲波細(xì)胞破碎儀 寧波新芝公司；TANK微波消解儀 濟(jì)南海能儀器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 血紅蛋白溶液的制備

將加入抗凝劑的血液，在3 000 r/min條件下離心10 min，將獲得的沉淀加入0.9%的NaCl溶液攪勻后再次離心，重復(fù)3 次；將獲得的沉淀在沸水下加熱10 min，用均質(zhì)機(jī)充分均質(zhì)，置于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 超聲條件的選擇

參考文獻(xiàn)[11]方法測定酶活性大小。超聲條件選擇的依據(jù)是酶活力的大小，依據(jù)酶最適活性溫度，將酶反應(yīng)的條件設(shè)為40 ℃、pH 6.0。通過改變超聲的功率大小，對比酶活性的大小，選擇最為合適的超聲條件。

1.3.3 水解度測定[12-13]

（1）

式中：AN為氨基態(tài)氮含量/（mol/L）；TN為總氮含

量/（mol/L）。

1.3.4 水解條件工藝參數(shù)的選擇

將制備好的血紅蛋白水溶液pH值調(diào)節(jié)至6.0，設(shè)定反應(yīng)溫度為40 ℃，待恒溫后加入反應(yīng)酶，開始反應(yīng)。水解過程中，滴加0.1 mol/L的NaOH溶液，保持反應(yīng)體系pH值的恒定，水解反應(yīng)結(jié)束后，將酶反應(yīng)液在沸水浴中加熱10 min滅酶。

參考文獻(xiàn)[12-14]方法，測定水解度和上清液在383 nm波長處吸光度A383 nm，確定所需的反應(yīng)時間。

1.3.5 血紅素的分離純化

將水解液在30 ℃保溫后，將水解液調(diào)節(jié)為pH 4.0，分別在3 000、3 500、4 000、4 500、5 000 r/min離心，通過在383 nm波長處測定吸光度A383 nm，確定最佳沉淀的轉(zhuǎn)速；將水解液調(diào)節(jié)為pH 4.0，在4 000 r/min下離心，通過在383 nm波長處測定吸光度A383 nm，確定最佳離心時間。

1.3.6 鐵離子含量的測定

參考文獻(xiàn)[15-16]方法，采用微波消解和電感耦合等離子體質(zhì)譜（inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS）法測定樣品中鐵離子含量，并略有修改。

微波消解條件為：樣品加入10 mL消解液（HNO3∶HCl=5∶2，V/V），分別在120 、180、150 ℃條件下1 500 W超聲2 min，然后定容待用。

ICP-MS操作參數(shù)如下：功率1 270 W，冷卻氣流量（Ar）12 L/min，霧化氣流量（Ar） 1 L/min，掃描次數(shù)200 次，停留時間10 ms，總采樣時間18 s。

1.3.7 血紅素的提取率和純度的測定

（2）

式中：產(chǎn)品中血紅素含量、原料中血紅素含量（以鐵含量換算為血紅素含量/g）。

（3）

式中：產(chǎn)品中鐵含量（以ICP-MS測定鐵含量計/%）；純品血紅素鐵含量（以血紅素理論值計13.77%）。

1.3.8 吸收光譜學(xué)分析

參考文獻(xiàn)[17-18]方法，并略有修改，樣品制備后掃描190～1 100 nm紫外-可見吸收光譜，掃描波長為1 nm，掃描3 次，取平均值。

1.4 數(shù)據(jù)分析

實驗均進(jìn)行3 次重復(fù)，取平均值，使用Excel、Origin 8.0

進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 血紅素制備條件的選擇

2.1.1 超聲對酶活力的影響

實驗中選用的酶為復(fù)合蛋白酶，最適的反應(yīng)條件為40 ℃、pH 6.0。由圖1可知，隨著超聲頻率的增加，酶活力的大小呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢，在21 kHz時酶活力最高，較之不超聲酶活力增加25.5%。先前亦有研究[19]報道超聲能夠增強(qiáng)酶的活性，在一定程度上縮短酶解反應(yīng)所需的時間。

2.1.2 酶解時間的選擇

酶解反應(yīng)能夠?qū)⒀t素與結(jié)合的珠蛋白等分離，酶解過程中的水解度和上清液吸光度如圖3所示。隨著反應(yīng)的進(jìn)行，水解度逐漸增加，同時上清液的吸光度也呈現(xiàn)先增加后穩(wěn)定的趨勢。水解度的增加是由于復(fù)合蛋白酶對紅細(xì)胞蛋白的水解作用，將血紅蛋白等分解為血紅素、血紅蛋白肽等，血紅素的釋放使得上清液的特征吸光度A383 nm增加。結(jié)合水解度和特征吸光度A383 nm，考慮到投入的成本和生產(chǎn)效率，在2.5 h時基本達(dá)到需要，認(rèn)定為需要的反應(yīng)時間。同時，考慮到酶解反應(yīng)的酶種類的不同和反應(yīng)處理條件的不同，酶解時間各不相同[9-10，12]。

2.1.3 血紅素提取條件的選擇

由圖4a可知，在固定離心時間15 min條件下，隨著離心轉(zhuǎn)速的增加，上清液A383 nm呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢，在離心轉(zhuǎn)速達(dá)到4 000 r/min以后，離心轉(zhuǎn)速的增加對上清液吸光度的大小影響不大，考慮到提取時間和成本消耗，選擇對血紅素在4 000 r/min下分離；而同樣，在離心處理的時間上，如圖4b所示，隨著離心時間的增加，上清液A383 nm也是呈現(xiàn)下降的趨勢，從35 min時開始，隨著離心時間的延長，上清液吸光度變化較為緩和，所以，亦選擇處理35 min。血紅素樣品的分離條件選為4 000 r/min、35 min。依照以上方法制備的血紅素的純度為83.2%，提取率為30.2%，較文獻(xiàn)方法有所提高[9-10，14]。

2.2 血紅素的紫外-可見吸收光譜

2.2.1 堿性條件下血紅素紫外-可見吸收光譜

文獻(xiàn)報道顯示，血紅素在383、403、575、640 nm波長附近有特征吸收[3，14，20-21]。由圖5可知，所得樣品在383、403、640 nm波長處有明顯的吸收峰，而575 nm波長處亦處于特征吸收光譜范圍內(nèi)，結(jié)果與文獻(xiàn)報道一致。

2.2.2 血紅素在酸性條件下的紫外-可見吸收光譜

由圖6可知，血紅素在堿性溶液中，其溶液在383、403、575、640 nm具有明顯的特征吸收光譜，但是在酸性條件下，其300～400 nm和640 nm附近的特征光譜吸收發(fā)生了明顯的下降，說明酸性條件對血紅素的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了影響；同時，在400 nm附近的最大吸光度在酸性條件下也產(chǎn)生了明顯的降低，說明酸性條件對血紅素及其衍生物的溶解性有顯著影響，與文獻(xiàn)報道結(jié)果一致[14，21]。

3 結(jié) 論

運(yùn)用復(fù)合蛋白酶進(jìn)行豬血血紅素制備的條件為：3 000 r/min下離心10 min分離血紅蛋白，并進(jìn)行3 次洗滌；血細(xì)胞沸水條件下加熱10 min使蛋白變性，然后勻漿均質(zhì)；復(fù)合蛋白酶反應(yīng)條件為40 ℃、pH 6.0，反應(yīng)2.5 h；4 000 r/min條件下離心35 min，純水洗滌3 次后收集沉淀，并對樣品冷凍干燥；制備的血紅素的純度是83.2%，提取率為30.2%。

血紅素在堿性條件下，在383、403、575、640 nm波長處具有明顯的特征吸收光譜；血紅素在酸性條件下，特征光譜吸收值下降明顯，尤其是在300～400 nm和640 nm附近，說明酸性條件對血紅素的穩(wěn)定性有直接影響。

實驗通過血紅素溶液在不同條件下的特征吸收光譜的變化，對揭示血紅素的穩(wěn)定性有重要意義，為血紅素作為色素應(yīng)用于不同肉制品中提供參考，為血紅素的妥善保存、有效利用和消除提供思路。針對血紅素在不同條件下的變化機(jī)理尚需更進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1] 黃群， 馬美湖， 楊撫林， 等. 畜禽血液血紅蛋白的開發(fā)利用[J]. 肉類工業(yè)， 2003（10）： 19-20.

[2] 石磊， 劉藝， 王亞娟， 等. 酶解豬血液對大鼠缺鐵性貧血預(yù)防效果研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè)， 2015， 51（3）： 49-52； 59.

[3] MAN J I， HEE J C， NANR S. Process development for heme enriched peptide by enzymatic drolysis of hemoglobin[J]. Bioresource Technology， 2002， 84： 63-68. DOI：10.1016/S0960-8524（02）00009-3.

[4] 余群力， 馮玉萍. 家畜副產(chǎn)物綜合利用[M]. 北京： 中國輕工業(yè)出版社， 2014.

[5] THEIL E C. Iron， ferritin， and nutrition[J]. Annual Review of Nutrition， 2004， 24： 327-343. DOI：10.1146/annurev.nutr.24.012003.132212.

[6] 宋艷群， 祝融峰， 陳鵬. 血紅素的生理分布與調(diào)控[J]. 中國科學(xué)： 化學(xué)， 2015， 45（11）： 1194-1205.

[7] ADRIN G Q G， GUILLERMINA G R， JONATHAN S M， et al. Bioavailability of heme iron in biscuit filling using piglets as an animal model for humans[J]. International Journal of Biological Sciences， 2008， 4（1）： 58-62.

[8] VAGHEFI N， NEDJAOUM F， GUILLOCHON D， et al. Iron absorption from concentrated hemoglobin hydrolysate by rat[J]. Journal of Nutritional Biochemistry， 2005， 16（6）： 347-352. DOI：10.1016/j.jnutbio.2005.01.003.

[9] 赫玉蘭， 盧士玲， 王琦翔， 等. 分步酶解牛血紅蛋白制備血紅素多肽[J].

食品工業(yè)， 2015， 36（11）： 201-205.

[10] 祝霞， 李潁， 付文力， 等. 堿性蛋白酶酶解提取羊血血紅素工藝條件優(yōu)化[J]. 食品工業(yè)科技， 2014， 35（18）： 199-202.

[11] OWUSU-APENTEN K R. Food protein analysis[M]. New York： Marcel Dekker Inc.， 2002： 70-71.

[12] JAMDAR S， RAJALAKSHMI V， PEDNEKAR M， et al. Influence of degree of hydrolysis on functional properties， antioxidant activity and ACE inhibitory activity of peanut protein hydrolysate[J]. Food Chemistry， 2010， 121（1）： 178-184. DOI ：10.1007/s10068-012-0004-6.

[13] 張意靜. 食品分析技術(shù)[M]. 北京： 中國輕工業(yè)出版社， 2001.

[14] 鐘耀廣. 豬血球中卟啉鐵的提取方法及血紅素修飾技術(shù)的研究[D]. 北京： 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2002.

[15] 張六一， 付川， 楊復(fù)沫， 等. 微波消解ICP-OES法測定PM 2.5中金屬元素[J]. 光譜學(xué)與光譜分析， 2014， 34（11）： 3109-3112.

[16] 劉文營， 張建， 童軍茂， 等. 鐵蛋白脫鐵機(jī)制的建立及脫鐵前后光譜變化的研究[J]. 光譜學(xué)與光譜分析， 2011， 31（9）： 2552-2554.

[17] 劉小珍， 馮軍亮， 劉小舟， 等. 稀土納米金對銀染效果的影響及其UV-Vis吸收光譜[J]. 光譜學(xué)與光譜分析， 2015， 35（12）： 3560-3564.

[18] 姜波， 胡文忠， 劉長建， 等. 有機(jī)蒸氣的紫外-可見吸收光譜定性檢測[J].

光譜學(xué)與光譜分析， 2015， 35（12）： 3454-3458.

[19] 王忠合， 王軍， 陳長流， 等. 超聲波輔助酶解豌豆分離蛋白的動力學(xué)及酶解物功能特性研究[J]. 中國食品學(xué)報， 2015， 15（4）： 103-109.

[20] GORDON A R， PETER L， DAVID P. Seperation and tryptic digest mapping of normal and variant haemoglobins by capillary electrophoresis[J]. Journal of Chromatography， 1993， 636： 69-72.

[21] MARIA E L， LIDIA S A， ALCIRA B， et a1. A spectrophotometric method for estimating hemin in biological system[J]. Analytical Biochemistry， 2005， 341： 199-203.