劉　健，馬義濤，潘俊龍，翁巧琴，張金枝*

(1.浙江大學動物科學學院，浙江杭州 310058；2.余姚市欣農(nóng)兔業(yè)有限公司)

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獺兔成纖維細胞生長因子5(FGF5)基因的多態(tài)性研究

劉健1，馬義濤1，潘俊龍1，翁巧琴2，張金枝1*

(1.浙江大學動物科學學院，浙江杭州 310058；2.余姚市欣農(nóng)兔業(yè)有限公司)

摘要：隨機選擇5月齡左右獺兔50只。采用直接測序方法檢測獺兔成纖維細胞生長因子5(FGF5)基因第4個外顯子的基因多態(tài)性；并對獺兔毛皮性狀的相關數(shù)據(jù)進行方差分析和多重比較；將獺兔CDS編碼區(qū)序列同其他物種進行比對。結果發(fā)現(xiàn)，所選獺兔群中，未發(fā)現(xiàn)堿基突變位點，在所有的個體中，僅發(fā)現(xiàn)一種單倍體型；獺兔的主要毛皮性狀差異不顯著(P>0.05)；獺兔CDS序列同其他物種相比差異不大。

關鍵詞：FGF5基因；多態(tài)性分析；毛皮性狀；獺兔

獺兔，原名力克斯兔(Rex rabbit)，原產(chǎn)于法國，是珍貴的裘皮用兔，因其皮毛酷似珍貴的毛皮獸—水獺，故稱之為獺兔[1]。獺兔貴在毛皮，廣泛用于服裝業(yè)，制作成裘皮大衣、圍巾等，具有良好的保暖作用，養(yǎng)殖前景十分廣闊[2]。

成纖維細胞生長因子(FGF)廣泛存在于各組織中，迄今為止已鑒定出23種FGFs，F(xiàn)GF5是FGF家族中的一員[3]。眾多學者研究發(fā)現(xiàn)，兔毛生長發(fā)育過程與毛囊/毛乳頭有著密切聯(lián)系[4-9]，F(xiàn)GF5是唯一通過影響毛囊生長期的長短從而影響被毛長度的調(diào)控因子[10]，F(xiàn)GF5基因?qū)ν玫拿ば誀罹哂兄匾恼{(diào)節(jié)作用，可以作為研究其毛皮性狀的遺傳標記[11-12]。

本研究通過PCR方法擴增出獺兔FGF5基因的第4個外顯子后，采用直接測序方法檢測并分析FGF5基因外顯子4的多態(tài)性，分析獺兔群體毛皮性狀的相關數(shù)據(jù)，并將獺兔的CDS序列同其他物種進行對比，以期為研究FGF5基因與獺兔毛皮性狀的相關性提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗動物試驗在余姚市欣農(nóng)兔業(yè)有限公司兔場進行，隨機選擇5月齡左右獺兔50只。屠宰測定毛皮性狀前，頸靜脈采血10 mL于抗凝管中備用；測定毛長及皮板長、皮板寬等主要毛皮性狀。

1.2基因組DNA提取采用血液基因組DNA提取試劑盒提取獺兔血液基因組DNA，使用微量核酸儀檢測所提取的DNA濃度，保證所提取的DNA濃度在80 ng/μL以上。

1.3引物設計使用Primer 5.0設計引物，擴增出兔FGF5基因外顯子4的片段，片段長度為300 bp左右。引物由上海某生物技術有限公司合成。引物序列見表1。

表1　PCR擴增所用引物序列、產(chǎn)物長度

1.4PCR擴增PCR擴增總體積為50 μL，其中包括25 μL Premix TaqTM、21 μL ddH20、上下游引物各1 μL (10 pmol/gL)、2 μL模板DNA。PCR擴增程序：94℃預變性5 min；然后94℃ 45 s，復性溫度54℃，72℃ 1 min，34個循環(huán)；72℃繼續(xù)延伸10 min。PCR產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結束后采用UVP熒光成像系統(tǒng)分析檢測擴增結果。

1.5產(chǎn)物純化與測序未經(jīng)純化的PCR產(chǎn)物送上海某生物技術有限公司純化并測序。測序結果使用Clustal x排定DNA序列，再經(jīng)人工核對，并采用Bioedit，DNA man，DNA star等軟件進行序列結構分析及序列峰圖校正等。

1.6獺兔毛皮性狀的統(tǒng)計分析供試獺兔按體重大小分為4組，利用Excel記錄整理所得毛皮性狀的相關數(shù)據(jù)(體重、毛纖維長、皮板長、皮板寬等)。采用SPSS 19.0統(tǒng)計分析軟件進行單因子組內(nèi)重復數(shù)等方差分析，對差異顯著數(shù)據(jù)的組間采用LSD多重方法進行比較顯著性分析。結果以平均值±標準誤表示。

2結果與分析

2.1FGF5-4基因擴增以獺兔基因組DNA為模板，通過自行設計的引物，在PCR反應條件下，特異地擴增出FGF5第4個外顯子基因，擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳(圖1)，擴增條帶長度在300 bp左右。

2.2FGF5-4基因片段序列及峰圖分析PCR產(chǎn)物直接測序得到300 bp左右的FGF5-4片段。測序結果使用Bioedit軟件的Clustal x功能進行排定DNA序列，再經(jīng)人工核對。測序所得序列，如圖2所示；測序所得峰圖，如圖3所示。

圖1　PCR產(chǎn)物電泳圖譜

圖2　FGF5-4基因序列

由圖2序列及圖3峰圖所示，在FGF5-4基因測序所得的有效序列當中，僅有一個單倍體型，且未見變異位點；FGF5-4基因片段的序列均無堿基插入和缺失。從以上序列及峰圖可以看出，在FGF5-4基因片段上，所測獺兔群的分化程度很低。

2.3毛皮性狀的相關分析詳見表2。

表2　獺兔毛皮性狀方差分析表

注：同列數(shù)據(jù)不同大寫字母肩標表示差異顯著(P<0.05)；肩標相同字母或無字母標注表示差異不顯著(P>0.05)。

由表2可見，經(jīng)方差分析和多重比較，不同組間獺兔的毛纖維長，差異不顯著(P>0.05)；皮板長度僅第1組(體重3.696～3.386 kg)顯著高于(P<0.05)第4組(2.765～2.456 kg)，與其他2組相比，則差異不顯著(P>0.05)；皮板寬和皮板面積則第1組(體重3.696～3.386 kg)和第2組(體重3.385～3.076 kg)明顯高于第3組(體重3.075～2.766 kg)和第4組(體重2.765～2.456 kg)，差異顯著(P<0.05)。

2.4FGF5基因CDS序列與其他物種CDS序列比較詳見圖4。

圖3　FGF5-4基因測序峰圖

圖4　獺兔與其他物種FGF5氨基酸序列對比結果(前80位)

通過NCBI的GenBank中查找兔、狗、家貓、馬、綿羊、牛、山羊、雙峰駝、水牛、豬等物種CDS編碼區(qū)序列所編碼的氨基酸序列，分析對比不同物種的氨基酸序列發(fā)現(xiàn)，兔、狗、家貓、馬、綿羊、牛、山羊、雙峰駝、水牛、豬等物種CDS編碼區(qū)序列所編碼的氨基酸長度大都在270個左右，且不同物種氨基酸序列的差異主要集中在第10～80個氨基酸。在其他位點的對比中，不同物種間的氨基酸序列差異較小。經(jīng)過相關軟件分析，獺兔同其他物種間CDS編碼區(qū)所編碼的氨基酸相似程度超過88%。由此可見，F(xiàn)GF5基因在不同物種間的變異程度不大。

3小結與討論

由圖2基因序列及圖3測序峰圖可見，在FGF5-4基因測序所得的有效序列中，僅有一個單倍體型，且未見變異位點；FGF5-4基因片段的序列均無堿基插入和缺失。分析序列及峰圖可以看出，在FGF5-4基因片段上，所測獺兔群的分化程度很低，說明FGF5-4基因在所測獺兔群中相對保守。

結合研究分析獺兔毛皮性狀的相關數(shù)據(jù)，可以看出在選擇的獺兔群中，按照體重不同分成的4組中，毛長組間差異不顯著(P>0.05)；皮板長僅第1組同第4組差異顯著(P<0.05)，皮板寬則第1組和第2組顯著高于第3組和第4組(P<0.05)。綜上所述，在所選獺兔群體中，其毛皮性狀的差異性不顯著，毛皮性狀的分化程度不大，從而佐證了該群體FGF5-4基因片段的保守性。

根據(jù)獺兔FGF5基因CDS序列與其他物種CDS序列的比較，可以看出FGF5基因在物種間的差異性較小，表明在物種進化過程中FGF5基因相對保守。

據(jù)相關學者對FGF5基因的研究發(fā)現(xiàn)，有關獺兔FGF5基因保守性的報道較少。據(jù)李春笑等(2007)[13]研究表明，加利福尼亞兔的FGF5基因外顯子1和外顯子3存在SNP多態(tài)性，且發(fā)現(xiàn)突變位點與加利福尼亞兔的毛皮性狀有極顯著的相關性；馮凱等(2012)[14]和夏圣榮等(2010)[15]研究了5個家兔FGF5基因的遺傳多態(tài)性，在FGF5-1A中發(fā)現(xiàn)了2個等位基因，3種基因型，在FGF5-3B中發(fā)現(xiàn)了2個等位基因，2種基因型。高愛琴等(2006)[16]對不同綿羊和山羊品種的FGF5基因外顯子1和3的多態(tài)性進行了研究，發(fā)現(xiàn)綿羊和山羊 FGF5 基因外顯子1均存在2處單堿基變異，而外顯子3并沒有發(fā)現(xiàn)多態(tài)。在本研究中，筆者所選的是FGF5的第4個外顯子，且在所測獺兔群的序列中尚未發(fā)現(xiàn)突變位點，說明FGF5-4基因片段未見多態(tài)性。

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中圖分類號：S829.12

文獻標識碼：A

文章編號：1005-7307(2016)02-0004-004

作者簡介：劉健(1990-)，男，山東省濰坊市人，碩士研究生，主要研究方向為動物遺傳育種與繁殖。E-mail：liujian1990@zju.edu.cn.*通訊作者：張金枝(1966-)，E-mail: zhangjzs@zju.edu.cn

基金項目：寧波市科技局農(nóng)村科技創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)資助項目(201201C8000037).

收稿日期：2016-01-26