范榮莉，蔣　濤，艾　鳳，方　旭，王俊程，龔正清，車傳燕

(安徽科技學院　動物科學學院，安徽　鳳陽　233100)

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利巴韋林對小鼠生長發(fā)育和小腸組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

范榮莉，蔣濤，艾鳳，方旭，王俊程，龔正清，車傳燕*

(安徽科技學院動物科學學院，安徽鳳陽233100)

摘要：目的：研究不同劑量的利巴韋林對小鼠生長發(fā)育和小腸組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響。方法：30只1月齡小鼠隨機分為3組，對照組灌胃生理鹽水，低、高劑量利巴韋林組分別按照5mg/kg、10mg/kg體重灌胃藥物，連續(xù)用藥14d，每周清晨稱重，采集血液和組織樣品。結(jié)果：利巴韋林能夠提高小鼠日增重，且低劑量用藥7d的促生長效果明顯(P<0.05)。給藥14d后，低劑量組脾臟指數(shù)比高劑量組顯著增加 (P<0.05)。與對照組相比，高、低劑量利巴韋林組紅細胞數(shù)下降，白細胞總數(shù)增加，中性粒細胞數(shù)量極顯著降低(P<0.01)，淋巴細胞數(shù)量極顯著升高(P<0.01) ，低劑量組白細胞總數(shù)極顯著增加(P<0.01)。高劑量利巴韋林破壞了小腸黏膜上皮形態(tài)結(jié)構(gòu)，抑制了小腸絨毛發(fā)育；而低劑量利巴韋林能夠提高小腸絨毛長度、隱窩深度、十二指腸絨毛長度和隱窩深度比值，增強小腸功能的發(fā)揮。結(jié)論：利巴韋林具有促進機體生長發(fā)育和調(diào)節(jié)免疫功能的作用，但隨著添加劑量的增加，利巴韋林的促生長和免疫增強效果減弱。在臨床應用上，應注意根據(jù)不同的個體來確定利巴韋林的適宜添加劑量和合理應用時間。

關鍵詞：利巴韋林；生長發(fā)育；血液生理指標 ；組織形態(tài)

利巴韋林為鳥苷類化合物，對RNA病毒和DNA病毒具有廣譜抗病毒活性，臨床上常用于治療甲乙型流感病毒、丙型肝炎、輪狀病毒、乙腦病毒、皰疹病毒、流行性出血熱等[1-3]。在畜禽生產(chǎn)中利巴韋林曾被用于治療豬流行性感冒、豬傳染性胃腸炎、雞痘等病毒性傳染病[4]。近年來，隨著畜禽養(yǎng)殖規(guī)模擴大，多種因素造成的病毒性傳染病發(fā)病率增加，致使利巴韋林、金剛烷胺等違禁的抗病毒藥物在畜禽生產(chǎn)中仍有違規(guī)使用[5]。此外，調(diào)查顯示利巴韋林在嬰幼兒病毒性疾病的治療中應用較多[6]，但利巴韋林的不合理應用造成人類和畜禽中毒事件仍時有發(fā)生[7]。因此，利巴韋林的合理應用是有效發(fā)揮其抗病毒功效的重要前提。

大量研究表明利巴韋林長期或過量使用可引起血液中白細胞減少和貧血等不良反應[8]，但利巴韋林對機體生長發(fā)育和小腸組織形態(tài)影響的報道較少。因此，本研究擬通過研究利巴韋林對小鼠日增重、器官指數(shù)、血液生理指標以及小腸組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響，系統(tǒng)地分析口服不同劑量的利巴韋林對機體健康狀況的影響，為利巴韋林在臨床上的合理應用提供科研理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料

30只1月齡清潔級小鼠,購自南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場，飼養(yǎng)于動物科學學院動物房；利巴韋林粉(購自濟南新瑞宏經(jīng)貿(mào)有限公司)，瑞氏染色液(購自北京雷根生物技術(shù)有限公司)，肝素鈉、枸櫞酸鈉、甲基紅、結(jié)晶紫、多聚甲醛等生化試劑(均購自安徽博美特生物科技有限公司)；切片機(德國Leica RM2235)，顯微成像系統(tǒng)(OLYMPUS-CH30)，電子天平(YP-600)，電子分析天平(FA-1004N)，恒溫箱(GHP-9050)，烘干箱(CX-GF-b)，微量移液器(Eppendorf)等。

1.2試驗設計

1.2.1動物飼養(yǎng)小鼠適應性飼養(yǎng)7d后，根據(jù)性別和體重隨機分為三組，每組10只。空白對照組按照0.5mL/只灌服生理鹽水，高劑量、低劑量利巴韋林組的用藥劑量分別為5mg/kg、10mg/kg體重。連續(xù)灌胃14d，于用藥后第7d、14d清晨進行空腹稱重。

1.2.2樣品的采集及處理小鼠稱重后，用乙醚麻醉處死，采集血液樣品，解剖分離組織器官并稱重，取約1.5cm的十二指腸、空腸，快速放入4%多聚甲醛中，固定24h后修塊，用于制作石蠟切片。

1.3測定項目及分析方法

1.3.1血液生理指標檢測采用血細胞計數(shù)板法測定肝素鈉抗凝的血液中紅細胞總數(shù)和白細胞總數(shù)，白細胞分類計數(shù)參照已有文獻進行[9]。每個樣品制作5張血涂片，每張血涂片統(tǒng)計100個白細胞中各類白細胞的數(shù)量。

1.3.2蘇木精-伊紅(H.E)染色組織固定24h后，梯度酒精脫水，二甲苯透明，浸蠟，包埋，修塊，制作厚度為6μm的石蠟組織切片；37℃烤片24h后，二甲苯脫蠟，梯度酒精脫二甲苯至水，經(jīng)蘇木精和伊紅染色，梯度酒精脫水，二甲苯透明，封片。采用Olympus生物顯微鏡觀察小腸組織形態(tài)結(jié)構(gòu)并拍照，每個組織樣品制作五張不連續(xù)切片，每張切片選取5個視野，每個視野選兩根絨毛和隱窩進行測量。

1.3.3數(shù)據(jù)處理與分析數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±SD表示，采用SPSS16.0軟件進行組間差異顯著性比較分析，P<0.01表示差異極顯著，P<0.05表示差異顯著。

2結(jié)果與分析

2.1利巴韋林對小鼠日增重的影響

給藥7d后，與空白對照組相比，低劑量利巴韋林組小鼠的日增重極顯著增加(P<0.01)，而高劑量組小鼠日增重顯著增加(P<0.05)，兩個用藥組之間無明顯差異；給藥14d后，各組間差異不顯著(表1)。

表1　小鼠的日增重變化 ±SD)

注:同列不同大、小寫字母分別表示在0.01和0.05水平上差異顯著,下同。

Note：The different capital and small letters in a column mean significant difference at levels of 0.01 and 0.05, respectively. The same as follow.

2.2利巴韋林對小鼠器官指數(shù)的影響

由表2可見，高劑量利巴韋林組小鼠脾臟、小腸和胸腺指數(shù)最低，且脾臟指數(shù)顯著低于低劑量組(P<0.05)。肝臟、腎臟指數(shù)在各組間無明顯差異。

表2　給藥14d后小鼠的器官指數(shù)變化±SD)

2.3利巴韋林對血液生理指標的影響

與對照組相比，高、低劑量利巴韋林組紅細胞總數(shù)降低，白細胞總數(shù)升高，其中低劑量組白細胞總數(shù)極顯著增加(P<0.01)，高、低劑量組嗜中性粒細胞數(shù)量極顯著降低(P<0.01)，淋巴細胞數(shù)量極顯著升高(P<0.01)。嗜堿性粒細胞、嗜酸性粒細胞和單核細胞數(shù)量在各組間的比較差異均未達到統(tǒng)計學意義(見表3)。

表3　給藥14d后小鼠血液部分生理指標的變化±SD)

注:同行不同大、小寫字母分別表示在0.01和0.05水平上差異顯著,下同。

Note：The different capital and small letters in a same line mean significant difference at levels of 0.01 and 0.05, respectively.

2.4利巴韋林對小腸組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

H.E染色結(jié)果如圖1所示，低劑量利巴韋林組小腸絨毛黏膜上皮組織形態(tài)正常，而高劑量組小腸絨毛頂部出現(xiàn)部分粘膜上皮脫落的現(xiàn)象(如圖1 E 中箭頭所示)，且腸上皮細胞之間排列不緊密，造成小腸黏膜組織結(jié)構(gòu)的不完整。

圖1　小腸組織形態(tài)結(jié)構(gòu)

由表4可見，低劑量組小腸絨毛長度、隱窩深度、以及十二指腸的絨毛長度和隱窩深度比值均高于其他兩組。高劑量組小腸絨毛長度、絨毛長度與隱窩深度比值均最低。

表4　利巴韋林對小鼠小腸絨毛長度和隱窩深度的影響

3討論

3.1利巴韋林對小鼠生長發(fā)育的影響

利巴韋林作為常用的抗病毒藥物在臨床上被廣泛使用。本研究發(fā)現(xiàn)利巴韋林用藥7d后能夠顯著促進小鼠生長發(fā)育，且低劑量的利巴韋林在用藥一周內(nèi)促生長效果最好。用藥14d后，高、低兩種劑量的利巴韋林的促生長效果不明顯，這可能是由于長時間使用利巴韋林延遲了紅細胞生長而導致貧血[10]，因此臨床上建議給予小劑量治療，且用藥時間為1周為宜。

3.2利巴韋林對小鼠免疫器官指數(shù)的影響

器官指數(shù)是衡量器官生物學功能的重要特征指標之一。總體來看，用藥14d后，高劑量的利巴韋林對小鼠免疫器官和小腸器官指數(shù)的影響表現(xiàn)為降低作用，其中對脾臟的影響達到顯著差異水平，這可能是由于利巴韋林用藥劑量較高時會抑制機體免疫功能的正常發(fā)揮，且破壞小腸形態(tài)結(jié)構(gòu)，這與以往報道的高濃度利巴韋林對淋巴細胞有抗增殖作用相一致[11]。低劑量利巴韋林能夠顯著提高脾臟指數(shù)，這表明低濃度的利巴韋林可能主要通過刺激脾臟淋巴細胞增殖來增強機體的抗病毒作用。

3.3利巴韋林對小鼠血液生理指標的影響

紅細胞具有運輸氧和二氧化碳，對酸、堿物質(zhì)起到緩沖作用[12]，調(diào)控體液免疫和細胞免疫功能[13]。研究發(fā)現(xiàn)紅細胞數(shù)隨著利巴韋林注射濃度增高而降低[14]，這在本研究中也被證實，即利巴韋林組紅細胞數(shù)量均有一定程度降低，其原因可能是由于利巴韋林過早清除紅細胞膜蛋白，使紅細胞膜對氧化作用的易感性增強有關[15-16]，另一方面可能由于紅細胞表面存在利巴韋林發(fā)揮抗病毒作用的核苷載體，造成利巴韋林在紅細胞內(nèi)蓄積，破壞紅細胞[17]。

白細胞具有滲出、趨化和吞噬等特性，可保護機體不受外來微生物侵襲，其中淋巴細胞是機體免疫應答功能的重要細胞成分，中性粒細胞在血液的非特異性細胞免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。本研究表明按照5mg/kg、10mg/kg體重給小鼠灌胃利巴韋林，均能夠增加白細胞總數(shù)和淋巴細胞數(shù)量，降低嗜中性粒細胞數(shù)量，表明利巴韋林可能主要通過促進淋巴細胞增殖來調(diào)節(jié)機體的免疫功能，但抑制非特異性細胞免疫功能的發(fā)揮。大量研究證實利巴韋林長期或過量使用可引起白細胞減少和貧血等不良反應[8,14,18]，這與本試驗結(jié)果不完全一致，其原因可能是由于利巴韋林的用藥劑量、用藥途徑以及受試動物所處的生理狀態(tài)不同而引起。于宏等研究證實隨著利巴韋林用藥濃度的增加，白細胞總數(shù)和淋巴細胞數(shù)量逐漸下降[18]，這與本試驗結(jié)果相符，即添加低濃度的利巴韋林對免疫細胞的增強效果顯著。

3.4利巴韋林對小鼠小腸組織形態(tài)的影響

小腸組織結(jié)構(gòu)的完整性和功能的正常發(fā)揮對營養(yǎng)物質(zhì)的消化、吸收起到重要作用。絨毛長度和黏膜厚度是小腸消化吸收功能的重要決定因子。本研究發(fā)現(xiàn)，低劑量(5mg/kg)利巴韋林對小腸上皮形態(tài)結(jié)構(gòu)無明顯損傷作用，而高劑量(10mg/kg)利巴韋林使小腸絨毛頂端上皮出現(xiàn)脫落，破壞了黏膜上皮形態(tài)結(jié)構(gòu)的完整性，這一結(jié)果在不同劑量的利巴韋林對仔豬胃腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)影響的報道中也得到證實[18]。

隱窩深度能夠反映小腸上皮細胞的生成率。絨毛長度和隱窩深度的比值是小腸功能狀態(tài)的綜合反映。低劑量利巴韋林能夠提高小腸絨毛長度、隱窩深度，以及十二指腸絨毛長度和隱窩深度的比值，而高劑量利巴韋林則對小腸絨毛的發(fā)育起到一定抑制作用。低劑量利巴韋林可能通過促進小腸組織的生長發(fā)育，增強小腸對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收功能，進而促進機體的生長發(fā)育。

4結(jié)論

利巴韋林具有促進機體生長發(fā)育和調(diào)節(jié)免疫功能的作用，但其作用效果與添加劑量呈現(xiàn)一定的依賴關系。低濃度利巴韋林的促生長和免疫增強效果較好，對小腸組織形態(tài)沒有破壞作用，而且能夠增加小腸絨毛長度和隱窩深度比值，促進小腸對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收功能。在臨床應用上，應注意根據(jù)不同的個體來確定利巴韋林的適宜添加劑量和合理應用時間。

參考文獻：

[1]陳秀秀，周紅霞，亓文寶，等．甘草酸聯(lián)合利巴韋林體內(nèi)抗甲型H1N1流感病毒作用[J]．藥學學報，2015，50(8)：966-972．

[2]曾艷麗，何佳，寧會彬，等．白細胞介素-28B rs12978960多態(tài)性與1b 型慢性丙型肝炎復發(fā)者聚乙二醇干擾素聯(lián)合利巴韋林再治療療效的相關性研究[J]．中華傳染病雜志，2015(7)：415-419．

[3]牛辛元．利巴韋林治療嬰幼兒輪狀病毒腸炎的療效與安全性[J]．中國醫(yī)院用藥評價與分析，2015(5)：670-670, 671．

[4]杜志明，李志剛，呂洪，等．抗病毒藥物在獸醫(yī)臨床上的應用[J]．動物保健，2005(8)：35-36．

[5]云環(huán)，崔鳳云，嚴華，等．超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定雞肉中的利巴韋林和金剛烷胺[J]．色譜，2013，31(8)：724-728．

[6]黃荊南．利巴韋林在兒童患者中的使用情況分析[J]．河南醫(yī)學研究，2015(9)：78-79．

[7]田彩鎖，孫倩，楊蓮英，等．利巴韋林臨床應用中的不良反應[J]．中國綜合臨床，2002，18(6)：487-488．

[8]ISHIHARA T, KANEKO K, ISHIHARA T, et al. Development of biodegradable nanoparticles for liver-specific ribavirin delivery[J]. Journal of Pharmaceutical Sciences, 2014, 103(12): 4005-4011.

[9]王趁芳,高志華,喬恩美，等.低聚殼聚糖對肉雞血細胞的影響[J].安徽科技學院學報,2013,27(4):10-15．

[10]DALLA-COSTA L M, COELHO J M, SOUZA H A, et al. Outbreak of carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii producing the OXA-23 enzyme in Curitiba, Brazil[J]. Journal of Clinical Microbiology, 2003, 41(7): 3403-3406.

[11]程勇前，趙平，王曉峰，等．利巴韋林抗HCV作用機制研究進展[J]．國外醫(yī)學:流行病學傳染病學分冊，2003，30(3)：156-160．

[12]王俊東，劉宗平．獸醫(yī)臨床診斷學[M]．北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2004．

[13]余飛，袁聰俐，楊志彪，等．紅細胞免疫研究進展[J]．動物醫(yī)學進展，2007，28(6)：82-85．

[14]吳茅，王建富，周建飛，等．不同濃度利巴韋林對家兔外周血細胞的影響[J]．浙江醫(yī)學，2008，30(5)：456-458, 462．

[15]DE FRANCESCHI L, FATTOVICH G, TURRINI F, et al. Hemolytic anemia induced by ribavirin therapy in patients with chronic hepatitis C virus infection: role of membrane oxidative damage[J]. Hepatology (Baltimore, Md.), 2000, 31(4): 997-1004.

[16]VAN VLIERBERGH H, DELANGHE J R, DE VOS M, et al. Factors influencing ribavirin-induced hemolysis[J]. Journal of Hepatology, 2001, 34(6): 911-916.

[17]KHAKOO S, GLUE P, GRELLIER L, et al. Ribavirin and interferon alfa-2b in chronic hepatitis C: assessment of possible pharmacokinetic and pharmacodynamic interactions[J]. British Journal of Clinical Pharmacology, 1998, 46(6): 563-570.

[18]于宏，孫洪磊，楊鳳，等．仔豬口服利巴韋林毒性實驗研究[J]．中國農(nóng)業(yè)科學，2010，43(13)：2806-2812．

(責任編輯：馬世堂)

Effects of Ribavirin on Growing Development and Small Intestine Morphology and Structure in Mice

FAN Rong-li, JIANG Tao, AI Feng, FANG Xu, WANG Jun-cheng, GONG Zheng-qing, CHE Chuan-yan*

(College of Animal Science，Anhui Science and Technology University，F(xiàn)engyang 233100，China)

Abstract：Objective: To investigate the effect of different doses of ribavirin on growth and development and the small intestinal morphology in mice. Methods: Thirty mice at one month old were randomly divided into three groups, mice in control group were taken normal saline by intragastric administration, mice in low-dose and high-dose ribavirin group were either taken ribavirin according to 5mg/kg、10mg/kg body weight. Ribavirin was administered once daily for 14 consecutive days. We weighed mice every week morning, collected blood and tissue samples. Results: Ribavirin can improve the daily weight gain in mice, and low-dose ribavirin showed significant effect on growth at 7 old day (P<0.05). After having taken medicine for 14 days, spleen index in low -dose ribavirin group was significantly higher than that in high-dose group (P<0.05). In compared with control group, the total number of red blood cell was decreased, white blood cell number was increased, heterophil granulocyte number was reduced significantly (P<0.01), lymphocyte was highly significant increased (P<0.01) in high-dose and low-dose ribavirin group; the total number of white blood cell in low-dose group was very significantly increase(P<0.01). High-dose ribavirin damaged the integrity of morphology and structure in small intestinal mucosa epithelium, inhibited the development of small intestinal villi. Low-dose ribavirin could enhance the villus length, crypt depth, and villus length to crypt depth ratio, so that to deliver the function of small intestine. Conclusions: Ribavirin showed effects of improving growth and development, enhancing immune function. However, the effects of ribavirin on improving growth performance and immunoenhancement were attenuated along with dose increase. At clinical applications, we should take notice of confirming appropriate dosage and reasonable application time in the light of different individual.

Key words:Ribavirin; Growth and development; Blood physiological index; Histomorphology

中圖分類號：S852.16

文獻標識碼：A

文章編號：1673-8772(2016)01-0019-06

作者簡介：范榮莉(1992-)，女，安徽省淮北市人，在讀本科生，主要從事腸道微生態(tài)營養(yǎng)與黏膜免疫研究。*通訊作者：車傳燕，講師，E-mail:ccyan1980@163.com。

基金項目：安徽省級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目(AH201410879031)；國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目(201310879011)。

收稿日期：2015-11-06