PCR鑒定麻類纖維基因組DNA提取方法

保琦蓓，尤建武，錢　丹，任清慶，傅科杰

（1.寧波出入境檢驗檢疫局紡織品檢測中心，浙江寧波　315012 2.寧波檢驗檢疫科學(xué)技術(shù)研究院，浙江寧波　315012）

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PCR鑒定麻類纖維基因組DNA提取方法

保琦蓓1,2，尤建武1，錢丹1，任清慶1，傅科杰1,2

（1.寧波出入境檢驗檢疫局紡織品檢測中心，浙江寧波315012 2.寧波檢驗檢疫科學(xué)技術(shù)研究院，浙江寧波315012）

摘要：以漢麻原麻韌皮纖維與漢麻纖維兩組特殊樣品為材料，比較了傳統(tǒng)的CTAB法、試劑盒粗提法及磁珠純化精提法DNA提取方法對提取此類樣品的適宜性。結(jié)果表明，采用試劑盒粗提法可從漢麻原麻纖維中提取高品質(zhì)的可用于下一步PCR檢測的DNA樣本，而麻類纖維的處理工藝對其DNA的影響很大，隨著麻類纖維從原麻被加工為精干麻、紗線與織物的過程中，已很難提出高品質(zhì)DNA樣品，雖然存在一定量的DNA，但通過完整性檢測發(fā)現(xiàn)這類DNA樣品已無法滿足下一步的PCR鑒定檢測的要求。

關(guān)鍵詞：麻類纖維；基因組DNA；提?。籔CR檢測

0　引言

在纖維檢測領(lǐng)域，DNA檢測技術(shù)在天然動物纖維鑒別中已得到廣泛應(yīng)用，研究人員已完成了傳統(tǒng)的光學(xué)投影儀法。燃燒法與化學(xué)溶解法無法完成羊絨與羊毛纖維的鑒別，以及對羊毛、羊絨、駱駝毛與牦牛毛之間快速簡便的纖維定性分析[1]。目前國外對羊毛羊絨纖維的分析已從定性分析發(fā)展到兩組分混紡纖維的定量分析，可用于有實驗條件的紡織檢測機構(gòu)進(jìn)行相應(yīng)纖維成分的輔助檢測[2]，而國內(nèi)將DNA檢測技術(shù)應(yīng)用于天然植物纖維的鑒定方面的研究較少，且對麻類植物的分子生物學(xué)研究主要集中在改良遺傳育種方面。國外采用分子生物學(xué)方法對麻類纖維進(jìn)行鑒定的相關(guān)方面研究目前主要集中在公安刑偵與考古學(xué)中的纖維鑒定應(yīng)用方面。

研究和開發(fā)麻類纖維的DNA檢測技術(shù)，關(guān)鍵技術(shù)難點在于DNA的提取。一般新鮮葉片提取的DNA品質(zhì)最高，可基本滿足各種測試需求。而麻類植物韌皮纖維中含有大量的多糖、酚類等次生代謝物質(zhì)，細(xì)胞壁厚破壁較難，尤其是多糖易與DNA結(jié)合形成極難溶解的黏稠狀物質(zhì)，并抑制PCR反應(yīng)過程中Taq DNA酶的活性，使擴增的條帶模糊甚至消失，嚴(yán)重影響PCR的反應(yīng)效果[3]。大多數(shù)的試驗都采用麻類植物幼嫩葉片為材料進(jìn)行提取，但作為紡織材料的韌皮纖維作物，經(jīng)過收獲、剝制、干燥等過程得到原麻，再經(jīng)脫膠得到精干麻，得到的麻纖維可用于紡紗與織造。若對各種麻類進(jìn)行DNA檢測，必須首先考慮對纖維中的DNA進(jìn)行提取。美國研究者M(jìn)ignon Dunbarden利用PCR片段中的堿基對序列分析或限制性內(nèi)切酶分析成功鑒別了麻質(zhì)繩索中的漢麻、劍麻與亞麻纖維的成分，擴增后的PCR片段可達(dá)到771堿基對長度[4]。Terence M.Murphya等人利用DNA技術(shù)從以色列汲淪谷的猶太人墓穴中發(fā)現(xiàn)的麻類織物中鑒定出其成分主要為亞麻，所有樣品中均存在少量或微量的漢麻DNA分子，此研究僅利用短片段物種特異性PCR來進(jìn)行鑒定[5]。候思名等通過優(yōu)化后的CTAB法，在提取的過程中通過抗氧化和去除多糖的方法成功提取了苧麻幼嫩葉片中的DNA[6]。而陳平等以常溫干燥保存一年和六年的陳年苧麻原麻為原材料，也采用改進(jìn)的CTAB法提取了苧麻原麻中的DNA，得到的DNA約為20 kb[3]。裴黎采用改良高鹽低pH方法方法成功提取了陳舊漢麻干葉標(biāo)本及漢麻樹脂中的基因組DNA，并成功提取了一份22年陳舊漢麻樹脂的基因組DNA，使其可以用于法庭科學(xué)中陳舊漢麻基因組DNA的提取[7]。

作為紡織材料的韌皮纖維作物，麻纖維也會根據(jù)生產(chǎn)的需要可能會存放相當(dāng)長一段時間，再經(jīng)過收獲、剝制、干燥等過程得到原麻，原麻經(jīng)脫膠后得到精干麻，再用于紡紗與織造。要對各種麻類進(jìn)行DNA檢測，首要問題也是纖維中的DNA提取。本研究中選取了兩組特殊樣品進(jìn)行麻類纖維基因組提取方法的優(yōu)化，希望找到適合麻纖維DNA提取的方法。

1　試驗

1.1試驗材料

試驗采用的樣品類型分為兩組，第一組為不同存放時間的漢麻原麻韌皮纖維，第二組為根據(jù)漢麻纖維的生產(chǎn)工藝流程處于各個生產(chǎn)階段的纖維產(chǎn)品。同時選擇棉花樣品作為對照，選擇一種存放期約為1年的苧麻纖維來驗證優(yōu)化后的提取方法。樣品具體信息見表1。

1.2提取試驗方法

采用傳統(tǒng)的CTAB法與試劑盒法提取法兩種方法進(jìn)行提取方法的優(yōu)化，其中試劑盒提取法又分別考察了粗提方法與后續(xù)的磁珠純化精提方法對提取DNA質(zhì)量的影響。試驗開始前均先取一定量的樣本于離心管中，加入無菌水在4℃下浸泡2 h。

表1　樣品信息表

（1）CTAB法

分別選取樣品1～8號約1.0 g，在研缽中加入液氮預(yù)冷，將葉片放入液氮中研磨均勻，直至全部研磨至粉末，轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管中，加入600 μL 65℃預(yù)熱的CTAB溶液（用前加入2%的巰基乙醇）。將裝有CTAB和樣品的EP管置入65℃水浴，約1 h。冷卻后，加入600 μL的酚：氯仿：異戊醇(25:24∶1= 300∶288∶12)，混勻，12 000 rpm，離心15 min。吸取上清液，置入空EP管，加入600 μL氯仿：異戊醇（24∶1=576∶24），12 000 rpm。離心15 min，吸取上清液轉(zhuǎn)入空離心管中，加入1/3體積NaAc（3moL/L），加入1 mL-20℃預(yù)冷的無水乙醇，混勻后置于-20℃下3～4 h，然后于12 000 rpm離心10 min，棄去上清液，向離心管中加入75%的乙醇洗滌2～3次，置于吸水紙上倒置晾干。使用時加入ddH2O（10～20 μL）溶解備用。

（2）試劑盒提取方法

a.組織破碎：浸泡后的樣本在加液氮的條件下在研缽中搗成粉末，并將粉末裝入2 mL離心管中（研磨時應(yīng)間隔加入液氮以防止組織融化）。加入1 mL Plant DNA zol（貨號116901）試劑盒試劑，將離心管置入65℃水浴15 min。

b.DNA沉淀：加1mL氯仿，混合均勻。12000rpm,離心5 min。小心取上清（DNA在上層,試驗要求為純DNA），移入空的1.5 mL離心管中，加0.7體積的異丙醇，4℃下12 000rpm離心10 min，棄上清，12 000 rpm,離心5 min，棄上清。

c.DNA清洗：加入1 mL 75%乙醇至離心管中，顛倒數(shù)次以重懸DNA，直立離心管1 min至DNA團塊沉至管底，傾去或吸除洗滌液。細(xì)小的DNA沉淀團塊易在傾倒洗滌液時丟失，可室溫3 000 xg離心3～5 min，然后傾去或吸除洗滌液，重復(fù)清洗1次，最后簡短離心，用槍頭小心吸棄殘留液體。

d.DNA溶解：室溫靜置約10 min，使殘余乙醇揮發(fā)，注意不要完全晾干DNA，加入適量（100 μL）滅菌雙蒸水或TE緩沖液，使DNA沉淀溶解。若DNA溶液中存在不可溶雜質(zhì)，可于4℃12 000rpm，離心10 min去除雜質(zhì)，并在4℃或-20℃保存DNA溶液（此處得到的為粗提物產(chǎn)物）。

e.DNA純化：取50 μL的粗提DNA轉(zhuǎn)入新的1.5 mL離心管中，充分渦旋振蕩AMPure XP beads（貨號A63882），加入90 μL充分懸浮好的AMPure XP beads于上述離心管中，吸打或渦旋振蕩混勻，室溫放置5 min，然后將上述離心管放置于磁力架上至少2 min，棄上清，保持1.5 mL的離心管在磁力架上，加入200 μL新鮮配制的80%乙醇，室溫保持30 s，棄上清。重復(fù)上述2個步驟，室溫干燥10 min（磁珠出現(xiàn)裂痕即為干燥完全），加入52.5 μL的Re?suspension Buffer于上述離心管中，吸打或渦旋振蕩混勻，室溫保持2 min，離心管放置于磁力架上放置至少5 min，吸取50 μL的上清于空的1.5 mL離心管中，得到的產(chǎn)物為精提物產(chǎn)物。

1.3提取結(jié)果評價

各樣品DNA提取后，測定OD260與OD280值，計算DNA的產(chǎn)量，同時通過Qubit熒光計定量測定提取的DNA濃度，用1%濃度的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性，通過上述參數(shù)選擇最優(yōu)的提取方法，最后選擇符合質(zhì)量要求的DNA進(jìn)行PCR擴增試驗，驗證DNA的完整性。第1組引物組為漢麻的特征引物，其序列為上游引物5ˊ-ATC?GAAGAGCAGCAACAAGC-3ˊ，下游產(chǎn)物5ˊ-ATCGAAGAGCAGCAACAAGC-3ˊ；第2組引物組為苧麻的特征引物，其序列為上游引物5ˊ-TC?CAAGCATTTCCCGAACGA-3ˊ，下游產(chǎn)物5ˊ-GCCCGATCTTCCAGCTCTAC-3ˊ；第3組引物組為亞麻的特征引物，其序列為上游引物5ˊ-TCAT?CAACAGCGCATCTGGT-3ˊ，下游產(chǎn)物5ˊ-AGCCTTACAGCCACACACTC-3ˊ。對試劑盒方法的粗提法與精提法提取DNA樣品進(jìn)行擴增，對DNA樣品的質(zhì)量進(jìn)行進(jìn)一步評價。采用PCR擴增的反應(yīng)體系為25 μL PCR反應(yīng)體系包括麻類纖維樣品基因組DNA20 ng，2×Premix Taq緩沖液12.5 μL，5 μM上、下游引物各1 μL，Premix Taq DNA聚合酶(Code No.RR003Q)，余量為ddH2O。PCR的擴增程序：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，27個循環(huán)；72℃延伸10 min，10℃保存。

2　結(jié)果與討論

2.1不同提取方法下DNA產(chǎn)量、濃度與完整性

根據(jù)1.2的提取方法，對選取的樣品進(jìn)行的基因組DNA的提取，所測OD260/OD280值與濃度的數(shù)值結(jié)果見表2。從表2可以看出，無論是OD260/OD280值指標(biāo)還是提取的濃度大小，試劑盒的提取方法優(yōu)于傳統(tǒng)的CTAB法，特別是在提取DNA的濃度上，試劑盒法對較為新鮮的纖維樣品的提取濃度高出CTAB法10倍。由于精提法是DNA初提之后的進(jìn)一步提純，因此提取的DNA濃度有所降低，但是DNA的質(zhì)量需要通過電泳方法進(jìn)行進(jìn)一步確認(rèn)。

表2　不同提取方法下DNA的OD260/OD280值與濃度

為了考察試劑盒粗提法與精提法兩種處理方法提取的DNA的完整性，為進(jìn)一步評價提取效果提供依據(jù)，試驗中采用1%瓊脂凝膠電泳對提取的DNA進(jìn)行檢測。將提取的DNA樣品在冰上融化后，充分混勻并離心，取適量樣品進(jìn)行檢測，采用1%濃度的瓊脂糖凝膠在5 V/cm下移動30 min，得到的檢測結(jié)果見圖1。

圖1　DNA樣品的1%瓊脂凝膠電泳圖

由圖1可以看出，試劑盒粗提法與精提法提取DNA樣品的完整性并無太大區(qū)別，在提取的DNA濃度的量可供下一步試驗使用時，采用粗提方式提取的DNA樣品也能夠滿足下一步的檢測要求，可以節(jié)約大量的人力和物力。另外，從圖1中還可以看出，麻類的原麻纖維樣品（樣品1～樣品4）隨著存放時間的增加DNA在發(fā)生降解，一般存放超過1年以上對提取DNA的質(zhì)量影響最大，但即使存放時間在2年以上也可采用本試驗的方法提取出可用于PCR檢測的DNA樣品，但麻類纖維的處理工藝對麻類纖維（樣品5～樣品7）中DNA的影響很大，隨著麻類纖維從原麻被依次加工為精干麻、紗線與織物的過程中，幾乎很難提取出高品質(zhì)DNA樣品，雖然其中存在一定量的DNA，但通過完整性檢測發(fā)現(xiàn)，這類DNA樣品已無法滿足下一步PCR鑒定檢測的要求。

2.2提取DNA的PCR鑒定檢測

采用第1組引物組漢麻特征引物對粗提物與精提物的擴增檢測結(jié)果見圖2，條帶1～11為粗提物擴增結(jié)果，條帶12～22為精提物擴增結(jié)果。采用漢麻的特征是因為都能對不同存放時間的漢麻原麻纖維（樣品1～樣品4）進(jìn)行特異擴增，擴增后條帶為100～200 bp。此組引物并不能對（樣品5～樣品9）樣品進(jìn)行特異性擴增，可以用來鑒定漢麻纖維。

圖2　漢麻特征引物對粗提物與精提物擴增檢測結(jié)果

采用第2組引物組苧麻特征引物對粗提物與精提物的擴增檢測結(jié)果見圖3，條帶23～33為粗提物擴增結(jié)果。由圖3還可以看出，采用苧麻的特征條帶可以對存放時間約1年的苧麻纖維進(jìn)行擴增，條帶為200～300bp，采用此組苧麻的特征引物均不能對不同存放時間的漢麻原麻纖維（樣品1～樣品4）與其他漢麻產(chǎn)品（樣品4～樣品7）進(jìn)行特異擴增。

圖3　苧麻特征引物對粗提物與精提物擴增檢測結(jié)果

采用第3組引物組亞麻特征引物對粗提物與精提物的擴增檢測結(jié)果見圖4，條帶45～55為粗提物擴增結(jié)果，條帶56～66為精提物擴增結(jié)果。由圖4還可以看出，采用亞麻的特征條帶對所有樣品均不能擴增出亞麻的特征產(chǎn)物，與預(yù)期結(jié)果相一致。

圖4　亞麻特征引物對粗提物與精提物擴增檢測結(jié)果

3　結(jié)論

通過對各組特殊麻類纖維樣品的DNA提取方法進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)采用試劑盒提取方法比傳統(tǒng)CTAB法提取DNA的品質(zhì)高，且試劑盒粗提法與精提法提取DNA樣品的濃度和完整性并無太大區(qū)別。在提取DNA濃度的量可供下一步試驗使用時，采用粗提方式提取的DNA樣品也能夠滿足下一步的檢測要求，可以節(jié)約大量的人力和物力。研究發(fā)現(xiàn)，麻類的原麻纖維樣品隨著存放時間的增加DNA在發(fā)生降解，一般存放超過1年以上對提取DNA的質(zhì)量影響最大，但即使存放時間在2年以上也能采用本試驗的方法提取出能用于PCR檢測的DNA樣品。然而麻類纖維的處理工藝對麻類纖維中DNA的影響很大，隨著麻類纖維從原麻被依次加工成精干麻、紗線與織物的過程中，幾乎很難提出高品質(zhì)的DNA樣品。雖然存在一定量的DNA，但通過完整性檢測發(fā)現(xiàn)這類DNA樣品已無法滿足下一步的PCR鑒定檢測的要求。

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《紡織檢測與標(biāo)準(zhǔn)》雜志專家委員會會議順利召開

2016年1月5日下午，《紡織檢測與標(biāo)準(zhǔn)》雜志專家研討會在上海市紡織科學(xué)研究院順利舉行，來自于檢測標(biāo)準(zhǔn)領(lǐng)域的各位大咖級專家委員會成員悉數(shù)到場，編輯部全體成員享用了一場行業(yè)領(lǐng)域的盛宴。

首先，編輯部對于雜志的創(chuàng)刊背景和創(chuàng)刊設(shè)想進(jìn)行了詳細(xì)的闡述，并對雜志的具體欄目做了介紹。隨后，專家們對雜志未來的發(fā)展方向、欄目內(nèi)容的設(shè)定、雜志平臺的運行提出了寶貴的意見和建議。其中主任委員、中國工程院院士俞建勇對于雜志的創(chuàng)辦進(jìn)行了充分的肯定，并強調(diào)稱，在紡織服裝業(yè)中檢測標(biāo)準(zhǔn)有著關(guān)鍵的作用，隨著紡織行業(yè)的多元化、綠色生態(tài)方面的發(fā)展，標(biāo)準(zhǔn)檢測方面也需要實時更新，以順應(yīng)時代的發(fā)展，希望雜志能夠在國際化、市場化、產(chǎn)業(yè)升級、生態(tài)性及技術(shù)升級方面能夠起到引領(lǐng)作用，雜志整體內(nèi)容呈現(xiàn)全面的基礎(chǔ)上，努力形成雜志專業(yè)特色。

解德誠院長總結(jié)時表示，自雜志創(chuàng)刊伊始即對其傾注殷切希望，目前在紡織制造工業(yè)加工總量穩(wěn)定的大勢下，若能把標(biāo)準(zhǔn)、檢測方法與市場需求有效地結(jié)合，就會看到一個巨大的市場。同時希望《紡織檢測與標(biāo)準(zhǔn)》雜志越辦越好，成為標(biāo)準(zhǔn)檢測領(lǐng)域內(nèi)獲取信息的重要渠道以及專業(yè)人士經(jīng)驗共享的重要載體。

檢測技術(shù)

Optimized method of extracting genomic DNA in hemp and ramie bast fiber for PCR detecting

Bao Qi-bei1,2，You Jian-wu1，Qian Dan1，Ren Qing-qing1，F(xiàn)u Ke-jie1,2
（1.Ningbo Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Textile testing center,Zhejiang 315012,China; 2.Ningbo Academy of Science & Technology for Inspection & Quarantine,Zhejiang 315012,China）

Abstract:Two special sample groups including hemp bast fibers and hemp fiber were used as material,the effects of traditional CTAB,kit crude extraction and beads purification DNA extraction on extraction were compared.The results showed that the extracted DNA samples by kit crude extraction from hemp bast fiber could be used directly for PCR detecting.The treatment process of hemp fiber greatly impact the DNA quality in the fiber.With hemp fiber from raw jute to yarn and fabric,it was difficult to extract high-quality DNA sample.Although a certain amount of DNA can be extracted in these samples,the DNA sample could not be directly used for PCR detecting.

Key words:bast fiber，genomic DNA，extraction，PCR detecting

作者簡介：保琦蓓（1982-），女，博士，工程師，E-mail：baoqibei@126.com，主要研究方向為生態(tài)紡織品檢測與研究。

項目基金：國家質(zhì)檢總局科技計劃項目（2014IK178），浙江省自然科學(xué)基金（LQ13B070003）

收稿日期：2015-11-01

中圖分類號：TS107

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1001-7046（2016）01-0007-05