葉攀驊，王 洋，劉可慧，周振明,3，陳孟林,3，劉 華，蘇銀萍，于方明,3*

(1 廣西師范大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院，廣西桂林 541004；2 桂林電子科技大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，廣西桂林 541004；3 珍稀瀕危動(dòng)植物生態(tài)與環(huán)境保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西桂林 541004)

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改良劑對(duì)錳超富集植物短毛蓼錳吸收及抗氧化酶系統(tǒng)的影響①

葉攀驊1，王 洋1，劉可慧2，周振明1,3，陳孟林1,3，劉 華1，蘇銀萍1，于方明1,3*

(1 廣西師范大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院，廣西桂林 541004；2 桂林電子科技大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，廣西桂林 541004；3 珍稀瀕危動(dòng)植物生態(tài)與環(huán)境保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西桂林 541004)

摘 要：為了探究改良劑與超富集植物聯(lián)合修復(fù)錳(Mn)污染土壤，采用溫室土培的方法，研究了Mn污染土壤分別添加25、50 g/kg的海泡石(S2.5，S5)和沸石(Z2.5，Z5)對(duì)Mn超富集植物短毛蓼(Polygonum pubescens Blume)生長(zhǎng)、Mn吸收及葉片抗氧化酶系統(tǒng)的影響。結(jié)果表明：改良劑添加顯著增加了短毛蓼莖、葉中Mn的含量(P＜0.05)，但降低了株重、葉綠素a和葉綠素b含量。S2.5、Z5.0處理的株高比對(duì)照提高了15% 和16%，Z2.5與Z5.0處理分別比對(duì)照降低了40.05%、35.58%。沸石和海泡石添加顯著提高了短毛蓼葉片中MDA含量及H2O2含量(P＜0.05)，表明短毛蓼受到了一定脅迫。超氧自由基含量在S2.5、S5.0、Z2.5處理時(shí)下降了4.69%、16.49%、21.01%。同時(shí)沸石和海泡石引起了短毛蓼抗氧化酶活性和非酶物質(zhì)含量的改變。海泡石顯著提高(P＜0.05)短毛蓼葉片中超氧歧化酶(SOD)活性，在S2.5、S5.0處理下，SOD活性分別比對(duì)照提高了14% 和15%；POD、CAT活性也均有不同程度提高，在S2.5、S5.0處理下，POD分別是對(duì)照的4.63、4.23倍，Z2.5、Z5.0處理分別是對(duì)照的4.71、4.74倍；但顯著降低了抗壞血酸過氧化物酶活性以及 -SH、GSH含量(P＜0.05)。表明沸石和海泡石對(duì)短毛蓼抗氧化酶系統(tǒng)的影響不一。

關(guān)鍵詞：錳；改良劑；短毛蓼；抗氧化酶

錳(Mn)是人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)和植物生長(zhǎng)所必需營(yíng)養(yǎng)元素，同時(shí)也是植物光合體系Ⅰ和Ⅱ中重要的微量元素之一[1-3]。但土壤中過量的Mn會(huì)加速植物體內(nèi)活性氧化物質(zhì)(reactive oxygen species，ROS)的生成，破壞植物細(xì)胞的質(zhì)膜、蛋白質(zhì)和DNA，造成膜脂過氧化，干擾細(xì)胞正?；顒?dòng)[4-5]。植物在逆境脅迫下通過提高抗氧化酶活性，包括SOD、CAT、POD 和APX等以及非酶物質(zhì)GSH和-SH等減少或者消除ROS帶來的傷害[6]。因此可以用植物體內(nèi)抗氧化酶和非酶物質(zhì)來指示植物對(duì)重金屬脅迫的程度。

化學(xué)固定是在土壤中加入化學(xué)試劑或者化學(xué)材料，利用它們與重金屬之間形成不溶性或者移動(dòng)性差、毒性小的物質(zhì)而降低其在土壤中的生物有效性，減少其向水體和植物及其他環(huán)境單元的遷移，從而實(shí)現(xiàn)土壤修復(fù)。天然沸石因巨大的比表面積、良好的離子交換能力而具有很好的吸附能力，是修復(fù)重金屬土壤的改良劑之一。有研究表明添加天然沸石和海泡石均能降低土壤可交換態(tài)Cd、Pb、Zn含量，從而降低植物對(duì)Cd、Pb、Zn的吸收[7-10]。Mn作為一種多變價(jià)態(tài)的化學(xué)元素，其在良好交換能力和吸附能力的沸石和海泡石作用下，是否與土壤中的Cd、Pb、Zn變化相似，值得深入研究。因此，本研究通過在Mn污染土壤中添加不同配比的海泡石、沸石，探討Mn超富集植物——短毛蓼對(duì)Mn吸收以及Mn對(duì)短毛蓼生長(zhǎng)的影響，旨在揭示改良劑與超富集植物聯(lián)合修復(fù)Mn污染土壤的可行性，為超富集植物-改良劑聯(lián)合作用修復(fù)Mn污染土壤提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

土壤樣品采集自廣西壯族自治區(qū)桂林市平樂縣二塘鎮(zhèn)某Mn礦尾礦區(qū)。除去0～2 cm表層土壤，采集2～20 cm土層土壤帶回實(shí)驗(yàn)室，在自然狀態(tài)下風(fēng)干，磨細(xì)過10目篩備用。土壤理化性質(zhì)見表1。

表1　供試土壤基本理化性質(zhì)Table 1 Basic physical and chemical properties of soil tested

短毛蓼(Polygonum pubescens Blume)采集自廣西壯族自治區(qū)桂林市全州某Mn礦區(qū)，選擇生長(zhǎng)一致的8 cm高的短毛蓼，用蒸餾水沖洗根部3次后備用。

海泡石、沸石購(gòu)自于桂林靈川縣金山思達(dá)新型材料廠，過100目篩以備用。

1.2 盆栽試驗(yàn)

盆栽試驗(yàn)設(shè)6個(gè)處理：不添加改良劑對(duì)照(CK-1，CK-2，分別對(duì)照海泡石和沸石處理)、25 g/kg海泡石(S2.5)、50 g/kg海泡石(S5.0)、25 g/kg沸石(Z2.5)、50 g/kg沸石(Z5.0)，每個(gè)處理重復(fù)3次。稱取改良劑和土壤樣品均勻混合，放置于黑色盆(34 cm × 22 cm × 11 cm)中，每盆土壤樣品與改良劑之和為500 ± 0.5 g。盆栽土壤澆入蒸餾水，在室溫條件下平衡30天，每隔一天采用稱重法保持土壤含水率維持在田間最大含水率的70%。30天后將短毛蓼移栽至土壤中，每盆中栽種一株短毛蓼。在廣西師范大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院大棚中進(jìn)行維護(hù)，每日通過稱重法澆水，植物生長(zhǎng)75 天后收獲。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法

1)生物量。植物樣品先用自來水沖凈，再將短毛蓼浸入20 mmol/L的EDTA-Na2溶液中交換20 min以去除根系表面吸附的金屬離子，最后用去離子水洗凈，用吸水紙將水分吸干，用卷尺測(cè)量株高、用天平稱量株重。之后，將短毛蓼葉片一分為二，一部分存于自封袋中放入-20℃冰箱保存用于抗氧化酶系統(tǒng)指標(biāo)的測(cè)定，另一部分葉與莖、根在105℃烘箱中殺青30 min，70℃下烘48 h至恒重。烘干的植物樣品用不銹鋼粉碎機(jī)磨碎，過60目尼龍網(wǎng)篩用于重金屬含量的測(cè)定。

2)酶活性。稱取0.20 g去葉脈剪碎葉片于預(yù)冷的研缽中，加1.00 ml預(yù)冷的0.1 mmol/L的磷酸緩沖液(pH 7.0，內(nèi)含0.1 μmol/L的EDTA，1% 的聚乙烯吡咯烷酮(PVP))在冰浴上研磨成勻漿，加緩沖液使最終體積為8.00 ml。在4℃條件下10 000 r/min離心15 min，得上清液，即為酶粗提取液[11]，用于測(cè)定SOD、CAT、POD、APX活性。SOD、CAT、POD活性測(cè)定參照王學(xué)奎等[12]的方法；APX活性測(cè)定采用Cao等[13]的方法。

3)葉綠素、MDA、·O2-、H2O2、-SH及PCs、GSH含量。葉綠素采用95% 的乙醇提取方法[12]；·O2-采用陳貴[14]的方法測(cè)定；MDA含量參照中國(guó)科學(xué)院上海植物生理研究所的方法[15]；H2O2含量測(cè)定參照鄒琦[16]介紹的方法；-SH含量測(cè)定參照吳靈瓊等[17]介紹的方法；PCs和GSH含量測(cè)定參照文獻(xiàn)[27]的方法。

4)Mn含量。稱取0.250 0 g烘干且過篩后的植物樣品于消解管中，加入5 ml HNO3-HClO4(4︰1)消煮至澄清，用去離子水定容后采用ICP-OES(Varian 715-ES Series)測(cè)定各植物樣品中的Mn含量。

以上所有的測(cè)定至少重復(fù)3次，所有圖表用Microsoft Excel 2013處理，并用SPSS13.0軟件進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)及相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 改良劑對(duì)短毛蓼生物量及Mn含量的影響

從圖1可知，S2.5、Z5.0處理的株高高于對(duì)照，分別為對(duì)照的1.15倍和1.16倍，但與對(duì)照無顯著性差異(P＞0.05)。改良劑添加顯著降低了短毛蓼株重(P＜0.05)，S5.0處理時(shí)株重降低最為明顯，僅為對(duì)照的48.31%，Z2.5與Z5.0處理分別比對(duì)照降低了40.1%、35.6%(圖2)。從圖3可知，改良劑添加顯著增加了短毛蓼莖、葉中Mn含量(P＜0.05)，在Z2.5處理時(shí)短毛蓼葉片中的Mn含量達(dá)到最大值，為12 091 mg/kg，是對(duì)照的2.91倍；在S2.5處理時(shí)短毛蓼根、莖Mn含量達(dá)到最大值，分別為1 114 mg/kg和1 392 mg/kg，分別比對(duì)照提高了156% 和252%。

圖1　改良劑對(duì)短毛蓼株高的影響Fig.1 Effects of mineral amendments on heights of P.pubescens

圖2　改良劑對(duì)短毛蓼株重的影響Fig.2 Effects of mineral amendments on weights of P.pubescens

圖3　改良劑處理對(duì)短毛蓼根莖、葉、中Mn含量的影響Fig.3 Effects of mineral amendments on Mn contents in the leaves,stems and roots of P.pubescens

圖4　改良劑對(duì)短毛蓼葉綠素含量的影響Fig.4 Effects of mineral amendment on contents of chlorophyll in leaves of P.pubescens

2.2 改良劑對(duì)短毛蓼葉綠素、H2O2和含量的影響

由圖4可知，改良劑添加顯著降低了短毛蓼葉片中的葉綠素a和葉綠素b含量(P＜0.05)，在S2.5和S5.0處理時(shí)葉綠素a和葉綠素b分別比對(duì)照下降了56.0%、53.9% 和50.7%、40.4%；在Z2.5和Z5.0處理時(shí)葉綠素a和葉綠素b分別比對(duì)照下降了51.7%、49.0% 和49.0%、41.2%，但對(duì)類胡蘿卜素影響不顯著(P＜0.05)，表明了改良劑抑制了葉綠素a和葉綠素b的合成。由圖5、圖6可知，改良劑的添加引起了短毛蓼葉片中活性氧物質(zhì)H2O2和的變化。海泡石和沸石不同程度地提高了短毛蓼葉片中H2O2的含量，在S2.5處理時(shí)H2O2含量是對(duì)照的1.49倍，而S5.0處理時(shí)則與對(duì)照的差異不顯著，Z2.5、Z5.0處理時(shí)分別是對(duì)照的1.76、1.65倍。海泡石添加顯著降低了短毛蓼葉片中含量，在S2.5、S5.0處理時(shí)含量較對(duì)照下降了4.69%、16.49%；Z2.5處理時(shí)含量較對(duì)照下降了21.01%。

2.3 改良劑對(duì)短毛蓼葉片抗氧化酶及MDA含量的影響

改良劑添加對(duì)短毛蓼葉片抗氧化酶系統(tǒng)產(chǎn)生了一定的影響。從圖7A可知海泡石添加能顯著提高短毛蓼葉片中SOD含量(P＜0.05)，S2.5、S5.0處理分別是對(duì)照的1.14、1.15倍，沸石添加則對(duì)葉片中SOD活性影響不顯著(P＞0.05)。改良劑添加顯著增加了POD活性(P＜0.05)(圖7B)，S2.5、S5.0處理分別是對(duì)照的4.63、4.23倍，Z2.5、Z5.0處理分別是對(duì)照的4.71、4.74倍。從圖7C中可以看出，改良劑添加提高了短毛蓼葉片中CAT活性，S5.0處理時(shí)CAT活性達(dá)到最大值，為256.59 U/(g·min)。與SOD、POD、CAT活性不同，改良劑添加顯著降低短毛蓼葉片中APX活性，S2.5、S5.0處理時(shí)分別比對(duì)照降低了55.73%、66.19%，Z2.5、Z5.5處理時(shí)分別比對(duì)照降低了82.60%、85.59%(圖7D)。由圖7E可知，沸石和海泡石添加顯著提高了短毛蓼葉片中MDA含量(P＜0.05)，說明葉片受到Mn的脅迫，造成膜脂過氧化。

2.4 改良劑對(duì)短毛蓼葉片-SH、PCs、GSH含量的影響

從圖8中可以看出，沸石添加顯著降低了短毛蓼葉片中-SH含量(P＜0.05)，Z2.5、Z5.0處理時(shí)分別比對(duì)照降低了13.95%、11.41%，海泡石的添加則對(duì)短毛蓼葉片中-SH含量無顯著影響(P＞0.05)。改良劑添加對(duì)短毛蓼葉片中PCs含量無顯著性影響(P＞0.05)，卻顯著降低了短毛蓼葉片中GSH含量(P＜0.05)。

圖5　改良劑對(duì)短毛蓼葉片中的影響Fig.5 Effects of mineral amendments oncontents in leaves of P.pubescens

圖6　改良劑對(duì)短毛蓼葉片中H2O2的影響Fig.6 Effects of mineral amendments on H2O2contents in leaves of P.pubescens

3 討論

本研究中試供土壤為以Mn污染為主、以Cd污染為輔的多金屬?gòu)?fù)合污染土壤。有研究表明，重金屬污染土壤添加海泡石和沸石能提高土壤pH，使土壤中重金屬有效態(tài)含量降低[18-19]，從而使植物體內(nèi)重金屬含量降低。本試驗(yàn)研究表明，添加改良劑能顯著提高短毛蓼莖和葉中的Mn含量(P＜0.05)，而短毛蓼地下部分Mn含量與對(duì)照間差異不顯著，這與改良劑對(duì)土壤Cd、Pb、Zn等重金屬的結(jié)果相反[20-21]，其中原因值得深入研究。植物葉片中Mn含量過高將導(dǎo)致葉綠素合成必需元素Mg、Fe等的吸收受到抑制，致使葉綠素合成受阻[22-23]，本實(shí)驗(yàn)中改良劑添加顯著降低了短毛蓼葉片中的葉綠素a和葉綠素b(P＜0.05)，這可能與Mn元素含量過高導(dǎo)致這些元素下降有關(guān)。葉綠素含量下降將影響植物的光合作用，影響植株的生物量，雖然改良劑的添加增加了短毛蓼的株高，但降低了短毛蓼的株重。同時(shí)改良劑添加可能在短期內(nèi)吸附了土壤中的磷等營(yíng)養(yǎng)元素，降低了有效磷的含量，從而影響了短毛蓼生長(zhǎng)[24]。

在正常生長(zhǎng)條件下，植物體內(nèi)的活性氧物質(zhì)的產(chǎn)生和清除處于平衡狀態(tài)，但是植物在受到土壤中過量重金屬脅迫后，這種平衡可能被打破，產(chǎn)生H2O2、·OH等活性氧類物質(zhì)(ROS)抑制植物的生長(zhǎng)，從而引起植物自由基的累積和膜脂過氧化，影響植物的生理和生化過程[25]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，改良劑添加不同程度地提高了短毛蓼葉片中H2O2的含量，顯著提高了短毛蓼葉片中的MDA含量(P＜0.05)，這與彭喜旭等[26]研究Mn污染對(duì)玉米MDA含量的變化規(guī)律一致，證實(shí)了短毛蓼受到Mn的脅迫。土壤含有過量Cd元素，短毛蓼在25 mg/L Cd濃度水培條件下生長(zhǎng)沒有顯著變化[27]，同時(shí)土壤中有效態(tài)Cd含量較低，因此短毛蓼生長(zhǎng)不受Cd的脅迫。此時(shí)，植物將通過體內(nèi)抗氧化酶(SOD、CAT等)與非酶物質(zhì)(-SH,GSH 等)來消除過量的自由基[28]。SOD是植物清除逆境中產(chǎn)生的的第一步，SOD可以催化植物體內(nèi)的產(chǎn)生H2O2[29]。本研究結(jié)果表明，海泡石處理SOD含量增加顯著(P＜0.05)，而顯著降低了含量(P＜0.05)，這與王意錕等[30]對(duì)改良劑的添加對(duì)豇豆植株中 SOD活性影響的結(jié)果相同，說明添加海泡石能激活短毛蓼葉片中SOD酶活性，加速催化了向H2O2的轉(zhuǎn)變。SOD對(duì)催化產(chǎn)生的H2O2可以通過在CAT、APX、 POD等抗氧化酶以及非酶物質(zhì)GSH等共同作用下轉(zhuǎn)化成H2O和O2而排出體外[28]。改良劑的添加不同程度地提高了短毛蓼葉片中POD、CAT活性，這與吳娟等[31]研究鈣對(duì)菹草無菌苗體內(nèi)的POD和CAT含量的變化規(guī)律一致。植物除了通過抗氧化酶系統(tǒng)來清除逆境脅迫產(chǎn)生的活性氧物質(zhì)，還可以通過非酶物質(zhì)來協(xié)同抗氧化酶清除過量的活性氧物質(zhì)。本研究結(jié)果表明，短毛蓼葉片中GSH呈下降的變化趨勢(shì)，且APX活性也呈下降趨勢(shì)，其含量的下降可能與GSH和抗壞血酸形成的AsA-GSH循環(huán)代謝(Halliwell-Asada途徑)參與H2O2的清除有關(guān)。

圖7　改良劑對(duì)短毛蓼葉片中抗氧化酶活性及MDA的影響Fig.7 Effects of mineral amendments on antioxidant enzyme activities and MDAs in leaves of P.pubescens

圖8　改良劑處理對(duì)短毛蓼葉片中 -SH、PCs和GSH的影響Fig.8 Effects of mineral amendments on contents of -SH、PCs and GSH in leaves of P.pubescens

4 結(jié)論

海泡石與沸石的添加顯著增加了短毛蓼莖和葉中的Mn含量(P＜0.05)，使得短毛蓼葉片中H2O2含量增加，同時(shí)啟動(dòng)了短毛蓼的抗氧化酶系統(tǒng)，短毛蓼通過提高SOD、POD、CAT活性來消除H2O2對(duì)短毛蓼的影響，但葉片中MDA含量顯著高于對(duì)照(P＜0.05)，表明短毛蓼受到了Mn的脅迫，導(dǎo)致了葉綠素a和葉綠素b含量的降低，株重顯著低于對(duì)照(P＜0.05)。

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Effects of Mineral Amendment on Manganese Absorption and Antioxidant Enzymes Activities in Hyperaccumulator Polygonum pubescens Blume

YE Panhua1,WANG Yang1,LIU Kehui2,ZHOU Zhenming1,3,CHEN Menglin1,3,LIU Hua1,SU Yinping1,YU Fangming1,3*
(1 School of Environment and Resource,Guangxi Normal University,Guilin,Guangxi 541004,China; 2 School of Life and Environmental Science,Guilin University of Electronic Technology,Guilin,Guangxi 541004,China; 3 Key Laboratory of Ecology of Rare and Endangered Species and Environmental Protection(Guangxi Normal University),Ministry of Education,Guilin,Guangxi 541004,China)

Abstract:The main objective of the present study was to investigate the amendments to remediate manganese pollution soil combined hyperaccumulator plants.By using soil incubation experiment,2.5% and 5% of sepiolite(S2.5,S5.0)and zeolite(Z2.5,Z5.0)were added to study the effects on Mn hyperaccumulator Polygonum pubescens Blume’s growth,Mn absorption and antioxidant enzyme activities.The results showed that sepiolite and zeolite significantly increased Mn in the leaves of P.pubescens(P＜0.05).However,sepiolite and zeolite also decreased the plant weight,the contents of chlorophyll a and b in the leaves of P.pubescens.S2.5 and Z5.0 treatments increased the height of P.pubescens by 15% and 16%,respectively,compared to the control group,while Z2.5 and Z5.0 decreased the height of P.pubescens by 40.05% and 35.58% respectively.In addition,sepiolite and zeolite significantly increased the contents of MDA and H2O2(P＜0.05)indicating the P.pubescens was under surpress.The content of superoxide radical(·O2-)decreased 4.69%,16.49% and 21.01% in S2.5,S5.0 and Z2.5 treatments,respectively.Furthermore,sepiolite and zeolite changed the activities of the antioxidant enzymes and the content of non-enzymes antioxidant.Sepiolite significantly increased the activity of superoxide dismutase(SOD)in the leaves,as indicated by the results that S2.5 and S5.0 treatments increased SOD activity by 14% and 15% respectively.The activities of peroxidase(POD)and catalase(CAT)also increased.The activities of POD were 4.63 and 4.23 times of the control in the S2.5 and S5.0 groups respectively.Z2.5 and Z5.0 treatments increased POD activities by 4.71 times and 4.74 times of the controls.However,both sepiolite and zeolite decreased the activity of ascorbate peroxidase(APX),-SH and GSH(P＜0.05).These results demonstrate that sepiolite and zeolite have different impacts on the antioxidant enzymes in P.pubescens.

Key words:Manganese; Amendment; Polygonum pubescens Blume; Antioxidant enzymes

作者簡(jiǎn)介：葉攀驊(1990—)，男，安徽合肥人，碩士研究生，研究方向?yàn)榄h(huán)境生態(tài)與生物修復(fù)。E-mail:leaf592952962@163.com

* 通訊作者(fmyu1215@163.com)

基金項(xiàng)目：①國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(41161057)，廣西自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2014GXNSFAA118303)，廣西科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)項(xiàng)目重大專項(xiàng)計(jì)劃(桂科重1298002-6；桂科轉(zhuǎn)14122008-2)，廣西教育廳項(xiàng)目(2013HZ003)和廣西研究生教育創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目(YCSZ2015094)資助。

DOI:10.13758/j.cnki.tr.2016.01.017

中圖分類號(hào)：X53