宋麗娜

摘要：采用建立PCR的方法對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的135株規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)排污口的大腸桿菌進(jìn)行了氯霉素耐藥基因FLO的檢測(cè)。結(jié)果顯示135株大腸桿菌中氯霉素抗性基因FLO的檢出率為 36.7 %，證實(shí)該耐藥基因在豬場(chǎng)排污口普遍存在。

關(guān)鍵詞：大腸桿菌；耐藥基因FLO；分子流行病學(xué)；豬場(chǎng)排污口

中圖分類號(hào)：S852.61 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1007-273X（2016）02-0007-01

大腸埃希菌是醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)臨床上最常見的一種病原菌，是人及動(dòng)物的主要共生菌，其抗原性復(fù)雜，血清型多樣，引起的臨床癥狀和病理變化多樣，且多與病毒性疾病和其他細(xì)菌性疾病并發(fā)，給人類及畜牧業(yè)的發(fā)展造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重危害畜禽及人類的健康，每年由大腸埃希菌病帶來的經(jīng)濟(jì)損失數(shù)以億計(jì)，所造成的危害十分嚴(yán)重。在醫(yī)學(xué)上曾報(bào)道感染大腸埃希菌O157后的平均死亡率為1.5%，病程平均時(shí)間6.9周。據(jù)估計(jì)，全球每年因感染產(chǎn)毒素性大腸埃希菌至少可導(dǎo)致6.5億人發(fā)病，并引起約80萬5歲以下兒童死亡。我國(guó)不少地區(qū)大腸埃希菌在腹瀉病人的病原譜中占首位。在獸醫(yī)臨床上大腸埃希菌造成的危害十分嚴(yán)重，一年四季均可致病，如仔豬的黃白痢、仔豬水腫病、禽大腸埃希菌病等，一直是困擾養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的常見病。本研究采用建立PCR的方法對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的135株規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)排污口的大腸桿菌進(jìn)行了氯霉素耐藥基因FLO的檢測(cè)。旨在為大腸桿菌病的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 本實(shí)驗(yàn)室保存的從豬場(chǎng)排污口采集的135株大腸桿菌菌株。

1.1.2 試劑 TaqDNA 聚合酶購(gòu)自 MBI， dNTP 及 DNA Marker-DL2000 購(gòu)自北京天根生物科技有限公司，引物購(gòu)自 Generay Biotech 公司。普通瓊脂平板及培養(yǎng)基由本實(shí)驗(yàn)室配制。常規(guī)試劑為分析純。

1.1.3 儀器 PCR儀器（德國(guó)進(jìn)口），凝膠電泳儀、紫外線成像系統(tǒng)（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠），CJ型超凈工作臺(tái)（蘇州百神科技網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)公司），高壓蒸汽滅菌鍋（上海醫(yī)用核子儀器廠），電子天平（北京賽多利斯天平有限公司），電爐、水浴箱、微量移液槍、玻棒、量筒、500 mL錐形瓶、酒精燈、EP管（0.5 μL和1.5 μL）等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 模板的制備 在腸桿菌選擇性培養(yǎng)基麥康凱瓊脂平板上挑取單個(gè)典型紅色菌落溶入盛有100 μL滅菌蒸餾水的EP管中，放入沸水中煮10 min后迅速轉(zhuǎn)入-20 ℃環(huán)境下4 min，再于10 000 r/min離心1 min后放入4 ℃作模板備用。

1.2.2 PCR法擴(kuò)增氯霉素抗性基因FLO 采用50 μL體系，包括10×PCR Buffer 5 μL，MgCl2 5 μL，上、下游引物各5 μL，dNTP 1 μL，TaqDNA 聚合酶 1 μL，模板 10 μL， 石蠟油 5 μL，滅菌蒸餾水補(bǔ)足至50 μL。按下列條件反應(yīng)：95 ℃ 4 min，4 ℃ 50 s，50 ℃ 40 s，72 ℃ 50 s，72 ℃ 10 min，4℃ 60 min。30個(gè)循環(huán)。上游引物序列：5′-CTGAGGGTGTCGTCATCTA-3′；下游引物序列： 5′-GCTCCGACAATGCTGACTAT-3′。

1.2.3 凝膠電泳試驗(yàn) 試驗(yàn)采用瓊脂糖凝膠電泳。配制1%的瓊脂糖凝膠供檢測(cè)用， 于紫外燈下觀察電泳結(jié)果并照相。

2 結(jié)果與分析

試驗(yàn)結(jié)果（圖1）表明，豬場(chǎng)排污口大腸桿菌普遍存在氯霉素抗性基因FLO，檢測(cè)的135株大腸桿菌中FLO 的檢出率為36.7%。

3 小結(jié)與討論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，所檢測(cè)的大腸埃希氏菌對(duì)氯霉素耐藥的基因FLO檢出率高達(dá)36.7%，說明氯霉素耐藥基因FLO在豬場(chǎng)排污口流行很嚴(yán)重。雖然目前國(guó)際上已經(jīng)禁止氯霉素的使用，但是豬場(chǎng)排污口還是檢測(cè)出了耐氯霉素基因。究其原因，可能是在大腸埃希氏菌病的治療中，氯霉素類抗革蘭氏陰性菌的藥物普遍被違規(guī)使用或有氯霉素相同成分的替代藥物出現(xiàn)；其次，環(huán)境中存在有利于耐藥性誘導(dǎo)及耐藥基因轉(zhuǎn)移的條件，導(dǎo)致耐藥基因的普遍傳播[1，2]。

豬場(chǎng)排污口作為豬場(chǎng)與外界環(huán)境的交接點(diǎn)，在排污口檢測(cè)到耐藥基因，說明以往養(yǎng)殖場(chǎng)里的生物發(fā)酵、化學(xué)藥物的消毒等措施并不能阻止養(yǎng)殖場(chǎng)中大腸桿菌耐藥基因的環(huán)境釋放，而且對(duì)于很多豬場(chǎng)來說，排污之前并沒有采取任何措施，這直接導(dǎo)致耐藥基因在環(huán)境中水平傳播，對(duì)以后的動(dòng)物及人的臨床用藥增加了難度。

從研究結(jié)果來看，加強(qiáng)養(yǎng)殖場(chǎng)排污管理迫在眉睫，而且對(duì)于獸醫(yī)臨床用藥也要規(guī)范合理化，已經(jīng)禁用的氯霉素更應(yīng)嚴(yán)格把關(guān)，不許違禁使用。

參考文獻(xiàn)：

[1] 徐小艷，王國(guó)相，印繼華，等.1975～2002年大腸桿菌耐藥性變化情況調(diào)查[J].畜牧與獸醫(yī)，2013，35（3）：29-32.

[2] 朱力軍.動(dòng)物性大腸桿菌耐藥性的變化趨勢(shì)[J].中國(guó)獸藥雜志，2010，35（2）：16-18.