云南地方稻種抗稻瘟病基因Pi-d3序列變異分析

楊奕　孫一丁　馬繼瓊　王炎炎　許明輝

(云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所/ 云南省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/ 農(nóng)業(yè)部西南作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 昆明 650223; *通訊聯(lián)系人，E-mail：xuminhui@sohu.com)

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云南地方稻種抗稻瘟病基因Pi-d3序列變異分析

楊奕孫一丁馬繼瓊王炎炎許明輝*

(云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所/ 云南省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/ 農(nóng)業(yè)部西南作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 昆明 650223;*通訊聯(lián)系人，E-mail：xuminhui@sohu.com)

楊奕，孫一丁，馬繼瓊，等. 云南地方稻種抗稻瘟病基因Pi-d3序列變異分析. 中國(guó)水稻科學(xué)， 2016， 30(1)： 17-26.

摘要:對(duì)來自云南的80份地方稻種抗稻瘟病基因Pi-d3編碼區(qū)序列進(jìn)行了PCR擴(kuò)增并測(cè)序分析。結(jié)果表明，與地谷相比，80份云南地方稻種的Pi-d3編碼區(qū)序列(全長(zhǎng)2775 bp)存在39個(gè)變異位點(diǎn)，平均變異率為1.41%。所有材料可以歸為37種單倍型，頻率較高的單倍型是H8(28.8%)、H4(11.3%)、H23(5.0%)，其他單倍型頻率較低，顯示了云南地方稻種Pi-d3基因變異豐富，單倍型類型多，但頻率較低。37種單倍型中存在28個(gè)氨基酸差異位點(diǎn)，共編碼33種蛋白，其中18種單倍型共計(jì)32份材料(包括12份秈稻品種)出現(xiàn)了假基因，假基因化的頻率較高，可能是粳稻Pi-d3假基因化向秈稻滲透。除已發(fā)現(xiàn)的737位氨基酸假基因位點(diǎn)外，新發(fā)現(xiàn)32和467兩個(gè)假基因位點(diǎn)。Pi-d3基因在秈稻、粳稻亞種，水稻、陸稻，黏稻、糯稻的單倍型類型及頻率兩方面均存在差異，表明亞種間或生態(tài)型間發(fā)生了一定的遺傳分化。37種單倍型在云南的地理分布呈大分散、小聚居的特點(diǎn)，普洱、版納、臨滄的單倍型種類最豐富，并以之為中心向外擴(kuò)展，單倍型種類隨之減少。

關(guān)鍵詞:云南地方稻種； 稻瘟?。?Pi-d3基因； 單核苷酸多態(tài)性

水稻是世界上重要的糧食作物，稻瘟病是由稻瘟病菌(Magnaportheoryzae；無性態(tài)：Pyriculariaoryzae)引起的水稻真菌病害[1]，在世界各水稻種植區(qū)均有發(fā)生，可引起水稻大幅減產(chǎn)，甚至絕收，嚴(yán)重阻礙了水稻生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展。稻瘟病抗性可分為垂直抗性和水平抗性兩種類型，垂直抗性由單個(gè)主效抗性基因控制，水平抗性則由微效多基因控制[2-4]。到目前為止，通過廣泛的遺傳分析，水稻中至少已鑒定和定位了86個(gè)抗稻瘟病基因(國(guó)家水稻數(shù)據(jù)中心)，這些基因大部分成簇地分布于水稻除第3染色體以外的其他11條染色體上[5]，其中，已有24個(gè)稻瘟病主效抗性基因被成功克隆[6-9]。

水稻抗稻瘟病基因Pi-d3由Shang等[10]在比較秈粳稻全基因組NBS-LRR基因等位間假基因化差異時(shí)，利用假基因化標(biāo)記在分離的感病小群體內(nèi)克隆得到。Pi-d3基因位于水稻第6染色體上，屬于組成型表達(dá)基因，含有2775 bp的編碼區(qū)，編碼924個(gè)氨基酸，含有NBS-LRR結(jié)構(gòu)域和MHD基序。由于Pi-d3抗性基因LRR序列中有一個(gè)堿基突變形成終止子，所以存在等位的假基因。

云南高原地形氣候復(fù)雜，位于中國(guó)與南亞兩個(gè)稻種起源中心之間，云南境內(nèi)海拔76～2700 m區(qū)域均有亞洲栽培稻地方品種分布，是世界上最大的稻種遺傳多樣性中心之一，基因多樣性大于中國(guó)其他地理群[11]。本研究對(duì)云南不同生態(tài)區(qū)的80份地方稻種Pi-d3基因編碼區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增并測(cè)序，通過分析Pi-d3基因在核苷酸水平上的多態(tài)性，明確云南稻種Pi-d3基因序列變異類型和地理分布特點(diǎn)，旨在為研究稻種傳播過程中生態(tài)環(huán)境變化與基因變異的關(guān)系提供依據(jù)，為篩選抗稻瘟病地方品種提供材料。

1材料與方法

1.1供試材料

從保存于云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所內(nèi)的云南地方稻種資源核心種質(zhì)庫中隨機(jī)抽取80份來源于云南省不同州市(縣)的地方品種作為本研究的材料。按秈粳亞種分類，粳稻46份，秈稻34份；按水陸稻分類，水稻48份，陸稻32份；按黏糯稻分類，黏稻62份，糯稻18份。本研究以日本晴Pi-d3基因序列為測(cè)序?qū)φ铡?/p>

1.2水稻基因組DNA的提取

在水稻3～4葉期，取新鮮葉片，采用改進(jìn)的CTAB法提取基因組DNA[12]。

1.3Pi-d3基因同源序列的獲取及分析

根據(jù)已知的Pi-d3基因的保守序列設(shè)計(jì)引物對(duì)(Pi-d3-1F：5′-GCGAGAAGGAAGTAACACCCA-3′；Pi-d3-1R：5′-CGGAGGATATCGTGCATTTGG-3′；Pi-d3-2F：5′-GTACGACTCTGGGTTGCTGAA-3′；Pi-d3-2R：5′-AGAATGAATGTCCTGACTGAAACC-3′)，由華大基因公司合成后，對(duì)云南地方稻種抗稻瘟病基因Pi-d3進(jìn)行擴(kuò)增。

PCR反應(yīng)體系總體積為40 μL，包括10×緩沖液 4 μL，dNTPs 2 μL，4 mol/L正向和反向引物2 μL，ExTaq酶 0.5 μL，20 ng/μL DNA模板 1 μL，ddH2O 28.5 μL。PCR反應(yīng)程序如下：95℃下預(yù)變性5 min；94℃下變性40 s，57℃下退火30 s，72℃下延伸2 min，35個(gè)循環(huán)；72℃下再延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用0.5%的瓊脂糖凝膠電泳。電泳后于紫外投射儀下檢測(cè)條帶合格后，送華大基因公司進(jìn)行測(cè)序，每個(gè)材料重復(fù)測(cè)序兩次。

2結(jié)果與分析

2.1云南地方稻種Pi-d3等位基因編碼區(qū)序列的變異

在水稻中，Pi-d3基因編碼區(qū)的長(zhǎng)度為2775 bp，實(shí)驗(yàn)獲得的日本晴序列長(zhǎng)度及堿基順序與從GenBank獲得的序列No. FJ773286.1一致，表明測(cè)序數(shù)據(jù)可靠。與地谷序列(GenBank Accession No.FJ773285.1)相比，80份云南地方稻種的Pi-d3編碼序列中，共發(fā)現(xiàn)39個(gè)核苷酸變異位點(diǎn)，分別位于94，95，130，144，197，326，356，414，458，459，477，525，537，610，756，775，785，1014，1128，1197，1329，1399，1484，1544，1713，1729，1766，1842，1874，2005，2009，2209，2396，2444，2566，2671，2680，2687，2699位點(diǎn)(表1)，平均變異率1.41%。39個(gè)不同位點(diǎn)的變異頻率為1.25%～100.00%，值得注意的是，位點(diǎn)2566、2687處的變異率均達(dá)到100.00%，表明所檢測(cè)的云南稻種在2566和2687位點(diǎn)與地谷完全不同。39個(gè)變異位點(diǎn)中17個(gè)發(fā)生顛換，占總突變位點(diǎn)的43.59%，其中G/T顛換7個(gè)(占17.95%)，A/T顛換5個(gè)(占12.82%)，C/G表1云南地方稻種Pi-d3基因編碼區(qū)序列的變異

Table 1. Sequence variations of Pi-d3 open reading frame in Yunnan rice landraces.

變異位點(diǎn)Variationsite地谷堿基BaseinPi-d3Digu替代堿基Substitutedbase替換類型Substitutiontype測(cè)序材料數(shù)Sequencedaccessionnumber替代材料數(shù)No.ofsubstitutedaccessions頻率Frequence/%94GT顛換Transversion8033.895AT顛換Transversion8011.3130GC顛換Transversion807796.3144TG顛換Transversion807796.3197CT轉(zhuǎn)換Transition8078.8326AT顛換Transversion8045.0356GC顛換Transversion8033.8414GT顛換Transversion8033.8458CT轉(zhuǎn)換Transition802227.5459AG轉(zhuǎn)換Transition807796.3477AG轉(zhuǎn)換Transition804657.5525TC轉(zhuǎn)換Transition805568.8537GA轉(zhuǎn)換Transition804860.0610GA轉(zhuǎn)換Transition802430.0756TC轉(zhuǎn)換Transition8078.8775GA轉(zhuǎn)換Transition807796.3785AG轉(zhuǎn)換Transition807593.81014CT轉(zhuǎn)換Transition802227.51128CA顛換Transversion80810.01197TC轉(zhuǎn)換Transition807998.81329TG顛換Transversion8056.31399AT顛換Transversion80810.01484GA轉(zhuǎn)換Transition8056.31544GA轉(zhuǎn)換Transition802430.01713TG顛換Transversion807188.81729GA轉(zhuǎn)換Transition807290.01766CT轉(zhuǎn)換Transition80810.01842CG顛換Transversion80911.31874AT顛換Transversion806986.32005GT顛換Transversion802328.82009GA轉(zhuǎn)換Transition802328.82209CT轉(zhuǎn)換Transition802328.82396AG轉(zhuǎn)換Transition80810.02444TA顛換Transversion807188.82566CG顛換Transversion8080100.02671GT顛換Transversion801012.52680GA轉(zhuǎn)換Transition807290.02687GA轉(zhuǎn)換Transition8080100.02699GA轉(zhuǎn)換Transition8078.8

顛換4個(gè)(占10.26%)，A/G顛換1個(gè)(占2.56%)；22個(gè)位點(diǎn)發(fā)生轉(zhuǎn)換，占總突變位點(diǎn)的56.41%，其中G/A轉(zhuǎn)換14個(gè)(占35.90%)，C/T轉(zhuǎn)換8個(gè)(占20.51%)。經(jīng)過DNA序列的比對(duì)，可將80份云南地方稻種歸為37種單倍型(表2)，日本晴歸于H4。每種單倍型的變異堿基數(shù)均在10個(gè)以上，平均變異堿基數(shù)17個(gè)，其中單倍型H11的變異堿基數(shù)最多(22個(gè))，單倍型H31的變異堿基數(shù)最少(11個(gè))。從表2中還可以看出，37種單倍型中H8(28.8%)，H4(11.3%)，H23(5.0%)所占比例較高，是云南的主要類型，而其他單倍型的頻率較低，每個(gè)單倍型僅有1～2個(gè)品種?？梢?，云南地方稻種在Pi-d3位點(diǎn)上具有變異豐富、單倍型類型多、頻率較低的特點(diǎn)。

2.2抗稻瘟病基因Pi-d3蛋白的氨基酸分析

對(duì)比分析云南地方稻種Pi-d3基因的37種單倍型與地谷編碼蛋白質(zhì)情況，發(fā)現(xiàn)存在28個(gè)氨基酸的變異。37種單倍型共編碼33種蛋白質(zhì)，單倍型H2與H35、H4與H17、H8與H19、H14與H15編碼的蛋白質(zhì)不存在差異(表3)。這33種不同的蛋白質(zhì)中，有16種提前出現(xiàn)終止子為非完整蛋白，其余的17種為完整蛋白。

結(jié)合表2、表3可以看出H1、H4、H17、H7、H9、H11、H14、H15、H18、H21、H24、H30、H36共13種單倍型由于在核苷酸2209位處發(fā)生C/T顛換，使氨基酸737位出現(xiàn)終止子，導(dǎo)致Pi-d3基因成為假基因，這是Shang等發(fā)現(xiàn)的假基因位點(diǎn)，由此可以推測(cè)這些單倍型的植株易感病[10]。此外，本研究中新發(fā)現(xiàn)單倍型H33、H34由于在核苷酸94位出現(xiàn)G/T顛換，致使氨基酸32位出現(xiàn)終止子；單倍型H13、H16、H28、H34、H36在核苷酸1399位發(fā)生A/T顛換，導(dǎo)致氨基酸467位出現(xiàn)終止子，這些是新發(fā)現(xiàn)的易感病假基因單倍型。

80份云南地方材料中有32份出現(xiàn)假基因化現(xiàn)象，假基因出現(xiàn)頻率高達(dá)40%。這些假基因化材料包含粳稻20份，秈稻12份，雖然秈稻中出現(xiàn)假基因的頻率(35.3%)明顯低于粳稻(43.5%)，但檢測(cè)出了秈稻中存在假基因化現(xiàn)象。而Shang等在發(fā)現(xiàn)Pi-d3基因時(shí)認(rèn)為，Pi-d3假基因化只存在于粳稻和雜草稻中，而在檢測(cè)過的野生稻和秈稻中都沒有假基因化[10]。云南地方稻種Pi-d3假基因化在水稻和陸稻中出現(xiàn)的數(shù)量同為16份，但在水稻中出現(xiàn)頻率(33.3%)低于陸稻(50.0%)。按黏糯稻分類，供試材料中有23份黏稻和9份糯稻材料出現(xiàn)Pi-d3假基因化，糯稻的出現(xiàn)頻率(50.0%)高于黏稻(37.1%)。Pi-d3假基因化在云南的10個(gè)州市均有分布，以普洱(8份)、版納(7份)、臨滄(6份)為主，德宏出現(xiàn)3份，文山、昭通各出現(xiàn)2份，玉溪、紅河、麗江、保山均出現(xiàn)1份。版納出現(xiàn)Pi-d3假基因化的頻率最高，達(dá)87.5%。在普洱、版納、臨滄這些地區(qū)，秈稻和粳稻同時(shí)進(jìn)行種植，天然雜交幾率較高，云南秈稻品種中發(fā)現(xiàn)了假基因化現(xiàn)象，推測(cè)云南地方稻種中Pi-d3假基因化從粳稻向秈稻的滲透。

表3不同單倍型中Pi-d3基因氨基酸序列變化

Table 3. Amino acid variation of Pi-d3 in 37 haplotypes.

單倍型Haplotype氨基酸位點(diǎn)Aminoacidlous324466109119138153204259262443467495515571577589625669670737799815856891894896900地谷DiguEGAKRRTGVDNRGRHVSNVGQNFHVVRRH1-R-M--MSI-K--HQM-IFD*-YD-IQ-H2、H35-R------------QM-I----YD-IQ-H3-R------I-----QM-I----YDLIQ-H4、H17-R----MSI----HQM-IFD*-YD-IQ-H5-R-MPS--I---E---L----S-DL-QQH6-R------I---E-QM-I----YDLIQ-H7-R---SMSI----HQM-IFD*-Y-LIQ-H8、H19-R------I-----QM-I----YD-IQ-H9------MSI----HQM-IFD*-YD-IQ-H10-R------IG----QM-I----YDLIQ-H11-R-MPSMSI----HQM-IFD*-YD-IQ-H12-R------I-----QM------YD-IQ-H13-R------I--*--QM-I----YDLIQ-H14、H15-R----MSI-K--HQM-IFD*-YD-IQ-H16-RV-----I--*----L----S-D--QQH18-R----MSI----HQM-IFD*-YDLIQ-H20-RV-----I-------L----S-D--QQH21-R-MP-MSI----HQM-IFD*-YD-IQ-H22-R------I---E-QM-I----YD-IQ-H23-R------IG----QM-I----YD-IQ-H24-R----MSI----H-M----*-YD-IQ-H25-RV-----I-------L----S-D--Q-H26-R----------E-QM-I----YD-IQ-H27-RV-----I-------L----S-DL-QQH28-R------I--*--QM-I----YD-IQ-H29VR------I-----QM-I----YD-IQ-H30-------SI----HQM-IFD*-YD-IQ-H31--------I-----QM-I----YD-IQ-H32-R-----SI-K--HQM-IFD--YD-IQ-H33*R------I-----QM-I----YD-IQ-H34*R------I--*E-QM-I----YD-IQ-H36-R----MSI--*-HQM-IFD*-YD-IQ-H37-R------I-----QM-I-----D-IQ-

“-”代表在此位點(diǎn)上與地谷相同; “*”代表終止子。

“-”represents the same base as Digu; “*”represents terminator.

2.3抗稻瘟病基因Pi-d3不同單倍型在云南各地區(qū)的分布

分析Pi-d3基因在云南省各州市的地理分布發(fā)現(xiàn)(表4)，主要單倍型中H4集中分布在普洱、臨滄等地，在普洱的分布頻率最高，達(dá)44.4%，為普洱的優(yōu)勢(shì)單倍型。單倍型H8在云南省的分布范圍較為廣泛，主要分布在德宏、普洱、臨滄、保山、玉溪、文山、昭通等地，其中在普洱和臨滄的分布頻率較高(17.4%)，是普洱和臨滄兩地的優(yōu)勢(shì)單倍型。單倍型H23在普洱的分布頻率同樣較高(50.0%)。云南各地區(qū)的單倍型多樣性指數(shù)表現(xiàn)為：普洱市(0.885)>版納州(0.875)>臨滄市(0.871)>玉溪市(0.861)>文山州(0.735)>德宏州(0.722)>保山市(0.720)>麗江市(0.667)>昭通市(0.560)。顯而易見，普洱、版納、臨滄擁有較多類型的單倍型。這些結(jié)果進(jìn)一步表明Pi-d3基因在云南各地不同的生態(tài)類型之間存在顯著的遺傳分化。

2.4抗稻瘟病基因Pi-d3不同單倍型在水稻各類型中的分布

Pi-d3基因在云南地方品種的粳稻、秈稻亞種間的分布存在差異，H1、H2、H3、H5、H6、H7、H9、H10、H11、H13、H14、H17、H18、H19、H20、H21、H22、H24、H25、H26、H27等單倍型只在粳稻中出現(xiàn)；H28、H29、H30、H31、H32、H33、H34、H35、H36、H37等單倍型只在秈稻中出現(xiàn)。在Pi-d3位點(diǎn)上，粳稻和秈稻的共享基因型有H4、H8、H12、H15、H16、H23，根據(jù)共享基因型頻率可以看出H4為粳稻的優(yōu)勢(shì)單倍型，H8為秈稻的優(yōu)勢(shì)單倍型。單倍型H4的序列與粳稻日本晴(GenBank Accession No. FJ773286.1)完全相同，單倍型H8的序列與秈稻 93-11(GenBank Accession No.FJ773285.1)的序列完全相同。可見，秈稻和粳稻均有優(yōu)勢(shì)單倍型，表明兩個(gè)亞種在此位點(diǎn)上已發(fā)生明顯的遺傳分化，粳稻單倍型類型更為豐富。

Pi-d3基因在水稻和陸稻間的分布同樣存在差異，H1、H2、H3、H5、H6、H7、H11、H12、H13、H14、H17、H21、H26、H27、H32等單倍型只在陸稻中出現(xiàn)；H9、H10、H19,H22、H24、H25、H28、H29、H30、H31、H33、H34、H35、H36、H37等單倍型只在水稻中出現(xiàn)；H4、H8、H15、H16、H18、H20、H23等單倍型在水陸稻種均有出現(xiàn)，其中H4為陸稻的優(yōu)勢(shì)單倍型、H8、H20、H23為水稻的優(yōu)勢(shì)單倍型。

Pi-d3基因在黏性稻和糯性稻間的分布存在差異，H1、H2、H5、H6、H7、H9、H13、H14、H15、H16、H17、H20、H22、H23、H26、H27、H29、H31、H32、H33、H34、H35、H36、H37只在黏稻中分布；H10、H11、H19、H21、H24、H25、H30只在糯稻中分布；H3、H4、H8、H12、H18、H28等單倍型在黏稻和糯稻中均有分布，其中H4、H8為黏稻的優(yōu)勢(shì)單倍型，H28為糯稻的優(yōu)勢(shì)單倍型。

2.5進(jìn)化樹的構(gòu)建

所有材料可分為兩大枝(圖1)，對(duì)應(yīng)氨基酸577、589、799、894位點(diǎn)的變異，其中Ⅰ枝包括H20、H16、H27、H5、H25和地谷，其余的32種單倍型歸為第Ⅱ枝。在第Ⅰ枝中，地谷單獨(dú)為一個(gè)小枝，H25、H5、H27、H16、H20為一個(gè)群，它們與地谷的親緣關(guān)系較近，特征是氨基酸577、894位點(diǎn)無變異，589位點(diǎn)變異為L(zhǎng)(亮氨酸)，799位點(diǎn)變異為S(絲氨酸)。在第Ⅱ枝中，H37單獨(dú)為一個(gè)小枝，另外的31個(gè)單倍型聚為一個(gè)亞枝，這個(gè)亞枝中H2、H35、H26、H6、H22、H34、H3、H13、H10、H23、H8、H19、H28、H29、H33、H31聚為一個(gè)群，它們?cè)诎被?69和670位點(diǎn)均無變異。H24、H32、H9、H30、H7、H18、H17、H36、H4、H14、H15、H1、H11、H21聚為一個(gè)群，它們的特征是在氨基酸204位點(diǎn)變異為S(絲氨酸)，515位點(diǎn)變異為H(組氨酸)，H12單獨(dú)為一小枝。從進(jìn)化關(guān)系看H37、H12、H8、H19、H28、H29、H33更為原始。

3討論

云南省地形氣候復(fù)雜，位于中國(guó)與南亞兩個(gè)稻種起源中心之間，是世界上最大的稻種遺傳多樣性中心之一，基因多樣性大于中國(guó)其他地理群[11]。本研究通過核苷酸序列分析將80份云南地方稻種的Pi-d3基因歸為37種單倍型；單倍型分析表明云南地方稻種Pi-d3基因單倍型種類豐富，低頻率的單倍型較多，秈稻和粳稻均有優(yōu)勢(shì)單倍型，兩個(gè)亞種間已發(fā)生明顯的遺傳分化，出現(xiàn)這種現(xiàn)象也可能是秈稻和粳稻由不同的野生稻進(jìn)化而來。

表5Pi-d3不同單倍型在水稻各類型中的分布

Table 5. Distribution of Pi-d3 haplotype in different rice types.

單倍型Haplotype材料數(shù)No.ofaccessions粳稻japonica數(shù)量No.頻率Frequence/%秈稻indica數(shù)量No.頻率Frequence/%陸稻Uplandrice數(shù)量No.頻率Frequence/%水稻Lowlandrice數(shù)量No.頻率Frequence/%黏稻No-waxyrice數(shù)量No.頻率Frequence/%糯稻W(wǎng)axyrice數(shù)量No.頻率Frequence/%H111100.0001100.0001100.000H211100.0001100.0001100.000H322100.000150.0150.0150.0150.0H49777.8222.2666.7333.3777.8222.2H511100.0001100.0001100.000H611100.0001100.0001100.000H711100.0001100.0001100.000H823939.11460.9521.71878.31982.6417.4H911100.000001100.01100.000H1011100.000001100.0001100.0H1111100.0001100.000001100.0H122150.0150.02100.000150.0150.0H1311100.0001100.0001100.000H1411100.0001100.0001100.000H152150.0150.0150.0150.02100.000H162150.0150.0150.0150.02100.000H1711100.0001100.0001100.000H1822100.000150.0150.0150.0150.0H1911100.000001100.0001100.0H2033100.000133.3266.73100.000H2111100.0001100.000001100.0H2211100.000001100.01100.000H234250.0250.0125.0375.04100.000H2411100.000001100.0001100.0H2511100.000001100.0001100.0H2611100.0001100.0001100.000H2711100.0001100.0001100.000H283003100.0003100.0133.3266.7H291001100.0001100.01100.000H301001100.0001100.0001100.0H311001100.0001100.01100.000H321001100.01100.0001100.000H332002100.0002100.02100.000H341001100.0001100.01100.000H351001100.0001100.01100.000H361001100.0001100.01100.000H371001100.0001100.01100.000總數(shù)Total804657.53442.53240.04860.06277.51822.5

Pi-d3基因在云南的分布范圍廣泛，云南省13個(gè)州市的不同生態(tài)類型中都有分布，呈現(xiàn)出大分散、小聚居的特點(diǎn)。水稻與稻瘟病菌之間存在特異互作現(xiàn)象，且符合“基因?qū)颉钡年P(guān)系。云南稻瘟病菌群體遺傳多樣性水平較高[15-16]，不同海拔地區(qū)稻瘟病菌生理小種和遺傳多樣性存在差異[17]。在“稻-稻瘟病菌”的長(zhǎng)期協(xié)同進(jìn)化中，復(fù)雜多樣的稻瘟病菌群體參與了品種的自然選擇，為云南稻種資源稻瘟病抗性提供了進(jìn)化的動(dòng)力[18]。因此，云南地方稻種Pi-d3基因的多樣性及廣泛分布與相關(guān)稻瘟病菌生理小種的遺傳多樣性密切相關(guān)。

Shang等在檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，Pi-d3假基因化只存在于粳稻和雜草稻中，在大部分被測(cè)的粳稻品種中Pi-d3基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)開始的第2208位核苷酸處的CAG突變成為終止子TAG，使之成為了假基因，而在檢測(cè)過的非洲栽培稻、AA組型野生稻和秈稻中都未發(fā)現(xiàn)假基因，由此推測(cè)這種突變是秈粳稻分化后發(fā)生的[10]。本研究在檢測(cè)的80份云南地方稻種中發(fā)現(xiàn)20份粳稻和12份秈稻出現(xiàn)假基因化現(xiàn)象，假基因化頻率較高，新發(fā)現(xiàn)核苷酸94、1399位兩個(gè)假基因位點(diǎn)。Pi-d3假基因出現(xiàn)頻率較高的地區(qū)一般同時(shí)種植秈粳稻，天然雜交的幾率高，秈稻中出現(xiàn)假基因化可能是粳稻與秈稻雜交，粳稻假基因向秈稻滲透的結(jié)果。

圖1Neighbor-joining 法構(gòu)建水稻抗稻瘟病基因Pi-d3系統(tǒng)進(jìn)化樹

Fig. 1. Neighbor-joining phylogenetic tree for 37 Pi-d3 haplotypes.

Shang等[10]研究發(fā)現(xiàn)，抗稻瘟病基因Pi-d3在水稻品種地谷、93-11、TP309以及日本晴中均被檢測(cè)到，但只有秈稻品種地谷和93-11中該基因?qū)Φ疚辆哂锌剐?，在粳稻品種TP309和日本晴中，由于基因內(nèi)部一個(gè)C/T的顛換，導(dǎo)致終止子提前，僅編碼一個(gè)帶有737個(gè)氨基酸的多肽，破壞了該蛋白的LRR區(qū)域，進(jìn)而導(dǎo)致該基因功能的喪失。本研究新發(fā)現(xiàn)Pi-d3基因在秈稻中出現(xiàn)假基因化現(xiàn)象，這些假基因化的品種是否具有抗病性，需要進(jìn)一步的抗病性研究。此外，除了出現(xiàn)Pi-d3假基因的單倍型，另外19種單倍型的Pi-d3氨基酸序列與地谷不同，它們的功能需要進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn):

[1]Couch B C,Hohn L M. A multilocus gene genealogy concordant with host preference indicates segregation of a new species,Magnaportheoryzae, fromM.grisea.Mycologia, 2002, 94: 683-693.

[2] Ezuka A. Field resistance of rice varieties to rice blast disease.RevPlantProtRes, 1972, 5: 1-21.

[3] Bonman J M, Mackill D J. Durable resistance to rice blast disease.Oryza， 1988, 25: 103-110.

[4]Wang G L,Mackill D J, Bonman M, et al. RFLP mapping of genes conferring complete and partial resistance to blast in a durably resistant rice cultivar.Genetics, 1994, 136: 1421-1434.

[5]Chen M, Presting G, Barbazuk W B, et al. An integrated physical and genetic map of the rice genome.PlantCell， 2002, 14: 537-545.

[6]Hua L, Wu J, Chen C, et al. The isolation ofPil, an allele at the pik locus which confers broad spectrum resistance to rice blast.TheorApplGenet， 2012, 125(5): 1047-1055.

[7]Zhu X, Chen S, Yang J, et al. The identification of Pi50(T), a new member of the rice blast resistance Pi2/Pi9 mukigene family.TheorApplGenet， 2012, 124(7): 1295-1304.

[8]Lee S W, Han S W, Sririyanum M, et al. A type I-secreted, sulfated peptide triggersXa21-mediated innate immunity.Science， 2009, 326(5954): 850-853.

[9] 楊勤忠，林菲，馮淑杰，等. 水稻稻瘟病抗性基因的分子定位及克隆研究進(jìn)展. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué) 2009，42(5): 1601-1615.

Yang Q Z, Lin F, Feng S J, et al. Recent progress on molecular mapping and cloning of blast resistance genes in rice (OryzasativaL.).SciAgricSin, 2009, 42(5): 1601-1615. (in Chinese with English abstract)

[10]Shang J J, Tao Y, Chen X W, et al. Identification of a new rice blast resistance gene,Pi-d3, by genomewide comparison of paired nucleotide-binding site-leucine-rich repeat genes and their pseudogene alleles between the two sequenced rice genomes.Genetics， 2009, 182(4): 1303-1311.

[11]黃燕紅，孫新立，王象坤. 中國(guó)栽培稻遺傳多樣性中心和起源研究. 植物遺傳資源學(xué)報(bào), 2005，6(2): 125-129.

Huang Y H, Sun X L, Wang X K. Study on the center of genetic diversity and its origin of cultivated rice in China.JPlantGenetRes, 2005, 6(2): 125-129.(in Chinese with English abstract)

[12]許明輝，鄭明慧，劉彥中. 煙草品種RAPD分子標(biāo)記多態(tài)性與品種鑒定．種子，1998(5): 23-25.

Xu M H, Zheng MH, Liu Y Z. Genetic diversity and identifieation in varieties of Nicotiana tabaccum L. by RAPD markers.Seed, 1998(5): 23-25.(in Chinese with English abstract)

[13]Fontaine C, Lovett P, Sanou H, et al. Genetic diversity of the shea tree.VitellariaparadoxaC.F. Gaertn, detected by RAPD and chloroplast microsatellite markers.Heredity， 2004, 93:639-648.

[14]Ballini E, Morel J B, Droc G, et al. A genome-wide meta-analysis of rice blast resistance genes and quantitative trait loci provides new insights into partial and complete resistance.PlantMicrobeInteract， 2008, 21: 859-868.

[15]李進(jìn)斌，李成云，張 慶，等. 兩套鑒別品種對(duì)云南稻瘟病菌株鑒別能力的比較. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，42(2): 486-491.

Li J B, Li C Y, Zhang Q, et al. Comparison of differentiating capacity of two sets of differential lines using isolates ofMagnaporthegriseacollected from China′s Yunnan Province.SciAgricSin, 2009, 42(2): 486-491.(in Chinese with English abstract)

[16]Li J B, Yang J, Liu L, et al. Geographic distribution of avirulence genes in rice blast fungusin Yunnan Province.ChinaJResEcol， 2011, 2(2):181-185.

[17]林菁菁，李進(jìn)斌，劉林，等. 云南元陽哈尼梯田稻瘟病菌遺傳多樣性分析. 植物病理學(xué)報(bào)，2009，39(1): 43-51.

Lin J J, Li J B, Liu L, et al. Genetic diversity ofMagnaporthegriseaof Hani terrace from Yuanyang County in Yunnan.ActPhytaSin, 2009, 39(1): 43-51.(in Chinese with English abstract)

[18]黃興奇. 云南作物種質(zhì)資源(稻作篇). 昆明：云南科學(xué)技術(shù)出版社，2005.

Huang X Q. Yunnan crop germplasm resources (volume rice). Kunming: Yunnan Science and Technology Press, 2005.

[19]李進(jìn)斌，王甜，許明輝. 云南地方稻種抗稻瘟病基因Pi-ta和Pi-b的鑒定. 中國(guó)水稻科學(xué)，2012，26(5): 593-599.

Li J B, Wang T, Xu M H. Identification ofPitaandPi-bgenes for rice blast resistance of rice landraces from Yunnan Province.ChinJRiceSci, 2012, 26(5): 593-599.(in Chinese with English abstract)

[20]趙國(guó)珍，蔣春苗，劉吉新，等. 云南野生稻抗稻瘟病Pi-ta基因的檢測(cè)及分析. 中國(guó)水稻科學(xué)，2014，28(6): 675-680.

Zhao G Z, Jiang C M, Liu J X, et al. Identification and analysis on the rice blast resistance genePi-tain wild rice from Yunnan, China.ChinJRiceSci, 2014, 28(6): 675-680.(in Chinese with English abstract)

Sequence Variation ofPi-d3 for Rice Blast Resistance in Yunnan Rice Landrace

YANG Yi, SUN Yi-ding, MA Ji-qiong, WANG Yan-yan, XU Ming-hui*

(InstituteofBiotechnologyandGeneticResources/KeyLaboratoryofBiotechnologyResearchofYunnanProvince/KeyLaboratoryofSouthwesternCropGeneResourcesandGermplasmInnovationofMinistryofAgriculture,YunnanAcademyofAgriculturalSciences,Kunming650223,China；*Corresponding author, E-mail：xuminhui@sohu.com)

YANG Yi, SUN Yiding, MA Jiqiong, et al. Sequence variation ofPi-d3 for rice blast resistance in Yunnan rice landrace. Chin J Rice Sci, 2016, 30(1): 17-26.

Abstract:The sequence variations of Pi-d3 for rice blast resistance in 80 Yunnan rice landraces were analyzed by resequencing open reading frame (ORF). Compared with Pi-d3(Digu )ORF, a total of 39 nucleotide variations were found in 2775-bp ORFs of 80 rice accessions with the average mutation rate of 1.41%. The WTBXPi-d3ORF of 80 rice accessions was divided into 37 haplotypes based on the nucleotide variations. H8(28.8%), H4(11.3%) and H23(5.0%) are high-frequency types, while other types occurred at low frequency. The results showed that the WTBXPi-d3 in Yunnan rice landraces was rich in genetic variations and haplotypes,but low frequency. A total of 28 amino acids variations were found in 33 translation proteins of 37 haplotypes. 18 haplotypes with 32 rice landraces including 12 indica accessions possessde the Pi-d3 pseudogenes. The frequency of pseudogene was high. It was possible due to that the Pi-d3 pseudogene permeated to indica. Terminators were newly founded at position 32 and 467 of protein except the published terminator at position 737. Pi-d3 differed in both type and frequency of haplotypes between the subspecies of indica and japonica, the ecotypes of lowland and upland rice, no-waxy and waxy rice. It indicated that genetic differentiation occurred between subspecies or ecotypes. Geographical distribution showed that 37 haplotypes spread over a large area while concentrated in small areas. Puer, Banna and Lincang were the central area with abundant haplotypes, and based on this scale, the types of haplotypes decreased outward progressively.

Key words:Yunnan rice landraces; rice blast; Pi-d3; single nucleotide polymorphism

文章編號(hào):1001-7216(2016)01-0017-10

中圖分類號(hào):Q756； S435.111.4+1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31360331)；科技部基礎(chǔ)性工作專項(xiàng)(2012FY110200)； 云南省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2013FZ146)。

收稿日期:2015-06-13； 修改稿收到日期: 2015-07-30。