董璐+賈紅梅+劉迪+毛洪玉

摘要： 以菊花C008的葉片為試材，分別采用CTAB法、Trizol法、改良Trizol法和試劑盒法等進行總RNA提取試驗，并對提取質量進行分析比較。結果表明：CTAB法提取的總RNA存在DNA污染。Trizol法提取的總RNA條帶復雜，有蛋白等雜質污染。改良Trizol法提取的總RNA條帶清晰，但RNA存在降解。試劑盒法提取的總RNA條帶清晰，純度更高，D260 nm/D280 nm為1.889，濃度為144.000 μg/mL，是適于菊花葉片總RNA提取的簡單、高效的方法。

關鍵詞： 菊花；總RNA；提取方法

中圖分類號： S682.1+10.1 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）03-0067-02

菊花（Chrysanthemum morifolium）是中國十大傳統(tǒng)名花和世界四大切花之一，也是園林綠化中的重要觀賞植物之一，在現(xiàn)代花卉生產中占有重要地位，具有很高的觀賞和經濟價值。菊花白色銹病是菊花首要病害之一，在多個國家被列為檢疫性病害[1]。尋找菊花中的抗病基因，對于防治該病具有重要作用。獲得純度高、完整性好的RNA是后期進行轉錄組測序、RT-PCR、基因克隆等分子生物學研究的基礎。菊花的組織器官中含有大量的多糖、酚類、蛋白質等次生代謝物質，嚴重干擾了菊花總RNA 的提取質量[2]。目前，針對菊花葉片總RNA的提取有一些報道[2-5]，但仍不能提取出質量好的總RNA。本試驗對4種常用的總RNA提取方法進行系統(tǒng)分析比較，發(fā)現(xiàn)試劑盒法對于菊花葉片總RNA的提取是一種簡單、高效的方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以沈陽農業(yè)大學花卉基地的菊花C008的葉片為試材，采后立即用錫箔紙包好，用液氮速凍后，在-80 ℃的超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

主要試劑：CTAB緩沖液、10%β-巰基乙醇、氯仿 ∶異戊醇（CI，V ∶V=24 ∶1）、Trizol試劑、異丙醇、無水乙醇、DECP水、RNA prep Pure Kit試劑盒等。

試驗所需的移液槍槍頭、槍頭盒均用0.1%DEPC水浸泡24 h，然后121 ℃高壓滅菌30 min，50 ℃烘干備用。三角瓶、玻璃棒、量筒、研缽、研棒、鑰匙用雙蒸餾水清洗后180 ℃烘烤過夜。研缽、研棒、藥匙在使用前需放入-20 ℃冰箱預冷。

1.2 試驗方法

1.2.1 CTAB法 ①取0.2 g菊花葉片于液氮中迅速冷卻充分研磨，將磨好的葉片迅速裝入無RNase的2 mL離心管中，加入65 ℃預熱的CTAB緩沖液（含10%的β-巰基乙醇） 1 mL，立即在振蕩器上劇烈振蕩30 s，65 ℃水浴鍋中孵育 10 min，每3～5 min顛倒混勻1次，動作不要太劇烈。②加入等體積的氯仿 ∶異戊醇（CI，V ∶V=24 ∶1），用力顛倒混勻，4 ℃ 下12 000 r/min離心10 min。③取上清液于新的離心管中，加入等體積的CI，輕輕顛倒混勻，4 ℃下，12 000 r/min離心10 min。④取上清液于新離心管中，加入二倍體積的異丙醇，輕輕顛倒混勻，-20 ℃沉淀30 min以上，4 ℃下12 000 r/min 離心20 min，去上清。⑤用提前預冷的75%乙醇洗滌沉淀1次，去上清，在超凈工作臺中吹干沉淀，加入 40 μL ddH2O水溶解沉淀。

1.2.2 Trizol法 參照呂晉慧等的方法[2]。

1.2.3 改良Trizol法 ①向1.5 mL離心管中加入1 mL Trizol 和20 μL β-巰基乙醇，混勻。稱取0.2 g菊花葉片液氮研磨成粉末，轉移至離心管中，混勻后，靜置10 min，4 ℃下 12 000 r/min 離心5 min。②取上清，加入等體積的CI，混勻，4 ℃下12 000 r/min離心5 min。③重復步驟②2次。④取上清，加入等體積異丙醇，混勻，靜置10 min，4 ℃下 12 000 r/min 離心10 min。⑤棄上清，用75%乙醇洗滌沉淀2次，4 ℃下12 000 r/min離心10 min；棄上清，超凈工作臺吹干，加入40 μL ddH2O溶解沉淀。

1.2.4 試劑盒法 參照RNA prep Pure Kit試劑盒（天根生化科技有限公司，北京）說明書。

1.2.5 總RNA完整性和純度檢測 取4 μL總RNA樣品在1%的瓊脂糖凝膠上進行電泳，電壓150 V電泳10～15 min，電泳后用凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄。取1 μL總RNA樣品，用紫外分光光度計測定波長在260 nm和280 nm下的吸光度（以試驗中溶解總RNA的ddH2O作為空白對照進行調零），計算總RNA樣品濃度及RNA產量。

2 結果與分析

2.1 菊花葉片總RNA的完整性分析

瓊脂糖凝膠電泳是檢測RNA質量的一種重要方法。用1%的瓊脂糖凝膠對4種不同方法提取的RNA進行電泳檢測，結果（圖1）表明，采用CTAB法提取的RNA條帶彌散且亮度低，伴有DNA污染，說明提取的RNA質量不好。Trizol法提取的RNA條帶復雜并且?guī)в休p微拖尾現(xiàn)象，5S條帶熒光亮度很大，說明RNA嚴重降解；點樣孔有亮斑，說明RNA樣品中含有多糖或蛋白質污染。改良Trizol法相較于Trizol法，條帶少，拖尾現(xiàn)象不明顯，點樣孔雜質少，但該方法還是未能完全去除多糖和酚類物質，8S比28S亮度大，說明28S有部分降解。試劑盒法提取的RNA，28S和18S條帶清晰，其熒光亮度接近2 ∶1，條帶沒有拖尾現(xiàn)象，點樣孔無亮斑，說明RNA提取效果好。該方法最適用于菊花總RNA的提取，并用于后續(xù)反轉錄、PCR等試驗。

2.2 菊花葉片總RNA的純度分析

利用紫外分光光度計對4種方法提取的菊花葉片總RNA的純度進行檢測。260 nm和280 nm下的吸光度代表了核酸和蛋白質等有機物含量，D260 nm/D280 nm的值直接反映出RNA中蛋白質等有機物的污染程度。由表1可知，Trizol法的D260 nm/D280 nm值為2.147，產量為39.224 μg/g，改良Trizol法的D260 nm/D280 nm為2.171，產量為57.499 μg/g，說明RNA中有少量蛋白質等有機物污染，質量較好，對于RNA質量要求不高的試驗，不影響后續(xù)使用。雖然CTAB法提取的RNA濃度高產量大，但不排除是因為其有DNA污染的影響。高純度RNA的D260 nm/D280 nm值應介于1.8～2.0之間，試劑盒法中D260 nm/D280 nm為1.889，濃度和產量分別為144.000 μg/mL、28.080 μg/g。就試驗所需時間來看，CTAB法所需要的時間最長，后期還需要去除DNA。Trizol法和改良Trizol法所需的時間適中，分別為60 min和70 min。試劑盒法所需時間最短，僅為45 min。綜上，試劑盒法是菊花C008葉片總RNA提取質量最好、效率最高的方法。

3 結論與討論

獲得高質量無污染的RNA是進行基因表達分析等后續(xù)分子試驗的關鍵環(huán)節(jié)，但是從植物組織中提取出高質量的RNA是有一定難度的。由于植物組織中含有多糖、多酚、蛋白質和其他次生代謝物質，給高純度RNA的提取帶來一定難度。并且RNase廣泛存在且穩(wěn)定，使RNA的提取相較于DNA變得更加困難。不同植物采用的提取方法不同，同種植物的不同組織或相同組織在不同生長階段所用的提取方法也不同[6-12]。所以，合適的總RNA提取方法的選擇，是轉錄組測序、RT-PCR、基因克隆等分子生物學方面研究的根本保證。

菊花為多年生草本植物，其組織或器官中含有大量的多糖和酚類物質，較多的次生代謝物質經常會對總RNA的產量和純度造成影響[2]。多糖的理化性質和RNA相似，容易與RNA形成難溶的膠狀物[13-14]，然而在去除多糖干擾的過程中，也會去除一些RNA，使RNA產量減少。酚類物質在材料勻漿時釋放出來被氧化，使其與RNA產生不可逆的褐化反應，導致勻漿呈褐色[15-16]。CTAB法、改良Trizol法和試劑盒法均使用β-巰基乙醇作為強還原劑，目的是防止酚類物質被氧化[17]。CTAB法是一種傳統(tǒng)的總RNA提取方法，但其提取的總RNA中有DNA污染，需要進一步用DNase Ⅰ消除，由于DNase Ⅰ價格較貴，不適用于大量提取RNA。本試驗Trizol法和改良Trizol法所提取的總RNA條帶均不只有5S、18S和28S這3條帶，在5S和18S之間還有條帶，可能是葉綠體RNA。改良Trizol法相較于Trizol法，用氯仿-異戊醇（V ∶V=24 ∶1）代替氯仿并進行多次抽提，更加充分地沉淀多糖、酚類物質等，這與王舒藜等的結論[18]相一致。試劑盒法所提取的總RNA雖然由于洗脫柱和過濾柱的作用導致濃度及產量不高[7]，但還是能夠滿足試驗需要，而且試劑盒法所提取的總RNA完整性好、操作簡單、所用時間短。綜上，試劑盒法是一種簡單、高效的提取菊花葉片總RNA的方法。

對于植物總RNA的提取還應該注意以下幾個方面：（1）試驗材料盡量采用新鮮樣品，長時間冷凍的樣品對植物總RNA的提取有一定影響。（2）采集新鮮樣品后應立即用液氮速凍，如采集地距離實驗室較遠，應在采集后立即放入冰盒，防止離體組織的RNA降解。（3）試驗前將研缽和研棒于 -20 ℃ 冰箱內預冷。如天氣炎熱，應在磨樣前向研缽中先加入液氮再一次快速預冷。藥匙在液氮中快速預冷后可防止藥匙上有樣品殘留，減少樣品損失。（4）在抽提吸取上清液過程中，采用小量程多次吸取的方法，緩慢吸取上清，可減少多糖、酚類物質等大分子與RNA作用一起沉淀。

參考文獻：

[1]Whipps I M. A review of white rust（Puccinia horiana Henn.）disease on chrysanthemum and the potential for its biological control with Verticillium lecanii （Zimm.）Viégas[J]. Ann Appl Boil，1993，122：173-187.

[2]呂晉慧，陳 陽，康紅梅. 一種有效的菊花總RNA提取方法[J]. 中國農學通報，2011，27（25）：113-116.

[3]張志想，葛蓓孛，潘 嵩，等. 菊花矮化類病毒的分子檢測與序列分析[J]. 園藝學報，2011，38（12）：2349-2356.

[4]黃 河，王順利，曹華雯，等. 甘菊cDNA-AFLP反應體系的優(yōu)化[J]. 生物技術通報，2009（11）：108-113.

[5]溫立柱. 菊花開花抑制基因CmEMF基因的克隆及其表達分析[D]. 泰安：山東農業(yè)大學，2013.

[6]李 霞，王 欣，后 猛，等. 紫肉甘薯塊根總RNA提取方法的評價[J]. 分子植物育種，2015，13（1）：165-170.

[7]羅 江，楊麗娟，崔浩然，等. 刺山柑總RNA提取方法的比較研究[J]. 北方園藝，2014（5）：91-95.

[8]劉 潔，江靜怡，徐吉臣. 一種改良的云杉針葉總RNA提取方法[J]. 分子植物育種，2014，12（3）：554-561.

[9]李紅熙，徐美隆，楊 智. 一種適合葡萄多種組織的總RNA提取方法[J]. 中國農學通報，2012，28（7）：155-159.

[10]王夢娜，武 艷，程國山，等. 茶樹葉片總RNA提取方法的比較研究[J]. 植物生理學報，2013，01（1）：95-99.

[11]崔素萍，康振生，趙 杰，等. 一種快速提取小麥葉片總RNA的方法[J]. 西北植物學報，2006，26（2）：314-318.

[12]李小婷，戴國禮，李彥龍，等. 沙棘葉片總RNA提取方法的比較研究[J]. 江蘇農業(yè)科學，2014，42（3）：33-34，137.

[13]Fang G，Hammar S，Grumet R. A quick and inexpensive method for removing polysaccharides from plant genomic DNA[J]. BioTechniques，1992，13（1）：52-54，56.

[14]譚麗麗，燕正民，徐亞英，等. 番茄葉片總RNA提取方法的比較[J]. 東北農業(yè)大學學報，2010，41（4）：29-32.

[15]Schneiderbauer A，Sandermann H，Ernst D. Isolation of functional RNA from plant tissues rich in phenolic compounds[J]. Analytical Biochemistry，1991，197（1）：91-95.

[16]曾文丹，羅興錄，袁圣勇，等. 不同方法提取木薯莖總RNA效果的比較研究[J]. 北方園藝，2013（8）：103-106.

[17]夏海武，呂柳新，陳桂信. 羊蹄甲果莢中總RNA提取的新方法[J]. 分子植物育種，2006，4（1）：147-149.

[18]王舒藜，吳沙沙，呂英民. 改良Trizol法快速高效提取香石竹總RNA[J]. 分子植物育種，2010，8（5）：987-990.