王昌陵+曹永強(qiáng)+張立軍+王文斌+閆春娟+孫旭剛+宋書宏

摘要： 以遼寧省審定的大豆品種遼豆15號花粉為材料，探討大豆花粉在離體培養(yǎng)條件下萌發(fā)、生長的主要影響因子。采用單因素試驗篩選出大豆花粉萌發(fā)培養(yǎng)基最佳碳源為蔗糖，Ca2+源為CaCl2，有效植物生長調(diào)節(jié)劑為GA3。通過Plackett-Burman設(shè)計法對影響大豆花粉管生長的8個因素進(jìn)行了評價，篩選出具有顯著效應(yīng)的3個因素：初始pH值、蔗糖、GA3。用最陡爬坡路徑逼近花粉管長度響應(yīng)區(qū)域，通過響應(yīng)面法確定主要影響因素的最佳水平組合。結(jié)果表明，大豆花粉離體萌發(fā)的各影響因子的最佳水平組合為蔗糖濃度19.2%、GA3 68.9 mg/L、初始pH值6.47、H3BO4 0.015%、CaCl2 0.05%、PEG-4000 7.5%、溫度25 ℃、時間3 h。優(yōu)化后離體培養(yǎng)花粉管長度達(dá)391.95 μm，比優(yōu)化前提高32.68%。

關(guān)鍵詞： 大豆花粉；萌發(fā)；Plackett-Burman設(shè)計；響應(yīng)面法；優(yōu)化

中圖分類號： S565.103 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）03-0094-05

高等植物有性生殖過程中，花粉萌發(fā)是極為重要的環(huán)節(jié)[1]。花粉萌發(fā)率、花粉管長度是直接反映植物生殖活力的主要標(biāo)志。在大豆常規(guī)育種過程中，對親本進(jìn)行選擇配制以及開展雜交大豆育種、不育系研究，都涉及到大豆花粉的萌發(fā)問題[2-4]?；ǚ勖劝l(fā)時花粉粒吸水膨大，花粉粒內(nèi)壁沿萌發(fā)孔向外突出，最后形成花粉管[5]，是極為復(fù)雜的生理過程[6]。花粉離體萌發(fā)需要碳源[7]、礦物質(zhì)元素及生長調(diào)節(jié)劑[8]的參與，只有在培養(yǎng)基中含有足量且合適的營養(yǎng)組分并在適宜的pH值、溫度等條件下，花粉才能正常萌發(fā)生長[9]。由于涉及到多個可變因子，如何快速有效地篩選出主要因素并進(jìn)行優(yōu)化是該研究領(lǐng)域的關(guān)鍵問題之一。Plackett-Burman（PB）設(shè)計法是一種經(jīng)濟(jì)有效的二水平試驗設(shè)計方法[10]，可以利用最少的試驗次數(shù)，從眾多考察因素中快速有效地篩選出主要的影響因素[11-12]。響應(yīng)面法（response surface methodology，RSM）是一種優(yōu)化生物過程的綜合技術(shù)，可同時對影響生物產(chǎn)量的因子水平及交互作用進(jìn)行優(yōu)化與評價[13]，快速有效地確定多因子系統(tǒng)的最佳條件，該法已被廣泛應(yīng)用于生物過程優(yōu)化[14]。大豆花粉萌發(fā)能力的差異直接影響對大豆有性繁殖能力及育種價值評價結(jié)果。前人對于大豆花粉離體培養(yǎng)報道較少。本研究應(yīng)用Plackett-Burman（PB）設(shè)計法篩選影響大豆花粉萌發(fā)的主要因素，并通過響應(yīng)面法確定主要影響因素的最佳水平組合，對大豆花粉萌發(fā)培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，旨在為大豆雜交育種、親本配制研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試大豆品種為遼豆15號，為筆者所在單位選育的北方春大豆品種，種植于遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗田內(nèi)。

1.2 花粉采集方法

7月中上旬R2時期（盛花期），于發(fā)育正常的植株上選取花蕾，花蕾大小盡量一致，并符合當(dāng)日可做雜交父本的標(biāo)準(zhǔn)，用鑷子取下后置于干凈離心管內(nèi)放于4 ℃冰箱保存，當(dāng)日使用。

1.3 花粉培養(yǎng)方法

采用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)花粉[15]。按照不同試驗處理配制液體培養(yǎng)基，用移液器滴1滴在凹形載玻片上。將花蕾的萼片、花瓣剝開，用鑷子夾取花藥在液滴表面快速輕蘸一下，使花粉在培養(yǎng)基上分散開即可。為保持濕度，將載玻片放在鋪有濕濾紙的培養(yǎng)皿中，置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)25 ℃靜置培養(yǎng) 3 h。培養(yǎng)結(jié)束放4 ℃冰箱保存。

1.4 花粉發(fā)育指標(biāo)的測定

1.4.1 萌發(fā)率的測定 培養(yǎng)后使用萊卡DM750型顯微鏡進(jìn)行觀測。當(dāng)花粉管的長度大于花粉粒的直徑時計為萌發(fā)。統(tǒng)計萌發(fā)、未萌發(fā)的花粉粒數(shù)，萌發(fā)率計算公式如下：萌發(fā)率=萌發(fā)的花粉數(shù)/總的花粉數(shù)×100%。每個試驗處理隨機(jī)選取3個視野，每個視野所統(tǒng)計的花粉粒不少于100粒。

1.4.2 花粉管長度的測定 選取已萌發(fā)的花粉，用顯微鏡隨機(jī)選取3個視野拍照，用Image-Pro Plus圖像分析軟件測量花粉管的長度。每個樣品至少測定50個花粉管，計算平均長度、標(biāo)準(zhǔn)差。

1.5 單因素試驗

以30 mmol/L MES為母液，加入10%蔗糖+0.05% CaCl2+0.02%H3BO4+10%PEG-4000等成分，pH值調(diào)至6.0，作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基。探討碳源、Ca2+、植物生長調(diào)節(jié)劑等單因素對大豆花粉萌發(fā)率及花粉管長度的影響時，保持基礎(chǔ)培養(yǎng)基的其他組分不變，只改變探討因素的種類、濃度，在相同條件下培養(yǎng)并測定花粉發(fā)育指標(biāo)[16]。

1.5.1 碳源的選擇試驗 分別使用蔗糖、麥芽糖、葡萄糖、可溶性淀粉、山梨醇作為碳源，濃度均為10%。

1.5.2 Ca2+源的選擇試驗 分別使用CaCl2、Ca（NO3）2作為Ca2+來源，Ca2+濃度均為0.05%。

1.5.3 植物生長調(diào)節(jié)劑的選擇試驗 分別在基礎(chǔ)培養(yǎng)基（CK）中加入10 mg/L萘乙酸（NAA）、100 mg/L赤霉素（GA3）、10 mg/L 2，4-D、50 mg/L 6-BA等植物生長調(diào)節(jié)劑[17]。

1.6 Plackett-Burman（PB）設(shè)計[18]

根據(jù)單因素試驗確定的培養(yǎng)基組分及前期研究確定的各組分濃度范圍，對影響花粉萌發(fā)的8個因素進(jìn)行考察。按PB設(shè)計安排主要影響因素的篩選試驗，每個因素選取低濃度和高濃度分別作為PB試驗中的低水平“-1” “+1”，響應(yīng)值為花粉管長度（μm），自變量及其代號編碼和水平見表1[ 19]。

1.7 最陡爬坡試驗

根據(jù)PB試驗所得的回歸模型，由主要影響因素的偏回歸系數(shù)確定蔗糖、GA3、初始pH值的最速增長步長[20]，試驗設(shè)計見表2。

1.8 響應(yīng)面法（RSM）

通過最陡爬坡試驗趨近最優(yōu)點的臨近區(qū)域后，采用中心組合設(shè)計（central composite design，CCD）構(gòu)建模型，以響應(yīng)面法尋找最優(yōu)培養(yǎng)條件[21]。選取花粉管長度為響應(yīng)值，自變量為主要影響因素的水平。各因素編碼水平見表3。

1.9 數(shù)據(jù)分析

采用Design-Expert軟件和Microsoft Excel軟件統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 花粉萌發(fā)及花粉管生長的單因素選擇試驗

2.1.1 碳源的選擇 由圖1可知，幾種常見碳源中，蔗糖最易被大豆花粉利用，蔗糖處理下大豆花粉萌發(fā)率（68.96±3.01）%及花粉管長度（295.41±26.51） μm均為最高值；其次為麥芽糖，萌發(fā)率為（60.00±4.22）%，花粉管長度為（249.77±15.23） μm；葡萄糖、山梨醇等碳源對大豆花粉萌發(fā)的促進(jìn)作用較小。各碳源對萌發(fā)率、花粉管長度的影響達(dá)極顯著水平。由此確定大豆花粉萌發(fā)培養(yǎng)中選擇蔗糖作為碳源。

2.1.2 Ca2+源的選擇 使用CaCl2作為Ca2+來源進(jìn)行培養(yǎng)，大豆花粉萌發(fā)率為（68.96±3.01）%，花粉管長度為（295.41±26.51） μm，均高于使用Ca（NO3）2作為Ca2+來源的萌發(fā)率（57.98±4.93）%和花粉管長度（219.33±29.61） μm。由此確定選擇CaCl2在大豆花粉萌發(fā)培養(yǎng)中作為Ca2+來源。

2.1.3 植物生長調(diào)節(jié)劑的選擇 由圖2可以看出，不同的植物生長調(diào)節(jié)劑對大豆花粉萌發(fā)影響不同。添加GA3后，大豆花粉萌發(fā)率、花粉管長度分別為（75.65±2.74）%、（325.19±13.59） μm，均高于對照的萌發(fā)率（68.96±3.01）%、花粉管長度（295.41±26.51） μm；添加NAA后，萌發(fā)率（72.32±3.74）%比對照略有增加，花粉管長度（277.61±13.81） μm有所降低；添加2，4-D、6-BA均抑制了大豆花粉萌發(fā)。因此在培養(yǎng)基中加入合適濃度的GA3對大豆花粉萌發(fā)有促進(jìn)作用。

2.2 大豆花粉萌發(fā)主要影響因素的確定

利用Design-Expert軟件對Plackett-Burman試驗結(jié)果（表4）進(jìn)行分析，得到響應(yīng)值（花粉管長度）與各因素間的回歸模型：

式中：y為花粉管長度的預(yù)測值，x1、x2、…、x8為自變量編碼值。

由表5可知，該模型極顯著（P<0.01）；模型的調(diào)整確定系數(shù)為R2Adj=0.961 4，說明該模型能解釋96.14%響應(yīng)值的變化，試驗誤差小，因而該模型是合適的。x1、x5、x6為顯著影響因素（P<0.05），且均為正效應(yīng)，因此選取這3個因素的中心水平為原點進(jìn)行下步優(yōu)化。x3為負(fù)效應(yīng)，取低水平值；其他因素取中間水平。

2.3 最陡爬坡試驗

根據(jù)模型（1），得出x1、x5、x6的最速增長步長，由此形成12個試驗點的最陡爬坡試驗方案，實施結(jié)果見表6。由表6可以看出，直到第10個試驗點響應(yīng)值都是增加的，以后花粉管長度逐漸減小，說明花粉萌發(fā)的最優(yōu)條件在蔗糖18.75%、GA3 62 mg/L、初始pH值為6.5附近區(qū)域，因此采用RSM擬合新的二階模型進(jìn)一步優(yōu)化。

2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化培養(yǎng)條件

2.4.2 響應(yīng)面交互作用分析及優(yōu)化 RSM圖形是響應(yīng)值（y）對各試驗因素x1、x5、x6所構(gòu)成的三維空間曲面圖，從RSM分析圖上可以找出最佳參數(shù)以及各參數(shù)之間的相互作用，從RSM等高線圖上可以直觀地反映出各因素對響應(yīng)值的影響，從而分析各交互作用對花粉管長度的影響。

由圖3、圖4、圖5可以看出，蔗糖濃度、GA3濃度、初始pH值各因素之間存在著明顯的交互作用，且在低水平范圍內(nèi)，同時升高各因素可以提高花粉管生長量；提高過大會抑制花粉管生長。通過對模型（2）求導(dǎo)和解逆矩陣，可以得到模型的極值點：蔗糖19.2%、GA368.9 mg/L、初始pH值6.47、H3BO4 0.015%、CaCl2 0.05%、PEG-4000 7.5%、溫度25 ℃、時間 3 h，此時模型預(yù)測的最大響應(yīng)值為394.56 μm。采用上述優(yōu)化條件進(jìn)行培養(yǎng)驗證試驗，得到花粉管長度為 391.95 μm，與預(yù)測值相近，證明該模型能較好地預(yù)測花粉管生長；優(yōu)化后花粉萌發(fā)水平（花粉管長度391.95 μm）比優(yōu)化前（花粉管長度295.41 μm）提高32.68%。

3 結(jié)論與討論

植物花藥中花粉發(fā)育過程積累的淀粉是其萌發(fā)時重要的能量來源，淀粉積累的程度也可作為衡量花粉成熟的標(biāo)志之一[22]。但在離體培養(yǎng)環(huán)境下，只具備內(nèi)源的能量供給時難以完成花粉萌發(fā)和花粉管生長的過程，還需要通過人工技術(shù)盡量滿足植物激素、pH值、溫度等條件。對于一些自然環(huán)境下花粉難以萌發(fā)的珍貴物種，要以人工手段模擬甚至超越自然條件才能輔助其完成生殖過程。因此對于花粉離體培養(yǎng)萌發(fā)中涉及的各種因素及其重要性，需要進(jìn)行系統(tǒng)地分析優(yōu)化。生物過程優(yōu)化常用單因素法、正交法。單因素法只針對某一因素的影響，常用于確定某一因素的范圍，不能反映多因素的綜合效應(yīng)，難以取得優(yōu)化的最佳結(jié)果。正交法研究多因素多水平組合是一種高效率、經(jīng)濟(jì)的試驗方法，但只能對孤立的試驗點進(jìn)行分析，考慮因素之間的交互作用時，正交試驗次數(shù)會大大增加。單因素試驗確定初始培養(yǎng)條件后，采用Plackett-Burman設(shè)計法，可以用較少的試驗次數(shù)從眾多相關(guān)影響因素中篩選出主要影響因素，為進(jìn)一步的優(yōu)化試驗指明方向。響應(yīng)面分析法是1951年Box-Wilson開發(fā)的一種用于化學(xué)過程因子優(yōu)化的綜合性方法，采用多元二次回歸模型的方法，擬合各因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，可連續(xù)地對試驗的各個水平進(jìn)行分析，能快速對主要影響因素進(jìn)行優(yōu)化和評價，用于研究多因子系統(tǒng)中因子交互作用達(dá)到最大響應(yīng)值時所對應(yīng)的最佳條件[23]，是降低開發(fā)成本、優(yōu)化試驗條件、提高生產(chǎn)效率、解決實際生產(chǎn)問題的更為有效的方法。近幾年，響應(yīng)面法不僅在化學(xué)工業(yè)、生物學(xué)、醫(yī)學(xué)以及生物制藥領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，而且在食品學(xué)、工程學(xué)、生態(tài)學(xué)等方面也得到了應(yīng)用[24]。同時，響應(yīng)面法不僅用于各行業(yè)的優(yōu)化，還可以用于動力學(xué)常數(shù)的確定、酶穩(wěn)定性、動力學(xué)研究。本試驗采用Plackett-Burman設(shè)計法、最陡爬坡路徑法和響應(yīng)面分析法（RSM）中的Central-Composite設(shè)計相結(jié)合，對大豆花粉萌發(fā)的影響因素進(jìn)行研究，確定了培養(yǎng)基中添加蔗糖、CaCl2、GA3可以促進(jìn)花粉萌發(fā)；并篩選出蔗糖、GA3、初始pH值為影響花粉萌發(fā)的主要因素，且三者均為正效應(yīng)。響應(yīng)面法確定最佳培養(yǎng)條件為：蔗糖濃度19.2%、GA3濃度68.9 mg/L、初始pH值6.47、H3BO4 0.015%、CaCl2 0.05%、PEG-4000 7.5%、溫度25 ℃、時間3 h，此條件下，花粉管長度達(dá)391.95 μm，比優(yōu)化前 295.41 μm 提高32.68%。

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