鐘雪梅+代其林+馬明莉+滕守鎮(zhèn)+閆寧+呂旭才+馮帥+王勁

摘要： 以興油177品種油菜為材料，研究不同濃度外源NO供體硝普鈉（0、100、200、300、400、500、600 μmol/L SNP）浸種處理對100 mmol/L NaCl脅迫下油菜種子萌發(fā)及幼苗生長的影響。結(jié)果顯示，外源NO可顯著緩解鹽脅迫造成的損傷，促進種子萌發(fā)及幼苗生物量的積累；顯著提高幼苗葉片脯氨酸、可溶性蛋白的含量，以及抗氧化酶（SOD、POD、CAT）的活性；顯著降低MDA含量，其中以200 μmol/L SNP浸種處理的效果最為顯著。外源NO處理能夠顯著緩解鹽脅迫傷害，200 μmol/L SNP浸種處理效果最佳。

關鍵詞： 油菜；外源NO；NaCl脅迫；種子萌發(fā)；生理特性

中圖分類號： S634.301 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）03-0102-05

一氧化氮（NO）是植物體內(nèi)分布較廣的一種氧化還原信號分子，在植物體內(nèi)主要通過硝酸還原酶途徑、一氧化氮合酶途徑、非酶促途徑產(chǎn)生[1-4]。NO對植物具有保護和毒害的雙重效應，低濃度NO可作為抗氧化劑清除超氧陰離子（O-2[KG-*2]· ）等活性氧，并通過誘導抗氧化酶基因的表達對植物起到保護作用[5]；高濃度NO則與O-2[KG-*2]· 相互作用生成過氧亞硝酸陰離子，后者經(jīng)質(zhì)子化形成具有強氧化性的過氧亞硝酸，破壞生物大分子的結(jié)構(gòu)與功能。但NO的最終生理作用與植物細胞的生理條件及NO的濃度有關[6]。已有研究表明，NO廣泛存在于植物組織中，參與種子萌發(fā)及植株的生長發(fā)育、衰老、對各種逆境脅迫的應答過程[7-9]。 NO能顯著促進滲透脅迫下黃瓜、苜蓿、油松、小桐子、板藍根、小麥等種子的萌發(fā)和幼苗生長，緩解葉片氧化損傷，顯著提高SOD等保護酶的活性，增加脯氨酸等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)以增強幼苗的抗逆性[10-16]。NO還可增強番茄對光能的捕獲和轉(zhuǎn)換[17]，顯著促進棉花幼苗葉、根生長，增加根長、根表面積、根體積以緩解缺氮脅迫造成的傷害[18]。而目前關于NO用于油菜種子萌發(fā)的研究鮮有報道。以油菜為材料，通過NaCl模擬鹽脅迫，研究外源NO對鹽脅迫下油菜種子萌發(fā)的作用機制，以及對幼苗生長生理特性的影響，探討NO緩解鹽脅迫的生理機理，為生產(chǎn)實踐提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試油菜品種為興油177，購自四川省榮春種業(yè)有限責任公司。NO供體亞硝基鐵氰化鈉（SNP）購自上海市阿拉丁生化科技股份有限公司。NaCl為國產(chǎn)分析純。

1.2 試驗方法

選取飽滿均勻的油菜種子，采用75%乙醇消毒2 min，用蒸餾水沖洗3次。再用0.1% HgCl2溶液消毒 10 min，用蒸餾水沖洗5～6次，并用無菌吸水紙吸干備用。

1.2.1 最適鹽脅迫濃度篩選試驗 用蒸餾水分別配制濃度為0（對照）、50、100、150、200 mmol/L的NaCl溶液。每個培養(yǎng)皿放置100粒已消毒種子，加入25 mL處理液，每個處理3次重復，置于（25±1） ℃、16 h光照/8 h黑暗、相對濕度80%的組織培養(yǎng)溫室內(nèi)進行試驗。處理液每24 h更換1次。

處理后連續(xù) 7 d觀察種子萌發(fā)情況，以胚根凸出種皮長度大于等于種子長度的一半為發(fā)芽，計算發(fā)芽勢、發(fā)芽率。發(fā)芽8 d時于每個培養(yǎng)皿隨機選取5株幼苗，測定其芽長、根長，每個處理3次重復。

發(fā)芽勢=4 d內(nèi)正常發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%；發(fā)芽率=7 d內(nèi)正常發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%。

1.2.2 外源NO（SNP）浸種處理鹽脅迫試驗 用蒸餾水分別配制濃度為0、100、200、300、400、500、600 μmol/L的SNP溶液。將已消毒種子置于不同濃度SNP溶液中，于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗浸種12 h。浸種處理后將種子取出晾干，置于墊有 2層無菌濾紙的培養(yǎng)皿中，每皿 100 粒種子。加入100 mmol/L 的NaCl溶液25 mL（NaCl最適濃度由第1階段試驗得出），每個處理3次重復，置于組培室內(nèi)進行試驗，鹽脅迫溶液每24 h更換1次。試驗共設7個處理，分別命名為CK、T1、T2、T3、T4、T5、T6。處理后連續(xù)7 d觀察種子的萌發(fā)情況，計算發(fā)芽勢、發(fā)芽率。發(fā)芽8 d時，每皿隨機選取10 株幼苗測定其芽長、根長，稱量苗鮮質(zhì)量、根鮮質(zhì)量后置于恒溫干燥箱，于105 ℃殺青10 min，并于80 ℃烘干48 h，分別稱其干質(zhì)量。

處理10 d后，取樣并測定相關生理指標。采用氮藍四唑法測定超氧化物歧化酶（SOD）活性，采用愈創(chuàng)木酚法測定過氧化物酶（POD）活性，采用雙氧水法測定過氧化氫酶（CAT）活性。采用硫代巴比妥酸（TBA）法測定丙二醛（MDA）含量[19]，采用酸性茚三酮法測定脯氨酸含量[20]，采用考馬斯亮藍法測定可溶性蛋白含量[21]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用OriginPro 9.1軟件繪圖，采用DPS 7.5軟件進行方差分析和多重比較（Duncans法）。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源NO對油菜種子發(fā)芽勢及發(fā)芽率的影響

由圖1可知，不同濃度的外源NO浸種均可提高油菜種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率，且整體隨外源NO濃度的升高呈先上升、后下降的趨勢。其中，100～300 μmol/L的外源NO浸種效果較好，而200 μmol/L的外源NO浸種使發(fā)芽勢、發(fā)芽率達到最高值，分別比對照提高了15.33%、14.33%， 差異達顯著性水平（P<0.05）。

2.2 外源NO對油菜幼苗芽長和根長的影響

由圖2可知，外源NO浸種增加了鹽脅迫下油菜幼苗的芽長和根長，且隨著處理濃度的升高呈峰形變化，兩者變化趨勢一致。芽長、根長在200 μmol/L的外源NO浸種濃度下達到峰值，分別比對照高27.80%、30.33%，差異達顯著水平（P<0.05）。與對照相比，100～300 μmol/L濃度的作用效果較好，400～600 μmol/L濃度的效果次之，但均高于對照。

2.3 外源NO對油菜幼苗生物量的影響

由表1可知，外源NO浸種顯著提高了鹽脅迫下幼苗的生物量，整體呈先上升、后下降的趨勢。在200 μmol/L的外源NO浸種處理下，各項指標達到最高值，苗鮮質(zhì)量、苗干質(zhì)量分別高于對照55.46%、39.02%；根鮮質(zhì)量、根干質(zhì)量分別高于對照100%、75%。當NO浸種濃度大于200 μmol/L時，生物量的積累呈下降趨勢，但仍高于對照。

2.4 外源NO對油菜幼苗丙二醛和脯氨酸的影響

由圖3可知，在鹽脅迫下植物積累了大量膜脂過氧化的終產(chǎn)物MDA，而外源NO浸種處理顯著降低了MDA含量，T1至T6處理與CK相比均差異顯著（P<0.05）。200 μmol/L的外源NO作用效果最佳，MDA含量比對照降低56.08%。

脯氨酸是植物細胞內(nèi)的一類重要滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，可調(diào)節(jié)胞內(nèi)滲透勢保護蛋白分子，具有穩(wěn)定生物大分子結(jié)構(gòu)、清除活性氧的功能。由圖3可知，外源NO顯著促進了脯氨酸的積累，且200 μmol/L處理下作用最明顯，脯氨酸含量比對照高211.89%。

2.5 外源NO對油菜幼苗抗氧化酶及可溶性蛋白的影響

由圖4可知，外源NO浸種顯著提高了鹽脅迫下幼苗的抗氧化酶活性及可溶性蛋白含量，整體呈先上升、后下降的趨勢，4個指標的變化趨勢一致。200 μmol/L的NO處理作用效果最好，SOD、POD、CAT的活性及可溶性蛋白含量分別比對照增加了69.73%、480.84%、150.61%、324.10%。

3 討論

鹽分對種子的萌發(fā)主要產(chǎn)生離子效應和滲透效應2種作用[22]。發(fā)芽勢和發(fā)芽率是衡量種子活力的重要指標。由表2可知，種子萌發(fā)及幼苗生長的受抑程度隨鹽脅迫濃度的升高逐漸增強。當NaCl濃度達50 mmol/L時，發(fā)芽勢、發(fā)芽率、芽長、根長均高于對照，表明適宜的離子濃度有利于種子萌發(fā)?？赡苁怯捎陔x子滲入種子而降低了胞內(nèi)滲透勢，從而促進種子吸脹吸水[23]；也可能由于微量的Na離子對呼吸酶有激活作用，促使萌發(fā)所需物質(zhì)的合成更為充分[24-25]。當NaCl處理濃度達200 mmol/L時，油菜種子的萌發(fā)明顯受到抑制，各項指標與對照相比顯著降低，幼苗子葉發(fā)黃、卷曲、脫落，部分幼苗全株死亡?？梢姡啕}濃度的離子起到毒害作用，使膜蛋白及膜透性的正常生理結(jié)構(gòu)與功能發(fā)生改變[26]。幼苗芽與根的生長在鹽脅迫下均受到抑制，且芽長的受抑程度大于根長（表2），即隨著鹽脅迫濃度的升高，芽長的下降幅度大于根長，這與已有研究的結(jié)論[27-28]相一致。有研究表明這是植物耐鹽的一種機制，在鹽生植物中較為普遍。植物會主動利用攝入的鹽離子調(diào)節(jié)滲透壓，在不同組織及器官中協(xié)調(diào)分配離子以維護幼根生長，這使植物根中的NaCl含量低于地上部分[29-31]。綜上所述，低濃度NaCl對種子萌發(fā)及幼苗生長具有促進作用，高濃度則具有抑制作用，這與已有研究的結(jié)論[32-39]相一致。

鹽脅迫通過滲透脅迫和離子毒害抑制種子萌發(fā)及幼苗生長，而NO作為一種植物體內(nèi)的重要信號分子，能顯著緩解鹽脅迫造成的損傷。本研究結(jié)果表明，外源NO促進了 100 mmol/L NaCl脅迫下油菜的種子萌發(fā)及幼苗生長，其中低濃度（100～300 μmol/L）NO作用效果較好，400～600 μmol/L的NO次之，而200 μmol/L的NO處理效果最顯著，這與 Kazemi 等[40]、劉穎等[14]、蘇桐等[41]的研究結(jié)論一致。湯紹虎等研究發(fā)現(xiàn)，0.1 mmol/L SNP處理能顯著緩解滲透脅迫對黃瓜種子萌發(fā)及幼苗生長造成的傷害，而0.5 mmol/L SNP處理的作用顯著降低[10]。王文等研究表明，50～100 μmol/L的NO處理顯著減輕了苯丙烯酸對黃瓜幼苗的毒害，而200～400 μmol/L NO的緩解作用明顯降低，甚至抑制幼苗生長，其中100 μmol/L NO的作用效果最顯著[11]。徐艷等研究發(fā)現(xiàn)，300 μmol/L的SNP處理能顯著緩解滲透脅迫對梭梭種子萌發(fā)及幼苗生長的傷害，提高種子的萌發(fā)率，促進幼苗生物量的積累[42]。劉開力等研究表明，0.4 mmol/L SNP浸種處理種子可明顯緩解鹽脅迫下水稻幼苗的生長[43]。這可能是由不同種類植物對NO的敏感程度不同，且各試驗的具體處理方法不同造成的。

本試驗中，隨著外源NO處理濃度的升高，其緩解效應逐漸減小，表明NO調(diào)節(jié)植物生長具有雙重效應，這與已有研究的結(jié)論[10-18]相一致?？赡苁怯捎贜O通過質(zhì)外體作用于細胞壁組分，使細胞壁松弛，從而促進細胞擴展[44]。隨著NO濃度升高，NO作用于細胞膜的磷脂雙分子層，使膜的流動性增強。當NO濃度升高至一定程度，NO與超氧陰離子、過氧亞硝酸鹽作用，產(chǎn)生毒害效應[45]。

植物體內(nèi)MDA含量的高低反映了細胞膜氧化損傷的程度。本研究添加NO處理顯著降低了MDA含量，表明NO對細胞膜具有一定修復作用。可能是NO與活性氧（ROS）或脂質(zhì)過氧化自由基發(fā)生反應中斷了氧化脅迫，從而減輕了質(zhì)膜受氧化損傷的程度[46]。脯氨酸是植物體內(nèi)的一類滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，其含量高低一定程度上反映了植物的抗逆性。本研究結(jié)果表明，外源NO處理顯著提高了植物體內(nèi)脯氨酸的含量。脯氨酸不僅可作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，還在清除活性氧、提高抗氧化能力、穩(wěn)定大分子結(jié)構(gòu)、降低細胞酸性等方面起重要作用[47]。

逆境條件下，植物體內(nèi)ROS水平升高，膜脂過氧化程度加劇，導致細胞膜損傷與破壞[48]。SOD、POD、CAT是清除ROS的重要酶類。本研究結(jié)果表明，NO處理可顯著提高抗氧化酶的活性。NO可通過調(diào)節(jié)含血紅素鐵的CAT活性來抑制含非血紅素鐵的順烏頭酸酶等靶酶的活性，從而參與植物體內(nèi)的代謝調(diào)節(jié)過程[49]。大多數(shù)可溶性蛋白是參與各種代謝的酶類，具有較強的親水性，可提高細胞保水力并防止細胞脫水。本研究中，NO處理顯著提高了可溶性蛋白的含量，從而增強了植物的抗逆性。

4 結(jié)論

200 μmol/L的NO處理能顯著緩解100 mmol/L NaCl脅迫造成的損傷，顯著促進鹽脅迫下油菜種子的萌發(fā)，顯著提高幼苗葉片脯氨酸、可溶性蛋白的含量及SOD、POD、CAT的活性，顯著降低MDA的含量，多方面修復幼苗受到的損傷，從而增強幼苗的抗氧化脅迫能力。本研究對逆境中栽培作物具有一定參考價值，外源NO浸種處理在生產(chǎn)中簡便易行，是一種鹽脅迫下促進種子萌發(fā)及增強幼苗抗性的良好方法，具有一定潛在應用價值。

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