王清+梁鵬+李響+劉文波+林春花+鄭服叢+繆衛(wèi)國(guó)

摘要： Xanthmonas citri subsp. malvacearum （Xcm）是棉花角斑病的病原，由于缺乏適合的遺傳馴化體系，難于對(duì)其特定的基因進(jìn)行研究，所以建立高效的基因缺失突變系統(tǒng)，是迫切需要解決的問(wèn)題。采用去甲基化氮胞苷（5-AZA）馴化野生菌株Xcm 8號(hào)小種菌株V8和V8無(wú)細(xì)胞胞外物（CFEs）馴化重組質(zhì)粒pK18mobsacB：：N1012及pK18mobsacB：：m762這2種馴化方法，以來(lái)自V8的hpaXmN和hpaXm為靶基因驗(yàn)證其有效性。結(jié)果表明，成功獲得了△hpaXmN和△hpaXm突變體；雖然2種馴化方式都能獲得轉(zhuǎn)化子，但馴化菌株的電轉(zhuǎn)化效率是馴化質(zhì)粒的10～100倍。遺傳馴化體系的建立消除了Xcm V8由于限制修飾系統(tǒng)引起的轉(zhuǎn)化障礙，實(shí)現(xiàn)了特定基因的定點(diǎn)突變，為后續(xù)獲得Xcm V8其他基因缺失突變體奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： 棉花角斑病菌Xcm V8；遺傳體系；馴化；定點(diǎn)突變

中圖分類號(hào)： S435.621.2+5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2016）03-0153-05

黃單胞菌屬（Xanthomonas）是植物病原菌中較大的類群[1]，隨著細(xì)菌基因組學(xué)的發(fā)展，幾種主要致病菌[2-3]在 NCBI 里已經(jīng)得到測(cè)序，包括34種Xanthomonas campestris、1種Xanthomonas oryzae、1種Xanthomonas axonopodis。這使得T3SS效應(yīng)分子[4]、相關(guān)效應(yīng)蛋白[5-6]及hrp基因功能[7]等的研究更加深入。

電轉(zhuǎn)化技術(shù)是自1982年發(fā)展起來(lái)的，雖然廣泛應(yīng)用于細(xì)菌遺傳轉(zhuǎn)化的研究，但目前向原核細(xì)胞導(dǎo)入外源DNA仍很困難[8]。研究證實(shí)，以革蘭氏陰性細(xì)菌為代表的Haemophilus parasuis SH0165共有33個(gè)限制內(nèi)切酶和甲基轉(zhuǎn)移酶基因，限制酶通常和它相伴的修飾酶組合成限制修飾系統(tǒng)，Jansen等于1995年發(fā)現(xiàn)限制修飾系統(tǒng)是導(dǎo)致不同菌株轉(zhuǎn)化效率差異的重要因素[9]。R-M系統(tǒng)由Hha 1 endonuclease和Hha 1 methylase基因構(gòu)成，有報(bào)道認(rèn)為其能抑制細(xì)菌基因組外來(lái)的DNA交換引起的變化，降解異源DNA，進(jìn)而保護(hù)細(xì)菌[10]。

目前，對(duì)存在限制性修飾系統(tǒng)的細(xì)菌馴化方法主要有：（1）去甲基化氮胞苷（5-AZA）馴化野生菌株，得到R-M系統(tǒng)突變菌用于遺傳轉(zhuǎn)化[10]；（2）采用CFEs體外甲基化后的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Haemophilus parasuis，轉(zhuǎn)化效率由0提高到100～1 000 CFU/μg DNA[9]；（3）通過(guò)基因敲除構(gòu)建運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的限制修飾系統(tǒng)突變菌以提高電轉(zhuǎn)效率 [11] 。目前，已經(jīng)用5-AZA成功馴化的R-M系統(tǒng)突變的黃單胞菌水稻白葉枯病菌有國(guó)際通用的PXO99A和中國(guó)水稻白葉枯病菌的KS6-6A、OS198A和YN2A[10]。

油菜黃單胞菌錦葵致病變種Xanthmonas citri subsp. malvacearum（Xcm） 是棉花角斑病的致病菌，該病在全世界棉花種植區(qū)都會(huì)發(fā)生，但研究大多集中在棉花角斑病的危害、發(fā)病條件及致病小種分化等[12-13]。本研究分別采用馴化方法1和2，以Xcm 的8號(hào)小種 V8（簡(jiǎn)稱V8）的hpaXmN和hpaXm基因?yàn)槔齕14]，成功獲得△hpaXmN和△hpaXm突變菌，實(shí)現(xiàn)特定基因的定點(diǎn)突變，為后續(xù)獲得Xcm其他基因缺失突變體奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株和試劑

大腸桿菌感受態(tài)DH5α，購(gòu)自全式金公司；棉花角斑病菌Xanthmonas citri subsp. malvacearum（Xcm）V8菌株（8號(hào)小種），由筆者所在實(shí)驗(yàn)室從棉花上分離；質(zhì)粒pK18mobsacB，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)董漢松教授惠贈(zèng)。

卡那霉素（Km，50 mg/mL）、去甲基化氮胞苷（5-AZA）、Tris-base、乙酸鉀、二硫蘇糖醇、Na2EDTA、冰乙酸、S-腺苷甲硫氨酸溶液（SAM）、異丙醇、苯酚、氯仿等（solarbio）；核酸內(nèi)切酶BamHⅠ、XbaⅠ、T4 DNA Ligase酶、Primer STAR GXL聚合酶（TaKaRa）；質(zhì)粒提取試劑盒（南京捷貝斯）、膠回收試劑盒購(gòu)、純化試劑盒（TaKaRa）、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（天根）。

1.2 主要溶液的配制

參照吳東方的方法[9]配制。

1.3 重組質(zhì)粒pK18mobsacB：：N1012和pK18mobsacB：：m762的馴化

1.3.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 以V8菌株基因組DNA為模板，利用引物hpaXmN-U-F/hpaXmN-U-R，hpaXmN-D-F/hpaXmN-D-R分別PCR獲得hpaXmN-L 503 bp和hpaXmN-R 525 bp的片段（表1）。再利用hpaXmN-U-F和hpaXmN-D-R將上述2個(gè)片段通過(guò)overlap PCR[15]融合成1 020 bp的片段。接著對(duì)融合片段 BamHⅠ和 XbaⅠ 雙酶切獲得1 012 bp的片段，經(jīng)T4 DNA Ligase連在經(jīng)相同酶切的pK18mobsacB上，得重組質(zhì)粒pK18mobsacB：：N1012。同理引物hpaXm-U-F/hpaXm-U-R，hpaXm-D-F/hpaXm-D-R 分別PCR得hpaXm-L 305 bp和hpaXm-R 473 bp的片段，經(jīng)上述操作，得重組質(zhì)粒pK18mobsacB：：m762。所用酶切、連接等方法參照文獻(xiàn)[16]。

1.3.2 重組質(zhì)粒的馴化 提取V8菌株的CFEs和CFEs體外甲基化質(zhì)粒的反應(yīng)體系參照吳東方的方法[9]。

1.4 V8菌株的馴化

挑取活化的V8菌株單菌落接種于濃度為0.1 μmol/L的去甲基化氮胞苷（azacytidine，5-AZA） NA平板，長(zhǎng)出單菌落后，挑取單克隆接種于1 μmol/L 5-AZA的NA平板繼續(xù)篩選，直至得到適合做遺傳轉(zhuǎn)化且抗150 μmol/L 5-AZA的V8菌株[10]。

1.5 △hpaXmN和△hpaXm突變體的獲得

通過(guò)電轉(zhuǎn)化（1.8 kV，4 ms，BioRad），將“1.3”節(jié)獲得的質(zhì)粒導(dǎo)入V8菌株感受態(tài)細(xì)胞中[10]，在NA+Km平板上，28 ℃ 培養(yǎng)3～5 d，篩選抗性菌落，用于后續(xù)驗(yàn)證。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒馴化成功

2.1.1 重組質(zhì)粒構(gòu)建成功 hpaXmN-U-F/hpaXmN-U-R和hpaXmN-D-F/hpaXmN-D-R通過(guò)PCR得 hpaXmN-L（圖1泳道1～3）和hpaXmN-R（圖1泳道4～6），利用引物hpaXmN-U-F/hpaXmN-D-R通過(guò)overlap PCR，融合成hpaXmN-（L+R） 1 028 bp的片段（圖1泳道7～9）。hpaXm-U-F/hpaXm-U-R和hpaXm-D-F/hpaXm-D-R通過(guò)PCR擴(kuò)增hpaXm-L（圖2泳道1）和hpaXm-R（圖2泳道3），利用hpaXm-U-F/hpaXm-D-R，同上處理得hpaXm-（L+R）778 bp的片段（圖2泳道2）。

將 hpaXmN-（L+R）和pK18mobsacB經(jīng) BamHⅠ和XbaⅠ 雙酶切后連接，將重組質(zhì)粒pK18mobsacB：：N1012轉(zhuǎn)化DH5α，挑取陽(yáng)性克隆PCR驗(yàn)證，1、3、4質(zhì)粒擴(kuò)增出1 028 bp片段（圖3-A）；提取1、3、4質(zhì)粒酶切， 均酶切出1 012 bp的片段（圖4-A），測(cè)序比對(duì)與hpaXmN-（L+R）序列一致，說(shuō)明pK18mobsacB：：N1012構(gòu)建成功。同理將pK18mobsacB：：m762 的單克隆1、2、3、5擴(kuò)增出778 bp片段（圖3-B）；提取這4個(gè)單克隆質(zhì)粒酶切，1、2質(zhì)粒酶切出762 bp的片段（圖4-B），測(cè)序比對(duì)后與hpaXm-（L+R）序列一致，說(shuō)明pK18mobsacB：：m762構(gòu)建成功。

2.1.2 重組質(zhì)粒馴化成功 將未經(jīng)CFEs馴化的重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)菌株V8得不到轉(zhuǎn)化子（圖5-A），用CFEs馴化pK18mobsacB：：N1012和pK18mobsacB：：m762 后分別電轉(zhuǎn)菌株V8均能得到轉(zhuǎn)化子（圖5-B、圖5-C）。

2.2 菌株V8馴化成功

將重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)未經(jīng)5-AZA馴化的菌株V8得不到轉(zhuǎn)化子（圖6-A），將pK18mobsacB：：N1012和pK18mobsacB：：m762分別電轉(zhuǎn)經(jīng)過(guò)5-AZA馴化的菌株V8也都能得到轉(zhuǎn)化子（圖6-B、圖6-C）。

2.3 △hpaXmN和△hpaXm突變體驗(yàn)證成功

經(jīng)同源重組得到的轉(zhuǎn)化子依次在Km和10%蔗糖平板上完成2次同源單交換，故進(jìn)行分單交換子和雙交換子的驗(yàn)證。

2.3.1 突變體單交換子驗(yàn)證 引物hpaXmN-U-F/hpaXmN-D-R驗(yàn)證△hpaXmN，但缺失片段長(zhǎng)僅45 bp，通過(guò)PCR無(wú)法判斷該片段是否缺失（圖7）。hpaXm-U-F/hpaXm-D-R驗(yàn)證△hpaXm，通過(guò)PCR可知單交換子1、8、11發(fā)生單交換（圖8-A）；引物hpaXmF/R驗(yàn)證△hpaXm時(shí)，3、8、11質(zhì)粒能擴(kuò)增出長(zhǎng)為402 bp的片段（圖8-B），確定8、11質(zhì)粒發(fā)生單交換。

2.3.2 轉(zhuǎn)化子雙交換驗(yàn)證 通過(guò)hpaXmN-U-F/hpaXmN-D-R對(duì)雙交換子基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增無(wú)法辨別是否突變（圖9），故挑取雙交換子3～9送測(cè)。因?yàn)閔paXm基因組數(shù)據(jù)未知，但1.3已擴(kuò)增出495 bp的hpaXmN-L和 465 bp 的hpaXm-R，與已知序列長(zhǎng)度402 bp的hpaXm，組成長(zhǎng)度1 362 bp的片段，hpaXmN位于其中496～540號(hào)堿基，測(cè)序結(jié)果該序列缺失（圖10），即獲得△hpaXmN突變體。

利用引物hpaXm-U-F/hpaXm-D-R驗(yàn)證△hpaXm，顯示雙交換子4～9能擴(kuò)增出762 bp的條帶，與陽(yáng)性對(duì)照2相比，說(shuō)明4～9的基因缺失了1段（圖11-A）。hpaXmF/R驗(yàn)證△hpaXm時(shí)，4～9無(wú)法擴(kuò)增出長(zhǎng)度402 bp的hpaXm基因（圖11-B），即獲得△hpaXm突變體。

3 討論

基因敲除載體pK18mobsacB是Sehgfer等 1994 年在pK18基礎(chǔ)上導(dǎo)入蔗糖果聚糖酶反向篩選基因sacB改造而成的[17]。該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入宿主細(xì)胞后，由于其攜帶的突變基因與宿主菌基因組上的基因同源，經(jīng)2次同源單交換，即可獲得不含有任何抗性標(biāo)記基因的突變菌株，符合生物安全性要求，并且篩選效率高，已成功應(yīng)用于多種黃單胞菌的遺傳轉(zhuǎn)化[4-5]。

本研究嘗試分別采用CFEs馴化質(zhì)粒和5-AZA馴化菌株的方法，突破了野生菌株V8限制系統(tǒng)帶來(lái)的轉(zhuǎn)化障礙，獲得△hpaXmN和△hpaXm突變體。目前，CFEs體外甲基化重組質(zhì)粒的馴化方法僅適用存在R-M修飾系統(tǒng)或者提取條件不適用存在其他限制修飾系統(tǒng)的細(xì)菌[9]，且在黃單胞菌中暫時(shí)未見(jiàn)報(bào)道。本研究用CFEs馴化質(zhì)粒后電轉(zhuǎn)黃單胞菌株V8成功，但轉(zhuǎn)化效率很低，每1×108個(gè)感受態(tài)細(xì)胞僅獲得1～5個(gè)轉(zhuǎn)化子，電轉(zhuǎn)化頻率為1.0×10-8～1.0×10-7。5-AZA馴化菌株的方法已在黃單胞菌PXO99A上應(yīng)用成功[10]，V8菌株經(jīng)過(guò)馴化后，每1×108個(gè)感受態(tài)細(xì)胞獲得3～20個(gè)轉(zhuǎn)化子，電轉(zhuǎn)化頻率為1.0×10-7～1.0×10-6，轉(zhuǎn)化效率是前者的 10～100倍。關(guān)于2種馴化方法同時(shí)進(jìn)行時(shí)轉(zhuǎn)化效率如何，還未展開(kāi)研究。

雖然黃單胞中存在嚴(yán)格的修飾系統(tǒng)，但據(jù)報(bào)道合適的外源載體如pBluescript KS、pCR2.1-TOPO和pKNG101，已成功實(shí)現(xiàn)水稻白葉枯病菌Xoo和細(xì)菌性條斑病菌Xoc的基因突變[18-19]。目前，菌株V8轉(zhuǎn)化效率依然較低，未來(lái)仍要尋找穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化載體。

致謝：感謝南京農(nóng)業(yè)大學(xué)董漢松教授、宋從鳳教授、龍菊英老師、沈丹老師、紀(jì)洪濤博士、李萍碩士等給予的幫助。

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