劉超+支崇遠+李培林+易婷婷+張立微

摘要： 以浮游硅藻舟形藻（Planktonic diatoms Navicula）為受試藻，研究其在不同濃度Cu2+ 脅迫下生長和運動變化特征。試驗以96 h半致死濃度（EC50）、葉綠素a 含量及綜合運動等指標(biāo)研究Cu2+ 對舟形藻的毒性響應(yīng)。Cu2+ 對舟形藻 96 h EC50 值為 4.510 mg/L；Cu2+ 對舟形藻葉綠素a 累積最大抑制率為50%；運動速率在1.127 5 mg/L附近達到最高，表現(xiàn)出“中毒興奮”，隨后速率線性下降。舟形藻葉綠素a 含量對Cu2+ 反應(yīng)不敏感，其運動狀態(tài)可綜合指示Cu2+ 含量。利用舟形藻作為指示種來反映水體受Cu2+污染程度具有一定的可行性，同時可為農(nóng)業(yè)、工業(yè)及生活污水中的Cu2+監(jiān)測及評價提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞： 舟形藻；Cu2+ 脅迫；急性毒性；生長；運動

中圖分類號： X52 文獻標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2016）03-0373-03

Cu2+ 是舟形藻生長必需的微量營養(yǎng)元素之一，但當(dāng)其超過正常需求量時，Cu2+會對硅藻產(chǎn)生毒性作用[1-2]。隨著人類對環(huán)境的各類干預(yù)，環(huán)境中Cu2+ 濃度大大提高[3]。由于重金屬有著毒性大、不易被代謝及易被生物富集等特點，嚴重威脅著水生生物和人類的生存[4]。硅藻為水生生態(tài)系統(tǒng)的初級生產(chǎn)者，在整個生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)與能量流動中有著重要的作用[5]。進入硅藻中的 Cu2+ 可通過水生食物鏈食物網(wǎng)富集到高等動物體內(nèi)，最終進入人體危害人類健康，同時 Cu2+ 將影響硅藻細胞的種群增長，導(dǎo)致水生生態(tài)系統(tǒng)中初級生產(chǎn)力下降，進而破壞整個生態(tài)系統(tǒng)的平衡[6-7]。

貴州省貴陽市的小車河濕地作為居民飲用水源地之一，水質(zhì)長期以來受到Cu2+ 等重金屬的影響，其治理與監(jiān)測備受關(guān)注。本研究通過 Cu2+ 的急性毒性脅迫對舟形藻的生長和運動過程的觀察[8]，對舟形藻在相同脅迫條件下表現(xiàn)出不同的生長及運動特點進行了線性相關(guān)分析，為探索舟形藻對Cu2+ 毒性脅迫的響應(yīng)、舟形藻生長和運動速率與Cu2+濃度間的變化關(guān)系奠定研究基礎(chǔ)[9]，同時為舟形藻作為指示種，監(jiān)測水環(huán)境重金屬污染提供新角度[10]。

1 材料與方法

1.1 試驗藻種及培育方法

舟形藻采自貴州省貴陽市小車河濕地，應(yīng)用微藻微吸管分離方法分離。原液經(jīng)沉淀、過濾（0.45 μm 微孔濾膜），121.3 ℃滅菌 30 min。采用自制培養(yǎng)液加富的滅菌原液中培養(yǎng)。置于無菌培養(yǎng)室中培養(yǎng)，溫度（20±1） ℃，光照度 66 μmol/（m2·s），光-暗周期12 h-12 h，pH 值7.5 左右。經(jīng)預(yù)培養(yǎng)和擴大培養(yǎng)得到舟形藻純種，在獲得足夠藻液后進行試驗。微藻培養(yǎng)瓶定時搖動3次/d，預(yù)防附壁生長。

1.2 試驗儀器及設(shè)備

光學(xué)顯微鏡（深圳市新明光學(xué)儀器有限公司，XSP-2CA生物顯微鏡）、光學(xué)顯微鏡物鏡測微尺（深圳市新明光學(xué)儀器有限公司，C6 物鏡測微尺）、電子秒表（PC2810）、照相機（Nikon-COOLPIX5400）、載物片、血球計數(shù)板。

1.3 試驗方法

1.3.1 藻種擴大培養(yǎng) 試驗藻種在自制培養(yǎng)液加富的滅菌原液中進行擴大培養(yǎng)，自制培養(yǎng)基各成分質(zhì)量濃度為：NH4Cl 15 mg/L，MgCl2·6H2O 12 mg/L，MgSO4·7H2O 15 mg/L，KH2PO4 2.3 mg/L，NaHPO4 50 mg/L，F(xiàn)eC6H5O7·5H2O 50 mg/L，Na2EDTA·2H2O 45 mg/L，MnCl2·4H2O 160 mg/L，ZnSO4 25 mg/L，CoCl2·6H2O 10 mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.007 mg/L，維生素B12 0.5 mg/L，維生素B1 50 mg/L，維生素H 0.5 mg/L。

1.3.2 急性毒性試驗 試驗設(shè)置 1個空白組和 4個試驗組，根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果各組中Cu2+的質(zhì)量濃度分別為0、1.5、2.5、3.5、4.5 mg/L。硅藻初始含量為70 000 cells/mL。每個質(zhì)量濃度設(shè)置3個平行組，試驗所有容器和培養(yǎng)基均經(jīng)過121 ℃、20 min高壓蒸氣滅菌。試驗共進行96 h，0、24、48、72、96 h取樣后，使用血球計數(shù)板觀察及統(tǒng)計運動數(shù)據(jù)。觀察時，搖勻培養(yǎng)瓶至藻液顏色統(tǒng)一，每日定時取樣，取1 mL充分混勻的藻液，加適量魯格氏固定液（Lugol），混勻后取 200 μL 藻液用血球計數(shù)板計數(shù)，每個樣品計數(shù)3次，取平均值。之后按照下式計算出抑制率X=（I0-I）/I0×100%，以抑制率作圖，利用加權(quán)直線回歸法建立線性回歸方程，并計算各時間段的半致死濃度（EC50）值。

1.3.3 亞急性毒性試驗 設(shè)置1個對照組和4個試驗組，根據(jù)急性毒性試驗結(jié)果，設(shè)置質(zhì)量濃度分別為96 h EC50，96 h EC50/2，96 h EC50/4，96 h EC50/8。硅藻初始含量為7 000 cells/mL。容器為500 mL三角培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)體積為200 mL。共進行15 d，其他條件與“1.1”節(jié)相同。在試驗的前5 d每天對各組進行取樣，之后每2 d取樣1次，共取樣9次，每次取樣10 mL，其中5 mL 進行葉綠素a 含量測定并對硅藻細胞的運動狀態(tài)進行觀察。

1.3.3.1 葉綠素a含量測定 取5 mL藻液，應(yīng)用文獻[11]中葉綠素a含量的測定方法，對硅藻葉綠素a含量進行測定。

1.3.3.2 舟形藻運動狀態(tài)觀察與分析 對舟形藻的運動過程錄像，利用血球計數(shù)板上線的交點記錄硅藻的行動距離，并用秒表計時，對計數(shù)框內(nèi)硅藻的最大運動速率和平均運動速率進行計算。舟形藻運動狀態(tài)參數(shù)包括平均運動速率、最大運動速率和運動硅藻占總數(shù)的比率。通過錄像觀察，對計數(shù)框內(nèi)硅藻進行計數(shù)，得出硅藻總數(shù)和30 s內(nèi)所有運動硅藻數(shù)量，并記舟形藻運動2 μm所耗時間。以上過程按照計數(shù)框內(nèi)硅藻的數(shù)量重復(fù)3～5次，其中，最大運動速率取最大值，平均運動速率取平均值，運動硅藻占總數(shù)的比率取各計數(shù)框中運動硅藻總數(shù)占所有計數(shù)框中硅藻總數(shù)的比率。

2 結(jié)果與討論

2.1 Cu2+急性暴露對舟形藻的影響

在不同質(zhì)量濃度Cu2+脅迫下，舟形藻的生長曲線見圖1。與空白組相比，添加1.5、2.5 mg/L Cu2+的試驗組舟形藻的生長受到一定的促進，且促進程度與Cu2+ 質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，表現(xiàn)出明顯的毒性興奮效應(yīng)。在 2.5 mg/L試驗組中，在24 h時抑制率為 -2.44%，之后呈線性增加；而在3.5 mg/L、4.5 mg/L 試驗組中，在96 h時抑制率為0.23%、0.56%，表明其生長明顯受到抑制。

使用加權(quán)直線回歸法分析計算，Cu2+對舟形藻各時間的EC50和95% 置信區(qū)間見表1。各時間段EC50 值較為穩(wěn)定，都在4.510 mg/L左右，說明隨時間的延長Cu2+ 對舟形藻的毒性無降低，未產(chǎn)生長期毒性，不會對舟形藻產(chǎn)生持續(xù)性影響。

2.2.1 Cu2+對舟形藻葉綠素a含量的影響 在不同質(zhì)量濃度Cu2+ 脅迫下的藻液，經(jīng)過 15 d 培養(yǎng)，以葉綠素a 的質(zhì)量濃度為指標(biāo)的曲線見圖2。在開始脅迫的前3 d葉綠素質(zhì)量濃度有明顯的增加趨勢，與對照組差距很小，但隨時間的推移Cu2+ 對舟形藻葉綠素a含量的抑制作用漸漸增大，5 d時 4.510 mg/L 的質(zhì)量濃度下對葉綠素的抑制率達到50%，最終抑制率持續(xù)下降穩(wěn)定在30%左右。表現(xiàn)出一定的質(zhì)量濃度計量效應(yīng)。7～13 d葉綠素a含量保持穩(wěn)定，而在15 d時，各組葉綠素a含量均略有增加，這可能與Cu2+ 被從離子態(tài)代謝固化為相對穩(wěn)定的化合物有關(guān)。

2.2.2 Cu2+ 對舟形藻運動狀態(tài)的影響

2.2.2.1 Cu2+ 對運動硅藻數(shù)量占總硅藻數(shù)量比率的影響 添加不同質(zhì)量濃度Cu2+ 脅迫下的舟形藻，各組中運動硅藻數(shù)量占總硅藻數(shù)量比率見圖3。由圖3可知：在同等條件下隨時間增長運動硅藻數(shù)量占總硅藻數(shù)量的比率減小，暴露1 d后運動硅藻數(shù)量占總硅藻數(shù)量的比率未出現(xiàn)明顯變化。在 2～5 d期間，隨Cu2+質(zhì)量濃度增高硅藻占總硅藻的比率出現(xiàn)顯著下降。隨后，雖有一定降低趨勢，但是變化相對較小。由此可見Cu2+對運動硅藻的數(shù)量有一定影響。

2.2.2.2 Cu2+ 對硅藻平均運動速率的影響 經(jīng)過15 d的培養(yǎng)，以最快運動速率為指標(biāo)的曲線見圖4。前1～3 d 速率變化較穩(wěn)定，兩端相近，中間波動較大；之外其他的總體運動速率都隨質(zhì)量濃度的增高而降低，但是在4 d、2.255 mg/L 以及 7 d、1.127 5 mg/L 時出現(xiàn) 2 個異常值，平均運動速率分別達到1.0、1.3 μm/s，明顯偏高。但是與該組其他慢速運動硅藻相比，運動距離和時間均較短，快速運動2～5 s后就停止運動或轉(zhuǎn)為慢速運動。

2.2.2.3 Cu2+ 對硅藻最快運動速率的影響 經(jīng)過15 d的培養(yǎng)，以最快運動速率為指標(biāo)的曲線見圖5。除1 d和15 d速

率變化明顯之外其他的總體運動速率都隨質(zhì)量濃度在0.563 75 mg/L 和1.127 5 mg/L附近增高而增高，在2.255 mg/L 附近轉(zhuǎn)而降低。但是在4 d、1.127 5 mg/L 以及11 d、0.563 75 mg/L 時出現(xiàn)2 個異常值運動速率分別達到 0.8、1.03 μm/s，速度明顯降低。但是與該組與其他慢速運動硅藻相比，運動距離和時間均較短，快速運動5～7 s后就停止運動或轉(zhuǎn)為慢速運動。

3 結(jié)論

硅藻作為自然界中重要的初級生產(chǎn)者，對生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定起著重要作用。通過其在Cu2+脅迫下運動變化的研究，能為在水環(huán)境評價監(jiān)測、水污染治理等方面提供一定的理論依據(jù)。利用硅藻種類、數(shù)量及變化作為評價水生態(tài)環(huán)境質(zhì)量指示物種的做法由來已久，而利用硅藻運動速率變化對水質(zhì)中不同污染離子濃度測定的研究相對很少。相關(guān)研究表明，在眾多除藻劑中銅的殺藻作用有效、穩(wěn)定、價格低廉、且對人體健康的毒性作用低，目前在國外已有大量使用[12-14]。

本試驗就96 h EC50值（4.51 mg/L）來看，參照《水和廢水監(jiān)測分析方法》的規(guī)定[11]為中毒，與小球藻（55.62 mg/L）[15]低毒差距較大。原因是不同的藻類由于生存方式、運動類型及生存環(huán)境不同。另外部分Cu2+可能會被舟形藻富集代謝為相對離子態(tài)更為穩(wěn)定的化合物，對水生生物進而對水生生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生直接或間接的影響。

葉綠素a含量對Cu2+的反應(yīng)呈現(xiàn)一定的梯度變化，1～5 d 和對照組相比，葉綠素a的累積較快，表現(xiàn)出“促進”作用；6～11 d后含Cu2+各組與對照組出現(xiàn)一定差異（P<0.05），而在同一天含Cu2+各組差異較?。≒>0.05）?？梢娫寮毎腥~綠素a含量對Cu2+反應(yīng)敏感，少量Cu2+對葉綠素a 含量的累積有明顯促進作用，但是之后隨質(zhì)量濃度增大葉綠素a含量變化則逐漸降低，表現(xiàn)出一定的抑制作用；11～15 d，葉綠素a含量的累積出現(xiàn)一定的提高，可能與Cu2+被富集代謝而濃度降低有關(guān)[16]。

Cu2+急性毒性脅迫能顯著影響舟形藻的運動速率。低濃度0.563 75～1.127 5 mg/L 區(qū)間內(nèi) Cu2+脅迫能刺激舟形藻運動，使其表現(xiàn)出毒物的“興奮效應(yīng)”，隨著脅迫濃度的增大和脅迫時間的延長，Cu2+對舟形藻的運動表現(xiàn)出明顯的抑制效應(yīng)，在1.127 5 mg/L附近達到最高之后，速率線性下降，在2.255 mg/L趨近無脅迫速率。表明隨著脅迫濃度的提高，舟形藻細胞提高了對脅迫的適應(yīng)能力，抗性得到一定的增強。

硅藻在受Cu2+污染水質(zhì)處理的治理運用方面有一定的可行性，同時對農(nóng)業(yè)、工業(yè)及生活污水中的Cu2+監(jiān)測方面有廣闊的應(yīng)用前景[1，17]。本研究發(fā)現(xiàn)運動硅藻數(shù)量占總硅藻數(shù)量的比率和平均運動速率在2～3 d時變化較大，所以可以應(yīng)用這2個指標(biāo)在2～3 d時的值來對Cu2+的毒性進行綜合指示。

參考文獻：

[1]李國忱，劉錄三，汪 星，等. 硅藻在河流健康評價中的應(yīng)用研究進展[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報，2012，23（9）：2617-2624.

[2]張煥玲. 海洋浮游植物金屬元素含量對營養(yǎng)鹽水平的響應(yīng)研究[D]. 青島：中國海洋大學(xué)，2013：1-93.

[3]張 瑜，教奇楓. 淺談重金屬污染[J]. 建筑工程技術(shù)與設(shè)計，2015，32（5）：1256-1256.

[4]葛光環(huán)，寇 坤，陳愛俠. 濕地系統(tǒng)中植物和基質(zhì)對重金屬去除貢獻的研究現(xiàn)狀[J]. 當(dāng)代化工，2013，42（7）：1006-1008.

[5]高亞輝，梁君榮，陳長平，等. 海洋硅藻多樣性與生態(tài)作用研究[J]. 廈門大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2011，50（2）：455-464.

[6]師 玥. 青島大扁藻光合作用過程對重金屬Cu2+急性毒性脅迫的響應(yīng)研究[D]. 青島：中國海洋大學(xué)，2013：1-84.

[7]于小娣，師 玥，劉 泳，等. 重金屬脅迫對兩種海洋餌料微藻的急性毒性效應(yīng)研究[J]. 中國海洋大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2014，44（2）：53-59.

[8]周玉春，支崇遠，王 璐，等. 舟形藻的運動特征[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（11）：383-385，386.

[9]Harper M A，Harper J F. Measurements of diatom adhesion and theirrelationship with movement[J]. British Phycological Bulletin，1967，2（2）：195-207.

[10]蘇 婧. 三種海洋微藻種群增長和種間競爭的動態(tài)變化對Cd2+脅迫增強的響應(yīng)：基于流式細胞術(shù)的研究探討[D]. 青島：中國海洋大學(xué)，2011：46-55.

[11]《水和廢水監(jiān)測分析方法》編委會. 水和廢水監(jiān)測分析方法[M]. 4版. 北京：中國環(huán)境科學(xué)出版社，2002：1-9.

[12]支崇遠. 硅藻與環(huán)境[M]. 北京：海洋出版社，2005：1-142.

[13]郭金耀，楊曉玲. 鹽藻運動特性及其影響因素[J]. 水生態(tài)學(xué)雜志，2011，32（5）：91-93.

[14]郭 云. 烏江中上游底棲硅藻與水環(huán)境因子關(guān)系定量研究[D]. 貴陽：貴州師范大學(xué)，2008：60-71.

[15]Mclachlan D H，Brownlee C，Taylor A R，et al. Light-induced motile responses of the estuarine benthic diatoms Navicula perminta and Cylindrotheca closterium（Bacillariophyceae）[J]. Journal of Phycology，2009，45（3）：592-599.

[16]胡娜娜. 選擇富集培養(yǎng)可沉微藻用于污水處理深度凈化實驗研究[D]. 北京：北京建筑大學(xué)，2015：42-48.

[17]蔣曉霞. 阿哈水庫表層沉積物中重金屬時空變化對硅藻分布影響的研究[D]. 貴陽：貴州師范大學(xué)，2009：30-32.

[18]洪 佳，王振鐘，王麗麗，等. 金華江流域利用硅藻生物學(xué)特性監(jiān)測水質(zhì)研究[J]. 長江流域資源與環(huán)境，2014，23（9）：1283-1288.