白　云,陳　磊,朱寧波,李學武,才讓旦周,吳有林,田呈明*

(1 北京林業(yè)大學 林學院,北京 100083;2 青海省森林病蟲害防治檢疫站,西寧 810000;3 青海省海東地區(qū)北山林場,青海海東 810500)

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云杉矮槲寄生遺傳多樣性及其群體遺傳結構分析

白云1,陳磊1,朱寧波1,李學武1,才讓旦周2,吳有林3,田呈明1*

(1 北京林業(yè)大學 林學院,北京 100083;2 青海省森林病蟲害防治檢疫站,西寧 810000;3 青海省海東地區(qū)北山林場,青海海東 810500)

摘要:該研究采用CTAB法提取云杉矮槲寄生(Arceuthobium sichuanense)的基因組DNA,利用ITS1片段的序列信息對中國9個不同地理群體的62份云杉矮槲寄生樣本的遺傳多樣性及群體遺傳結構進行分析。結果表明:(1)62條ITS1序列共定義16個單倍型(H1～H16),表現出較低的遺傳多樣性水平(h=0.678 5,π=0.005 9),而群體間的遺傳多樣性水平則表現出較大差異(h=0～1.000 0,π=0～0.009 4);AMOVA分析顯示云杉矮槲寄生群體內的遺傳變異占到51.37%,群體間為48.63%。(2)Network單倍型網絡分析表明,單倍型H1和H12較為古老,且所有群體對2種單倍型無共享現象;單倍型H1是廣布單倍型,存在于青海和甘肅的6個群體中,單倍型H12僅在四川的2個群體中有分布。(3)基于最大似然法(ML)構建的群體聚類和中介鄰接法構建的單倍型網絡圖均顯示,四川的3個群體為獨立類群,區(qū)別于青海、甘肅群體,且甘肅和青海的群體之間沒有明顯分化。該研究首次報道了云杉矮槲寄生遺傳多樣性和遺傳結構,為進一步研究其進化及后續(xù)的病害防控提供了一定的參考。

關鍵詞:云杉矮槲寄生;遺傳多樣性;群體遺傳結構;單倍型

云杉矮槲寄生(Arceuthobiumsichuanense)是槲寄生科(Viscaceae)油杉寄生屬(Arceuthobium)的多年生半寄生性種子植物,分布于中國青海、甘肅、四川和西藏等高海拔地區(qū)[1]。云杉矮槲寄生主要寄生于云杉屬植物[1],目前已報道的寄主有青海云杉(Piceacrassifolia)、紫果云杉(P.purpurea)、川西云杉(P.likiangensisvar.balfouriana)、西藏云杉(P.spinulosa)和青杄(P.wilsonii)[1-2]。云杉矮槲寄生侵染成功后,造成寄主枝條組織增生膨大,產生大量下垂的掃帚狀叢枝,進而削減寄主生長量和材積產量,影響寄主的光合與蒸騰作用以及對水分和營養(yǎng)的吸收利用,同時削弱寄主抵御環(huán)境和其它病蟲害的能力,最終隨著感病級別的增加而死亡[3-5]。除此之外,云杉矮槲寄生還具有重要的生態(tài)學功能[3]。云杉矮槲寄生雌雄異株[1],主要依賴種子彈射進行近距離傳播[6],在林間呈聚集發(fā)生[7]。盡管有報道稱鳥類和一些哺乳動物可以攜帶矮槲寄生的種子進行遠距離的傳播[8],但在云杉矮槲寄生上尚未見報道。近年來,青海“三江源”地區(qū)的云杉天然林和人工林受到云杉矮槲寄生的嚴重危害,部分地區(qū)發(fā)病率高達90%以上,嚴重威脅了當地的森林健康和生態(tài)安全[9-10]。目前針對云杉矮槲寄生的研究主要集中于生物學特點、發(fā)病規(guī)律以及化學防治方面[2,4-7,11-12],缺乏對其群體遺傳背景的分析,制約了對病害流行成災原因的了解,從而影響了相關控制策略的制定。

了解寄生植物的遺傳多樣性及群體動態(tài)有利于理解寄生植物與寄主之間互作的生態(tài)、進化關系以及病原物的變異情況[13-14]。通常情況下,物種的生活史特點、分布以及與基因擴散有關的生態(tài)學過程均可以影響其遺傳結構[15]。對于種子植物來說,其交配系統(tǒng)對群體的遺傳分化也起著重要的作用[16-19]。而在寄生植物與寄主互作的系統(tǒng)中,寄生植物的生活史與其寄主植物、非寄主植物、花粉散播以及種子傳播機制均有著密切的關系[3,20-22]。因此,矮槲寄生與其它生物之間的互作可能影響著矮槲寄生的遺傳結構[13]。同時,由于寄生植物具有特殊的生活史策略,通常難以形成經典的遺傳多樣性和遺傳結構模式[13]。鑒于需要適應不同的寄主基因型,克服寄主的抗性選擇壓力,寄生植物會產生較高的遺傳多樣性水平[23-25],甚至高于其寄主植物[26-27],那些依賴特定寄主或者缺乏長距離傳播機制的寄生植物則會由于較低的基因頻率而導致地理適應性或寄主依賴性小種的形成,表現出較強的遺傳結構特征和地理距離隔絕[26,28]。事實上,不同的寄生植物會表現出不同的遺傳分化水平[23,26-27,29-32]。

在物種遺傳背景的研究過程中,不同的分子標記反映不同的影響因素。葉綠體基因標記反映了與地理相關的影響因素,而核基因標記則反映了與植物生育系統(tǒng)相關的影響因素[33]。核糖體基因(nrDNA)的內轉錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer,ITS)以高度串聯重復的方式存在于核基因組中,既具有核苷酸序列的高度變異性又有長度上的保守性[34],相比于編碼基因序列,其變異速度相對較快;與中高度重復序列和非編碼序列相比,又具有較高的保守性[35],已被廣泛用于被子植物的系統(tǒng)發(fā)育、分子鑒定、遺傳多樣性、種內變異以及DNA條形碼的相關研究[36-41]。本研究基于云杉矮槲寄生的ITS1序列,分析其群體遺傳多樣性及遺傳結構,以揭示中國云杉矮槲寄生的遺傳分化與其寄主種類、地理分布的關系,為進一步了解云杉矮槲寄生的傳播以及制定病害控制策略提供參考。

1材料和方法

1.1樣本采集

本研究于2013～2014年分別在青海、甘肅、四川等地采集9個地理群體的62份云杉矮槲寄生樣本(表1)。樣本采集地的主要生態(tài)因子數據來自中國氣象數據網1981～2010年30年間的氣象數據資料(http://data.cma.gov.cn/)。根據云杉矮槲寄生的種子彈射特點及其在林分內的空間分布格局[6-7],在受侵染林分的空間范圍,每個群體采集2～10株云杉矮槲寄生,相鄰云杉間隔10 m。采集時以被侵染的云杉小枝為單位,將云杉矮槲寄生植株裝入離心管中帶回實驗室,經液氮速凍后保存在-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2基因組DNA提取和ITS序列PCR擴增及測序

采用CTAB法提取云杉矮槲寄生的總基因組DNA[42],經瓊脂糖凝膠電泳檢測后,保存于-20 ℃冰箱備用。用引物18S1830(5′-AACAAGGTTTCCGTAGGTGA-3′)和26S40(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)對云杉矮槲寄生的ITS區(qū)域進行擴增[43-44]。所用引物由上海英駿生物技術有限公司合成。25 μL PCR反應體系包含2.5 μL 10×PCR buffer、2.5 μL dNTPs(2.5 mmol/L),上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL,0.75 UTaqDNA聚合酶,DNA模板10～30 ng,加dd H2O至總體積25 μL。擴增反應程序為94 ℃預變性5 min,94 ℃變性30 s,52 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,進行35個循環(huán),最后72 ℃延伸10 min。按DNA凝膠回收試劑盒(天根生化科技北京有限公司)說明書對PCR產物進行回收純化后,與pMD19-T載體連接,用大腸桿菌感受態(tài)細胞進行轉化,挑取陽性克隆搖菌后進行PCR檢測,轉化成功的菌液由北京三博遠志生物技術有限責任公司進行測序。

1.3數據處理與分析

利用DNAMAN軟件對正反序列進行拼接,并用Chromas軟件對序列峰圖進行人工校對。多序列比對用MEGA 5中的Clustal W進行操作。GC含量的測定用DNAStar軟件中的Editseq程序完成。利用DnaSP 5.1軟件[45]對各個群體進行遺傳多樣性評價。

利用MEGA5軟件構建最大似然法(maximum likelihood,ML)系統(tǒng)發(fā)育樹,并通過1 000次重復的自展程序進行標準檢測。用Arlequin 3.0軟件[46]中的分子變異分析程序(AMOVA)計算群體遺傳差異指數FST值,用于測量群體間的遺傳分化程度[47]。利用軟件Permut(http://www.pierrton.intra.fr/genetics/labo/software/permut)計算基于單倍型分化頻率和程度的群體遺傳分化系數NST和GST[48]。利用軟件Network 4.2.0.1[49]的中介鄰接法(Median-joining network)構建所有群體的單倍型網絡圖,以此進行ITS1單倍型分析。

2結果與分析

2.1ITS1序列多態(tài)性分析

云杉矮槲寄生的ITS1序列分析結果表明,ITS1序列長度為212 bp,沒有檢測到插入/缺失片段,包含了18個變異位點,其中9個為轉換位點,9個為顛換位點,分別占總長度的4.25%和4.25%。不同群體的ITS1序列的堿基含量存在差異,GC含量為36.79%～38.68%(表2)。云杉矮槲寄生9個群體的62個樣本共產生16個單倍型(表2)。其中單倍型H1出現頻率最高,占總樣本量的54.84%,僅在青海、甘肅6個群體的34個樣本中有出現;單倍型H12的出現頻率次之,占總樣本量的14.52%,僅出現在四川的2個群體的9個樣本中(表3)。

2.2云杉矮槲寄生群體遺傳多樣性分析

對所有群體的ITS1序列單倍型多樣性(h)和核苷酸多樣性(π)分析結果表明,云杉矮槲寄生表現出較低的遺傳多樣性水平(h=0.678 5,π=0.005 9),而單個群體間遺傳多樣性水平表現出較大的差異(h=0～1.000 0,π=0～0.009 4)。其中四川壤塘(SRT)群體具有最高的遺傳多樣性水平(h=1.000 0,π=0.009 4),四川爐霍(SLH)和甘肅夏河(GXH)的群體也具有較高的遺傳多樣性水平(h=0.800 0,π=0.006 0;h=0.800 0,π=0.004 7),而青海同仁(QTR)和甘肅合作(GHZ)的2個群體則表現出最低的遺傳多樣性水平(h=0,π=0;表3)。

各群體中的單倍型分布存在差異。其中,青海同仁(QTR)群體和甘肅合作(GHZ)群體只檢測到一種類型的單倍型,其它7個群體均檢測到2種或以上單倍型,四川爐霍(SLH)群體產生的單倍型最多，為5種。共享單倍型有4種(H1、H2、H11和H12),同時分布在多個群體中,其余12種單倍型僅在個別群體中出現。單倍型H1是廣布單倍型,在青海、甘肅的6個群體中均有分布,單倍型H2、H11和H12僅分布在2個相鄰的群體中。而在四川的3個群體中均未發(fā)現與青海、甘肅群體中相同的單倍型(表3,圖1)。

2.3云杉矮槲寄生群體遺傳結構分析

云杉矮槲寄生群體的分子變異(AMOVA)分析顯示其群體內變異為51.37%,群體間變異為48.63%(表4)。群體間遺傳差異指數FST值表現出較大的差異,分布在0～0.865 7之間,其中青海同仁(QTR)和四川壤塘(SRT)的2個群體之間表現出最高的遺傳分化程度。另外,四川的3個群體(SRT、SDF和SLH)與青海、甘肅的6個群體(QTR、QHZ、QMY、GHZ、GXH和GLQ)之間均具有顯著或極顯著的遺傳分化。同時,四川爐霍(SLH)、壤塘(SRT)、道孚(SDF)的群體之間也存在顯著的遺傳分化,而青海和甘肅的6個群體間的遺傳分化均不顯著(表5)。Permut軟件分析云杉矮槲寄生群體的遺傳分化系數結果為GST=0.421,NST=0.526,NST值顯著高于GST值,表明在全部群體水平上,ITS1單倍型具有明顯的分子譜系地理結構。

云杉矮槲寄生群體間的系統(tǒng)發(fā)育分析結果表明,四川的SRT、SDF、SLH群體聚在了一個小分支上,而青海(QTR、QHZ、QMY)、甘肅群體(GHZ、GXH、GLQ)沒有明顯分支(圖2)。基于中介鄰接法構建的單倍型網絡圖表現出與ML聚類類似的結果,以單倍型H1為節(jié)點形成了一個大的分支,以H11、H12為節(jié)點形成了2個小分支。H1位于整個單倍型網絡圖的最中心,而其它單倍型都是從單倍型H1經過一步或多步突變得到的,位列于整個單倍型網絡圖的外部節(jié)點上(圖3)。

餅圖代表各單倍型在該群體中的分布比例,

3討論

本研究基于云杉矮槲寄生ITS1的序列信息,分析了云杉矮槲寄生的遺傳多樣性及群體遺傳結構,表明云杉矮槲寄生整體上表現出較低的遺傳多樣性水平(h=0.6785,π=0.0059),這可能與其分

標尺代表進化距離；分支上數值表示自展支持率。

圓圈大小代表各單倍型頻率,不同顏色代表不同群體

變異來源Sourceofvariation自由度Df平方和Sumofsquares變異組成Variancecomponent變異所占比例Percentageofvariation/%P群體間Amongpopulations820.100.3248.63<0.001群體內Withinpopulation5317.960.3451.37<0.001總變異Total6138.070.66

表5　云杉矮槲寄生各群體間的FST值

注:**差異達極顯著水平(P<0.01);*差異達顯著水平(P<0.05)。

Note:** indicate most significant difference(P<0.01);* indicates significant difference(P<0.05).

布范圍有關。物種的遺傳多樣性受其生活史、種子散播和傳粉機制、交配系統(tǒng)、生殖模式、突變率以及突變機制等生物學特性的影響[15]。不同因素對物種遺傳變異大小的影響程度不同[50]。在物種水平上依次為分類地位>分布范圍>生活型>繁育系統(tǒng)>種子散布機制,而在群體水平上則變?yōu)榉庇到y(tǒng)>分布范圍>生活型>分類地位>種子散布機制[50]。就分布范圍而言,物種的分布范圍越廣,其遺傳多樣性越高,反之則越低[50]。云杉矮槲寄生分布于中國青海、甘肅、四川和西藏等高海拔地區(qū)[1],分布范圍較為狹窄,個體和群體數量較少,適應幅度小,基因交流不頻繁,遺傳變異的能力也較差,因而產生新的遺傳變異的機會也少,故有限的地理分布可能是其多樣性偏低的主要原因。而對于寄生植物來說,寄主的多樣性對寄生植物的遺傳多樣性水平也有重要的影響[13]。云杉矮槲寄生僅寄生于云杉屬植物[1],寄主范圍相對較窄,因此,對寄主的?；砸部赡苁菍е略粕及渭纳z傳多樣性水平較低的原因之一。

從本研究結果可以看出,云杉矮槲寄生群體具有明顯的遺傳分化,表現出了顯著的譜系地理結構,其群體遺傳分化系數(GST=0.421)均高于A.americanum的群體遺傳分化系數(GST=0.286)[26]和A.cyanocarpum、A.apachecum、A.blumeri的群體遺傳分化系數(GST=0.235)[51]。一方面,青海省南部的巴顏喀拉山是西北朝東南走向的山脈,其東面是若爾蓋草原,西面同可可西里的東緣相接,將青海與四川群體完全隔開[52],岷山山脈位于甘肅南部,川西高原北部,阻斷了四川與甘肅群體[53],從而阻礙了花粉的傳播,限制了群體間的基因交流,進而造成了云杉矮槲寄生群體之間分化程度的加大。然而,青海與甘肅采樣點間并無大的山系將其阻隔,且云杉苗木由于批量買賣可能導致基因交流較為頻繁,故6個群體間未形成明顯分化。另一方面,云杉矮槲寄生為雌雄異株植物,自然情況下可能通過風媒和昆蟲進行花粉傳播[3]。云杉矮槲寄生依賴種子彈射進行近距離傳播,其種子彈射的最遠距離為15 m[6],盡管矮槲寄生的種子可以通過鳥類和哺乳動物進行遠距離傳播[8],但尚未發(fā)現云杉矮槲寄生種子遠距離傳播的途徑,因而造成其群體之間缺少基因交流,而導致群體間明顯的遺傳分化。從本研究的結果來看,群體間的地理隔絕是導致云杉矮槲寄生群體分化的主要原因。而在美洲矮槲寄生遺傳結構的研究中也發(fā)現地理隔絕和不同寄主的共同作用促進了美洲矮槲寄生分化為3個小種[26]。然而,不同寄主來源的云杉矮槲寄生群體是否存在分化,還需要進一步研究探討。

依據矮槲寄生群體的遺傳多樣性水平和單倍型分布可以推斷其進化起源及遷移歷史[26]。從單倍型網絡圖與ML聚類結果可以看出,單倍型H1和H12存在于網絡圖的內部,均為祖先單倍型。而青海和甘肅的6個群體中均包含了古老的H1單倍型,推測可能青海和甘肅的云杉矮槲寄生群體本來屬于同一個古老的群體,隨后在各自的區(qū)域內,由于地理環(huán)境和寄主的不同發(fā)生了獨立進化,分化出新的單倍型。四川的3個群體中單倍型的演化網絡也有類似的結果,由祖先單倍型H12逐漸衍生出其它單倍型。

綜上所述,本研究基于ITS1序列,分析了云杉矮槲寄生的群體遺傳多樣性及遺傳結構,揭示了云杉矮槲寄生群體較低的遺傳多樣性,且具有明顯的地理譜系結構。本研究結果將對云杉矮槲寄生的進化、傳播和擴散的深入研究以及病害控制提供參考。

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(編輯:潘新社)

Genetic Diversity and Population Genetic Structure ofArceuthobiumsichuanense

BAI Yun1,CHEN Lei1,ZHU Ningbo1,LI Xuewu1,CAIRANG Danzhou2,WU Youlin3,TIAN Chengming1*

(1 College of Forestry,Beijing Forestry University,Beijing 100083,China;2 Forest Pest Control and Quarantine Station of Qinghai Province,Xining 810000,China;3 Beishan Farm of Qinghai Province,Haidong,Qinghai 810500,China)

Abstract:In this study,the total genomic DNA were extracted with CTAB method,and then the genetic structure of the Arceuthobium sichuanense from 9 different populations was analyzed according to the sequence of internal transcribed spacer 1 (ITS1).1)Sixteen haplotypes (H1-H16) were observed from 62 ITS1 sequences,showing a low level of genetic diversity (h=0.678 5,π=0.005 9) in the populations of A.sichuanense.However,there were larger differences of the level of genetic diversity (h=0-1.000 0,π=0-0.009 4) among different populations.The AMOVA analysis showed that the genetic variation within populations of A.sichuanense,accounted for 51.37%,while the genetic variation among populations was 48.63%.2)Haplotypes of network showed that H1 and H12 were relatively original in this study.Also,two haplotypes were not shared among all of populations.H1 exists widely in six populations from Qinghai and Gansu,and H12 only exists in two populations from Sichuan.3)Population clustering based on maximum likelihood and median-joining network based on maximum parsimony method indicated that the three populations from Sichuan are independent populations,while there is no significant differentiation between Gansu and Qinghai population.It is the first report about the genetic diversity and structure of A.sichuanense.The results will provide reference for the evolution and disease control of A.sichuanense.

Key words:Arceuthobium sichuanense;genetic diversity;population genetic structure;haplotype

中圖分類號:Q789

文獻標志碼:A

作者簡介:白云(1990-),女,在讀碩士研究生,主要從事森林病理學研究。E-mail:yunbai2013@163.com*通信作者:田呈明,教授,博士生導師,主要從事森林病理學研究。E-mail:chengmt@bjfu.edu.cn

基金項目:國家“十二五”林業(yè)科技支撐項目(2012BAD19B0702);林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(201204503)

收稿日期:2015-09-07;修改稿收到日期:2016-02-19

文章編號:1000-4025(2016)03-0458-09

doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.03.0458