齊丹+曹玉芬+田路明+董星光+張瑩+霍宏亮+常耀軍

摘要：探討云南地區(qū)砂梨種質(zhì)資源的遺傳背景，選用4對(duì)呈現(xiàn)多態(tài)性的葉綠體引物，對(duì)19個(gè)原產(chǎn)于云南省的砂梨品種和3個(gè)對(duì)照品種的trnL-trnF、rbcL、trnS-psbC區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果表明：4對(duì)引物的擴(kuò)增結(jié)果合并后得到長度為3 831 bp葉綠體基因片段，含有4個(gè)單倍型（H1～H4）、14個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，其中單一突變位點(diǎn)11個(gè)，簡(jiǎn)約信息性位點(diǎn)3個(gè)，插入/缺失（InDel）1個(gè)。19份砂梨種質(zhì)的單倍型（基因）多樣性（Hd）、核苷酸多樣性（Pi）分別為0.602、0.000 38。合并后的片段經(jīng)Tajimas D檢驗(yàn)其D值基本未達(dá)顯著水平，遵循中性模型。4個(gè)葉綠體單倍型的中介網(wǎng)絡(luò)顯示：?jiǎn)伪缎虷1與H2、H3的親緣關(guān)系較近，而H4則與上述3個(gè)單倍型的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。經(jīng)葉綠體單倍型分析可知，云南砂梨地方品種的遺傳多樣性較為豐富。

關(guān)鍵詞：砂梨；葉綠體DNA；遺傳多樣性；親緣關(guān)系

中圖分類號(hào)： S661.203.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼：

文章編號(hào)：1002-1302（2016）08-0209-03

云南省位于我國西南地區(qū)，其西北部為橫斷山脈區(qū)，東南部為云貴高原，地形地貌復(fù)雜，植物種質(zhì)資源豐富，是中國梨的起源地之一，原產(chǎn)梨種質(zhì)資源有川梨（Pyrus pashia Buch-Ham.）、砂梨（P.pyrifolia Nakai.）、滇梨（P.pseudopashia Yü.）、豆梨（P.calleryana Dcne.），其中砂梨是云南省地方栽培梨品種的主體，分布于云南省大部分地區(qū)，地方優(yōu)良品種諸多，如寶珠梨、巍山紅雪梨、富源黃皮梨、火把梨等[1]。了解地方品種的遺傳多樣性和親緣關(guān)系，對(duì)揭示云南省砂梨資源的起源、保護(hù)及利用有重要意義。

DNA分子標(biāo)記技術(shù)，如RAPD、AFLP、SSR、IRAP等，已經(jīng)廣泛應(yīng)用在果樹植物遺傳多樣性、品種鑒定、親緣關(guān)系等研究領(lǐng)域[2-5]。葉綠體DNA（cpDNA）在大多數(shù)被子植物中屬母系遺傳，分子較小、高拷貝、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、保守性強(qiáng)，且沒有或很少經(jīng)歷重組，其中的非編碼區(qū)域變異豐富，適于進(jìn)行低分類階元系統(tǒng)起源、發(fā)育和進(jìn)化研究[6]。cpDNA非編碼區(qū)序列在梨屬植物的野生群體和栽培品種的群體結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)發(fā)生地理學(xué)、進(jìn)化、遺傳多樣性研究上都有應(yīng)用[7-13]。本研究從母系遺傳的角度出發(fā)，對(duì)葉綠體非編碼區(qū)trnL-trnF，trnS-psbC和rbcL區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，分析云南省砂梨資源的親緣關(guān)系和遺傳多樣性。

1材料與方法

1.1材料

19份中國砂梨、2份日本砂梨（豐水、長十郎）、1份川梨（酸罐梨）來自遼寧省興城市中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所國家果樹種質(zhì)興城梨、蘋果圃。所有材料（表1）的葉片經(jīng)液氮處理后保存于-70 ℃冰箱備用。

1.2方法

使用QIGEN試劑盒方法提取總DNA，4對(duì)葉綠體通用引物參照常耀軍等的試驗(yàn)結(jié)果[14][生工生物工程（上海）股份有限公司合成]。對(duì)22份材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠檢測(cè)，得到清晰的特異性條帶后，純化后交上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司（北京）測(cè)序。

2結(jié)果與分析

2.1變異位點(diǎn)鑒別和cpDNA單倍型多樣性

本試驗(yàn)所用4對(duì)引物擴(kuò)增所涉及的葉綠體DNA序列分別是trnL-trnF（P2、P3）、trnS-psbC（P9）、rbcL（CP03），其中P2、P3引物擴(kuò)增的是trnL-trnF序列的不同區(qū)域。通過MEGA 5.2軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列排比，并進(jìn)行人工校正，序列長度分別為561 bp（trnL-trnF，P2）、448 bp（trnL-trnF，P3）、1 537 bp（trnS-psbC，P9）、1 285 bp（rbcL，CP03），合并后的長度為3 831 bp；多態(tài)性位點(diǎn)14個(gè)，其中單一突變位點(diǎn)11個(gè)，簡(jiǎn)約信息性位點(diǎn)3個(gè)，8 bp（TCAATTAG）的堿基插入/缺失（InDel）1個(gè)（表2）。

2.2單倍型的中介網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

利用軟件NetWork ver 4.6.1.2，采用中介鄰接網(wǎng)絡(luò)算法和最大簡(jiǎn)約算法分別計(jì)算和優(yōu)化結(jié)果，構(gòu)建試驗(yàn)材料4個(gè) cpDNA 單倍型間的關(guān)聯(lián)圖，其中單倍型、中介矢量載體的名稱分別為HAP、mv，結(jié)果見圖1。21個(gè)砂梨品種存在3種單倍型：HAP_1、HAP_2、HAP_3，3種單倍型包含的品種數(shù)目分別為5、5、11個(gè)，2個(gè)日本砂梨品種豐水和長十郎及昆明麻、秋白砂、野生砂梨同為H2。川梨品種酸罐梨獨(dú)有單倍型H4，與其他砂梨品種相比，在trnL-trnF-448區(qū)域（P3）中，有長達(dá)8 bp的堿基插入-缺失片段（TCAATTAG）。圖1顯示HAP_2包含HAP_3，位于中介網(wǎng)絡(luò)圖的軀干上，說明HAP_2和HAP_3的分化時(shí)間要早。HAP_1和HAP_2由mv1連接，HAP_2和HAP_4由mv2連接。在變異位點(diǎn)上，HAP_2和HAP_3有1個(gè)差異，HAP_1和HAP_2有1個(gè)差異，HAP_1和HAP_3有2個(gè)差異，HAP_4和HAP_2有13個(gè)差異，且含有8 bp （TCAATTAG）的堿基插入-缺失片段。

3討論與結(jié)論

單倍型H1的5個(gè)品種巴克斯、花紅、水汁梨、海東和牛頭的原產(chǎn)地位于滇西北地區(qū)。滇西北麗江梨區(qū)為橫斷山脈的一部分，立體地形復(fù)雜，屬于高原氣候[15]。推測(cè)單倍型H1的品種起源于該地區(qū)，由于地理隔離導(dǎo)致的生殖隔離，使其單獨(dú)聚為1組，該情況與貴州砂梨種質(zhì)資源遺傳多樣性的ISSR分析結(jié)果相似[16]。單倍型H2、H3的品種分布范圍較廣泛，其中原產(chǎn)云南的品種除滇西北地區(qū)以外均有分布，單倍型多樣性體現(xiàn)了地理分布特點(diǎn)。來自日本的砂梨品種長十郎、豐水及野生砂梨、昆明麻、秋白砂同為H2，日本砂梨在日本沒有發(fā)現(xiàn)，野生種，也沒有相關(guān)的記載[17]，從葉綠體母系遺傳的角度分析其母系祖先可能同為野生砂梨。沈玉英等在用RAPD分析部分中國砂梨和和日本梨的研究中發(fā)現(xiàn)，秋白砂梨與長十郎顯示最高的相似系數(shù)[18]，本研究中秋白砂梨與長十郎的單倍型相同，從母系遺傳角度說明二者的親緣關(guān)系很近。

這些不同類型的變異組成了4種不同類型的單倍型，單倍型多樣性Hd為0.675，其中云南省地方砂梨品種的Hd值為0.602，與遼寧省地方梨品種的0.577相比稍高[14]，由于研究所用的引物相同，推測(cè)云南省梨種質(zhì)資源多樣性更為豐富，低于福建省地方砂梨品種的Hd值0.660[19]、浙江省野生豆梨群體的Hd值0.719[8]和云南省野生川梨的Hd值 0.718[9]，分析其主要原因在于所選用的引物不同以及野生群體表現(xiàn)出更強(qiáng)的遺傳多樣性。

川梨起源于中國西南地區(qū)和喜馬拉雅山區(qū)，因此被視為東方梨和西方梨之間的過渡種[9]，本研究所選用的對(duì)照品種酸罐梨為原產(chǎn)于云南省的川梨品種。對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，在trnL-trnF-448區(qū)域（P3）中，有長達(dá)8 bp的堿基插入（InDel），而在云南砂梨品種和日本砂梨品種中這段序列缺失，為川梨品種酸罐梨獨(dú)有，表明InDel作為1次突變事件，可用于系統(tǒng)發(fā)育分析，為闡明梨屬植物種間關(guān)系提供了重要信息來源[20-21]。云南地區(qū)的梨屬種質(zhì)資源豐富，建議加強(qiáng)對(duì)云南省地方梨栽培品種和野生種的保護(hù)和利用，豐富梨育種基因庫。

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