朱健，范菲菲，趙麗華，彭艷，張志紅

(1.貴州大學(xué)資源與環(huán)境工程學(xué)院，貴州　貴陽550025；2.貴州省土壤肥料研究所，貴州　貴陽550006；

3.貴州民族大學(xué)化工與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，貴州　貴陽550025)

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銅對海菜花種子萌發(fā)及幼苗生長的影響

朱健1，范菲菲2，趙麗華1，彭艷3，張志紅1

(1.貴州大學(xué)資源與環(huán)境工程學(xué)院，貴州貴陽550025；2.貴州省土壤肥料研究所，貴州貴陽550006；

3.貴州民族大學(xué)化工與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽550025)

摘要：采用營養(yǎng)液培養(yǎng)法，研究了不同銅離子(Cu(2+))濃度(0mg/L、0.1mg/L、0.2mg/L、0.5mg/L、1mg/L、2mg/L、5mg/L、10mg/L)對海菜花種子萌發(fā)及幼苗生長指標(biāo)及部分生理指標(biāo)變化的影響。結(jié)果表明，各濃度處理(0.1～10mg/L)Cu(2+)對海菜花種子發(fā)芽率與對照均無顯著差異(p>0.05)；海菜花種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)與活力指數(shù)整體表現(xiàn)出隨Cu(2+)處理濃度的增加呈下降趨勢，當(dāng)Cu(2+)處理濃度較高時(shí)，與對照差異顯著(p<0.05)。Cu(2+)明顯降低海菜花葉片中葉綠素a、b及類胡蘿卜素含量，且與對照差異顯著(p﹤0.05)。隨著Cu(2+)濃度的增加，超氧化歧化酶(SOD)活性、過氧化物酶(POD)活性、可溶性蛋白質(zhì)含量先升高后降低；過氧化氫酶(CAT)呈持續(xù)降低趨勢，且與對照差異顯著(p<0.05)。該研究結(jié)果為海菜花的保護(hù)提供了一定的理論支持。

關(guān)鍵詞：銅；海菜花；發(fā)芽；葉綠素；抗氧化酶系統(tǒng)；可溶性蛋白質(zhì)

海菜花(Otteliaacuminatas)屬于水鱉科(Hydrocharitaceae )，是中國特有三級重點(diǎn)保護(hù)高原淡水植物，其生長對水質(zhì)要求很高，對水生生態(tài)系統(tǒng)具有重要的生態(tài)作用[1]。近年來，隨著環(huán)境中重金屬污染加劇，水質(zhì)惡化，中國海菜花的分布急劇減少，而重金屬對海菜花種子發(fā)芽的毒害作用還鮮見報(bào)道。銅(Cu2+)作為植物生長過程中一種重要的微量元素，對植物的生長、發(fā)育有著重要影響。但Cu2+可在植物體內(nèi)誘發(fā)產(chǎn)生過氧化氫、超氧陰離子、羥基自由基等活性自由基，可以氧化生物大分子，甚至使細(xì)胞死亡，從而對植物產(chǎn)生毒害作用[2]。因此，本試驗(yàn)以海菜花種子為試材，探討重金屬Cu2+對海菜花種子萌發(fā)和抗氧化酶系統(tǒng)的影響，初步揭示銅對海菜花毒性的作用機(jī)理，以期為海菜花的保護(hù)提供一定的理論支持。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

供試海菜花種子于2013年11月上旬采自貴州省貴陽市花溪區(qū)花溪水庫，挑選籽粒飽滿，大小均勻的種子用于試驗(yàn)。各分析純、生化純試劑都用超純水配制。

1.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將用分析純CuSO4·5H2O和1/10濃度Hoagland營養(yǎng)液配制Cu2+濃度分別為0mg/L、0.1mg/L、0.2mg/L、0.5mg/L、1mg/L、2mg/L、5mg/L、10mg/L溶液，置于鋪有2層濾紙的直徑9cm培養(yǎng)皿中，分別挑選飽滿的海菜花種子各20粒，蓋好玻璃培養(yǎng)皿，置于溫度25±1℃，光照強(qiáng)度2 000lx，14h/d，濕度80%的人工氣候培養(yǎng)箱中進(jìn)行萌發(fā)試驗(yàn)，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。樣品放入后每天添加適量的超純水補(bǔ)償損失水分。種子露白即認(rèn)作發(fā)芽，培養(yǎng)14d后測定葉綠素、類胡蘿卜素、可溶性蛋白含量，超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD) 和過氧化氫酶(CAT)活性。

1.3分析方法

1.3.1發(fā)芽指標(biāo)測定方法

發(fā)芽率(GR)=14d內(nèi)正常發(fā)芽的種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%；發(fā)芽勢(GP)=萌發(fā)前7d發(fā)芽數(shù)之和/供試種子數(shù)×100%；發(fā)芽指數(shù)(GI)=∑Gt/Dt(Gt為第t天的發(fā)芽數(shù)；Dt為相應(yīng)發(fā)芽天數(shù))；活力指數(shù)=GI×S(GI為發(fā)芽指數(shù)；S為幼苗平均總長度，單位cm)[3]。

1.3.2葉綠素、類胡蘿卜素含量測定

取處理幼苗相同葉齡部位葉0.5g，以80%丙酮提取，用分光光度計(jì)測定665nm、649nm、470nm吸光度[4]。

1.3.3SOD、POD、CAT活性和可溶性蛋白質(zhì)含

量測定

取處理植株相同葉齡葉片，加入少量0.1mol/LpH7.8的磷酸緩沖液，置冰浴研磨勻漿，離心(12 000r/min，4℃，15min)，上清液用于酶活性與可溶性蛋白含量的測定。SOD活性測定采用NBT光化還原法[4]，POD活性采用愈創(chuàng)木酚法[4]，CAT活性采用南京建成科技有限公司CAT試劑盒測定?？扇苄缘鞍缀坎捎每捡R斯亮藍(lán)G-250法測定[5]。

1.4數(shù)據(jù)處理與分析

所得數(shù)據(jù)用SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，變化趨勢圖用origin8.0繪制。

2結(jié)果與分析

2.1銅脅迫對海菜花種子發(fā)芽的影響

由表1可知，在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，各濃度Cu2+處理的海菜花種子發(fā)芽率與對照相比均無顯著差異(p>0.05)。海菜花種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)與活力指數(shù)整體表現(xiàn)出隨Cu2+處理濃度的增加呈下降趨勢，當(dāng)Cu2+處理濃度較高時(shí)，與對照差異顯著(p<0.05)。

2.2銅脅迫對海菜幼苗生長的影響

由表2中可知，各濃度Cu2+脅迫處理下，海菜花幼苗長度、根長、根數(shù)均隨Cu2+離子濃度增加而下降，且均與對照差異顯著(p<0.05)；當(dāng)Cu2+濃度達(dá)到10mg/L時(shí)，海菜花的幼苗長抑制率達(dá)到88.2%，根的生長被100%抑制。Cu2+脅迫質(zhì)量濃度<0.5mg/L時(shí)，Cu2+離子對幼苗葉片數(shù)無明顯影響，當(dāng)Cu2+濃度≥1mg/L時(shí)，海菜花幼苗葉片數(shù)隨Cu2+離子濃度的升高而減少，且與對照差異顯著(p<0.05)。由此說明，隨著Cu2+脅迫濃度的增大，Cu2+對海菜花幼苗生長的抑制作用增大。

表1　Cu2+對海菜花種子發(fā)芽的影響

注：同一列不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05)，表2～4同。

表2　Cu2+對海菜花根、芽的影響

2.3銅脅迫對海菜花光合色素含量的影響

葉綠素含量很大程度上反映了植物的光合作用能力，葉綠素與光合速率、營養(yǎng)狀況關(guān)系密切，逆境條件下，葉綠素含量是表征植物受傷害程度的指標(biāo)之一。由表3可知，Cu2+濃度在0.1～10mg/L范圍內(nèi)，海菜花幼苗中葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量隨Cu2+處理濃度的增加而逐漸降低。當(dāng)Cu2+濃度為10mg/L時(shí)，葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量分別僅為對照組的2.1%、7.9%、2.3%，說明高濃度的Cu2+顯著抑制了葉綠素的合成。

表3　Cu2+對海菜花光合色素含量的影響

2.4銅對海菜花葉片中抗氧化酶系統(tǒng)的影響

SOD、POD、CAT 3種抗氧化酶活性與植物抵御外界脅迫能力密切相關(guān)。由表4可知，Cu2+在0～10mg/L范圍內(nèi)，SOD活性整體表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，當(dāng)Cu2+濃度為1mg/L時(shí)，SOD活性最大，為對照的11.43倍，且與對照差異顯著(p<0.05)；當(dāng)Cu2+濃度為10mg/L時(shí)，SOD活性仍比對照高3.3倍。POD活性變化規(guī)律與SOD相似，也呈現(xiàn)先升高后降低趨勢,Cu2+濃度為2mg/L時(shí)，POD活性達(dá)到最高值，且與對照差異顯著(p<0.05)，但在最大10mg/L Cu2+處理時(shí)，其活性與對照無顯著差異。由此可見，SOD的耐受性比POD強(qiáng)。而CAT活性的變化規(guī)律則與SOD、POD活性的變化規(guī)律不同，表現(xiàn)出隨Cu2+濃度升高而逐漸降低，且均與對照差異顯著(p<0.05)。當(dāng)Cu2+濃度為10mg/L時(shí)，海菜花幼苗的CAT活性被抑制了83.9%，由此可見，CAT對Cu2+脅迫的耐受性較差。

表4　Cu2+對海菜花幼苗中抗氧化系統(tǒng)酶活性的影響

2.5銅對海菜花幼苗中可溶性蛋白質(zhì)含量的影響

植物體內(nèi)的可溶性蛋白質(zhì)主要是參與各種代謝的酶類，其含量是了解植物體生理的一個(gè)重要指標(biāo)。由圖1可知，隨著Cu2+處理濃度的增加，海菜花幼苗中的可溶性蛋白質(zhì)含量表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，在Cu2+處理濃度為5mg/L時(shí)，達(dá)到最大值，且與對照差異顯著(p<0.05)，隨后開始下降，由此表明，海菜花在受Cu2+脅迫時(shí)體內(nèi)能產(chǎn)生一些抗性蛋白抵御外界脅迫，但處于高濃度Cu2+脅迫時(shí)，這種抵御機(jī)制受到破壞，可溶性蛋白質(zhì)含量降低。SOD、POD活性先升高后降低的變化趨勢也證明了可溶性蛋白質(zhì)含量的這種變化規(guī)律。

圖1　　　　不同Cu2+處理對海菜花幼苗中可溶性蛋白質(zhì)

3討論

試驗(yàn)結(jié)果表明，Cu2+脅迫對海菜花種子的發(fā)芽率無顯著影響是由于其種皮的保護(hù)作用。種子萌發(fā)前期階段主要利用種子自身儲(chǔ)存的營養(yǎng)物質(zhì)，外部污染物質(zhì)無法進(jìn)入其內(nèi)部參與萌發(fā)的前期過程，所以對其發(fā)芽率無顯著影響。然而與發(fā)芽率不同的是海菜花種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)與活力指數(shù)隨著外源Cu2+濃度的增大而呈現(xiàn)逐漸降低趨勢，這與程召貫等對小麥(Triticumaestivum)種子萌發(fā)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致[6]。說明高濃度的Cu2+對海菜花種子萌發(fā)具有抑制作用，其可能是高濃度Cu2+能部分通過種皮進(jìn)入種子內(nèi)部，抑制了海菜花種子的萌發(fā)[7]。

幼苗生長過程和種子萌發(fā)過程營養(yǎng)物質(zhì)利用途徑不同，因此幼苗生長過程的Cu2+脅迫與發(fā)芽階段的Cu2+脅迫影響不同。Cu2+脅迫對海菜花幼苗的芽長、根長、葉片數(shù)和根數(shù)均有不同程度的影響，高濃度的Cu2+脅迫對海菜花幼苗的芽長、根長、葉片數(shù)和根數(shù)有顯著的抑制作用，這與肖志華等對不同基因型谷子(Setariaitalica)幼苗的Cu2+脅迫研究結(jié)果一致[8]。這主要是由于過量Cu2+加速了海菜花幼苗體內(nèi)產(chǎn)生大量的活性氧，抑制各種酶活性，影響到海菜花幼苗和根系的生長[8]。

本次試驗(yàn)中，海菜花種子在受到Cu2+脅迫時(shí)葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量均下降，這與Cu2+脅迫對多花黑麥草(Loliummultiflorum)綠葉素的影響規(guī)律一致[9]。其原因可能是：首先，高含量Cu2+抑制了PSⅡ的電子傳遞過程，減弱了光合作用強(qiáng)度[10]，減少了葉綠素的合成；其次，Cu2+脅迫增加活性自由基的產(chǎn)生而氧化葉綠素，導(dǎo)致葉綠素含量的降低，最終引起光合速率的下降[11]；再次，可能是海菜花攝入過量的Cu2+與葉綠素合成的某些酶(原葉綠素酸酯還原酶、膽色素原脫氨酶、8-氨基乙酰丙酸合成酶)的-SH結(jié)合，改變了酶的構(gòu)象，使酶失活，進(jìn)而造成光合色素含量的下降[12]。

SOD、POD和CAT是植物體內(nèi)酶促防御系統(tǒng)的3個(gè)重要保護(hù)酶，它們發(fā)揮協(xié)同作用，消除活性氧，保護(hù)植物膜系統(tǒng)。隨著Cu2+處理濃度的增加，SOD和POD活性都是先升后降，這與Cu2+對三葉草(Trifoliumincarnatum)、狗牙根(Cynodondactylon)、雙穗雀稗(Paspalumpaspaloides)等葉片中SOD、POD酶活性變化規(guī)律一致[13]。由此表明低濃度的Cu2+對POD與SOD活性具有激活作用，隨著Cu2+濃度的逐漸增大，又轉(zhuǎn)為抑制作用。而CAT活性則隨著Cu2+濃度增大而逐漸降低。由此可見，海菜花幼苗受Cu2+脅迫后抗氧化酶系統(tǒng)反饋機(jī)制不同，CAT、POD、SOD活性呈現(xiàn)不同的變化規(guī)律。陳國祥等認(rèn)為低濃度的重金屬逆境脅迫會(huì)抑制植物根系對養(yǎng)分、水分的吸收，同時(shí)引發(fā)活性氧(ROS)積累，增強(qiáng)脂質(zhì)過氧化作用，使得SOD與POD活性增強(qiáng)[14]。本試驗(yàn)中，在低濃度Cu2+脅迫下，海菜花為有效緩解Cu2+脅迫引起的氧化脅迫，及時(shí)清除ROS的積累，SOD與POD活性增強(qiáng)也充分證實(shí)了此觀點(diǎn)。但隨著Cu2+濃度的進(jìn)一步增加，高濃度的Cu2+導(dǎo)致海菜花幼苗中活性氧等自由基的積累超過植物本身的耐受極限，轉(zhuǎn)而開始抑制SOD與POD的活性。試驗(yàn)Cu2+濃度范圍內(nèi)CAT活性逐漸降低，這可能是海菜花種子CAT對Cu2+敏感，不能抵御外來污染物脅迫，這也可能是其耐受性較差的原因之一。

海菜花幼苗中的可溶性蛋白是植物細(xì)胞內(nèi)未與膜系統(tǒng)特異結(jié)合的酶，其含量越高說明其體內(nèi)生理生化反應(yīng)與代謝活性越旺盛，有利于植物抵御逆境脅迫[8]。在本文研究Cu2+濃度范圍內(nèi)，可溶性蛋白質(zhì)含量先升高后降低的變化趨勢與Cu2+對谷子幼苗可溶性蛋白質(zhì)的影響結(jié)果相同[8]。其原因可能一方面是適量的Cu2+可以誘導(dǎo)合成一些新蛋白質(zhì)，參與抗逆性生理活動(dòng)，促進(jìn)可溶性蛋白質(zhì)含量的增加；另外一方面高濃度的Cu2+也誘導(dǎo)了蛋白水解酶活性增強(qiáng)，加速了蛋白質(zhì)的水解[8]，同時(shí)，高濃度的Cu2+脅迫導(dǎo)致海菜花抗氧化酶系統(tǒng)受損，抗性酶減少，從而導(dǎo)致可溶性蛋白質(zhì)含量減少。

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Effect of Copper on the Seed Germination and Seeding Growth of Ottelia acuminatas

ZHU Jian1,FAN Fei-fei2,Zhao Li-hua1,PENG Yan3,ZHANG Zhi-hong1

(1.College of Resources and Environmental Engineering,Guizhou University,Guiyang Guizhou 550025,P.R.China;2.Guizhou Institute of Soil and Fertilizer,Guiyang Guizhou 550006,P.R.China;3.School of Chemistry and Environment Science,Guizhou Minzu University,Guiyang Guizhou 550025,P.R.China)

Abstract:Using nutrient solution culture method,the effects of Cu(2+) on seed germination,seeding growth of Ottelia acuminatas were studied.The results showed that effect of exogenous Cu(2+) within the concentration varied from 0.1 to 10mg/L on seed germination rate of Ottelia acuminatas showed no significant difference compared with control(p>0.05),while for the inhabitation of germination potential,germination index and vital index,there was significant difference compared with control(p<0.05) in higher concentration.Cu(2+) had an inhibitory effect on chlorophyll and carotinoid content of Ottelia acuminatas,and there was significant difference compared with control(p<0.05).With increasing concentration of Cu(2+),the activities of superoxide dismutase (SOD),peroxidase(POD),soluble protein contents of seedling showed increasing at beginning and then decreasing; At the same time,the activity of catalase(CAT) was consistently decreasing,and there was significant difference compared with control(p<0.05).This study could provide certain theoretical support for the natural Ottelia acuminatas conservation.

Key words:copper; Ottelia acuminatas; germination; chlorophyll; antioxidate system enzyme; soluble protein

中圖分類號：X 171.5

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1672-8246(2016)02-0135-05

第一作者簡介：朱健(1981-)，男，高級實(shí)驗(yàn)師，碩士，主要從事污染生態(tài)效應(yīng)研究。E-mail:zhujian2009@126.com

基金項(xiàng)目：貴州省科學(xué)技術(shù)基金“花溪濕地珍稀沉水植物海菜花對重金屬的生態(tài)響應(yīng)及其機(jī)理研究(黔科合J字[2012]2104)”。

*收稿日期：2015-09-07