蜈蚣提取物抗肺癌活性的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究

陳園 艾小佳 王志琪 田莎 周青 裴剛 田雪飛

摘要：目的 探討蜈蚣提取物對(duì)人肺癌A549細(xì)胞的增殖抑制、凋亡誘導(dǎo)及裸小鼠皮下移植瘤生長(zhǎng)的抑制作用。方法 采用酶解法合丙酮沉淀法分離純化蜈蚣提取物處理人肺癌A549細(xì)胞，MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制并計(jì)算半數(shù)抑制率（IC50），流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期變化，Hoechst熒光染色觀察細(xì)胞凋亡的形態(tài)變化。制備人肺癌細(xì)胞裸小鼠皮下移植瘤模型，隨機(jī)分為模型組、對(duì)照組和蜈蚣提取物組，每組10只，觀察裸小鼠皮下移植瘤瘤體體積、質(zhì)量及抑瘤率變化。結(jié)果 體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，蜈蚣提取物對(duì)人肺癌A549細(xì)胞有明顯的增殖抑制作用，IC50為0.603 mg/mL；蜈蚣提取物作用48 h后，細(xì)胞周期表現(xiàn)為G0/G1期細(xì)胞比例下降，S期與G2/M期細(xì)胞比例均升高，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；Hoechst熒光染色可觀察到明顯的凋亡細(xì)胞及凋亡特征性的形態(tài)學(xué)改變；動(dòng)物體內(nèi)抑瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)蜈蚣提取物治療后，瘤體質(zhì)量與體積顯著減少，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。結(jié)論 蜈蚣提取物對(duì)人肺癌A549細(xì)胞具有濃度依賴(lài)性增殖抑制作用，可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，使A549細(xì)胞停滯于G2/M期，并能有效抑制人肺癌裸小鼠皮下移植瘤的生長(zhǎng)。

關(guān)鍵詞：蜈蚣提取物；肺癌；細(xì)胞凋亡；移植瘤；小鼠

中圖分類(lèi)號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2016）05-0061-03

Study on Anti-lung Cancer Efficiency of Centipede Extracts in Vitro and Vivo Experiments CHEN Yuan1， AI Xiao-jia1， WANG Zhi-qi1， TIAN Sha1， ZHOU Qing2， PEI Gang1， TIAN Xue-fei1 （1. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China； 2. The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410007， China）

Abstract： Objective To investigate efficiency of centipede extracts on apoptosis induction， proliferation inhibition to Human A549 cell line and growth suppression of subcutaneous transplanted sarcoma in nude mice. Methods Centipede extracts prepared by enzymolysis and acetone precipitation methods were used to treat human lung cancer A549 cell line. Proliferation inhibition was evaluated by MTT assay and half inhibit concentration （IC50） was calculated. Cell morphological change and apoptosis were detected by flow cytometry and Hoechst stain. The subcutaneous transplanted sarcoma models were prepared with nude mice and randomly divided into model group， control group and centipede extracts group， with 10 mice in each group. Changes of tumor volume， quality and anti-tumor rate were observed. Results In vitro experiment， proliferation of A549 cells was inhibited with dose-dependency and IC50 value was 0.603 mg/mL. The G0/G1 phase of cells was down regulated and G2/M and S phase cells were up-regulated. The apoptotic character cells were been found by Hoechst stain. In vivo experiment， the tumor weight and volume decreased significantly compared with model control group， with statistical significance （P<0.01）. Conclusion The centipede extracts shows dose-dependent anti-proliferative effect on A549 cells， which can induce apoptosis by arresting A549 cells at G2/M phase and suppressing growth of subcutaneous transplanted sarcoma of lung cancer in nude mice.

Key words： centipede extracts； lung cancer； apoptosis； implanted tumor；mice

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（81473617）；湖南省自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目（13JJ2032）；湖南省教育廳重點(diǎn)資助項(xiàng)目（10A089）

通訊作者：田雪飛，E-mail：windsame@163.com

肺癌已成為全球嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康與生命的惡性腫瘤，其發(fā)病率和病死率位居首位[1]。肺癌屬中醫(yī)“肺積”“咳嗽”“積聚”等范疇。徐振曄認(rèn)為本病最基本的病理機(jī)制是癌毒痰瘀膠結(jié)于肺部，實(shí)證多為毒聚、痰凝、氣滯、血瘀[2]。劉偉勝提出肺癌發(fā)病基礎(chǔ)是正虛，直接因素是癌毒，治宜扶正配以軟堅(jiān)散結(jié)、清化瘤毒[3]。胡國(guó)良認(rèn)為，凡腫瘤皆邪氣密結(jié)不散，屬實(shí)證，主張攻補(bǔ)兼施，攻以峻猛攻毒散結(jié)，補(bǔ)以甘溫補(bǔ)益[4]。蟲(chóng)類(lèi)藥抗腫瘤作用一直頗受關(guān)注，蜈蚣作為一種重要的蟲(chóng)類(lèi)藥物，其攻毒散結(jié)的功效在臨床治療肺癌中藥復(fù)方配伍中應(yīng)用廣泛[5-6]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)蜈蚣有效成分的分離純化、抗肺癌活性進(jìn)行了研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)純系BALB/C-nu/nu雄性裸小鼠30只，4～6周齡，體質(zhì)量（20±3）g，重慶斯萊康動(dòng)物藥業(yè)有限公司，許可證號(hào)SCXK（湘）2009-0004。飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室。

1.2 細(xì)胞株

人肺癌A549細(xì)胞株，購(gòu)于湘雅醫(yī)學(xué)院細(xì)胞中心。用含12%胎牛血清（FBS）的高糖DMEM培養(yǎng)基，置37 ℃、5%CO2飽和濕度的恒溫孵育箱中培養(yǎng)。

1.3 藥物及制備

少棘蜈蚣，湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科，提取物制備參照文獻(xiàn)[7]方法改進(jìn)。蜈蚣超微粉末2 g，55 ℃蛋白酶酶解后，99 ℃水浴中滅活10 min，4 ℃、5000 r/min離心10 min，取上清液，2倍體積預(yù)冷丙酮沉淀，4℃、5000 r/min離心10 min，取沉淀，超純水充分溶解沉淀，重復(fù)2次。收集最后沉淀，超純水溶解，加2倍體積預(yù)冷丙酮，取沉淀，30 ℃真空干燥成粉末，-20 ℃凍存?zhèn)溆谩ｍ樸K，齊魯制藥有限公司，批號(hào)5110351DB。

1.4 主要試劑及儀器

高糖DMEM培養(yǎng)基（美國(guó)GIBCO公司），F(xiàn)BS（美國(guó)INVITROGEN公司），磷酸鹽緩沖液（PBS，武漢博士德有限公司），二甲基亞砜（DMSO，美國(guó)AMRESCO公司），噻唑藍(lán)（MTT）、Hoechst33342熒光染料（美國(guó)SIGMA公司）。CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Therrmo公司），Elx808型酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek公司），BX20型熒光顯微鏡攝像機(jī)（日本Olympus公司），F(xiàn)ACScan型流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）。

1.5 細(xì)胞增殖抑制率測(cè)定

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整濃度為5×104個(gè)/mL，接種于96孔板，每孔200 μL，蜈蚣提取物干預(yù)設(shè)置7個(gè)濃度梯度（2.500、1.250、0.625、0.313、0.15、0.078、0.039 mg/mL），同時(shí)設(shè)對(duì)照組和空白組（調(diào)零孔），均設(shè)5個(gè)復(fù)孔，其中對(duì)照組接種細(xì)胞加入完全培養(yǎng)基，空白組只加入完全培養(yǎng)基。MTT法檢測(cè)參照說(shuō)明進(jìn)行，計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率（%）[1-（OD值藥物組÷對(duì)照組OD值）]×100%，采用直線(xiàn)回歸方程計(jì)算半數(shù)抑制率（IC50）。

1.6 細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549細(xì)胞，濃度為1×105個(gè)/mL，接種于6孔培養(yǎng)板中，設(shè)置蜈蚣提取物組和對(duì)照組，其中蜈蚣提取物組加入IC50濃度藥液處理，對(duì)照組加入等量完全培養(yǎng)基，每孔2 mL。蜈蚣提取物處理48 h后流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期。Hoechst熒光染色觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)。

1.7 人肺癌裸小鼠皮下移植瘤模型制備

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549細(xì)胞，濃度為1×107個(gè)/mL，接種于裸小鼠背部皮下，每只0.2 mL，接種后第7日成瘤。將30只裸小鼠隨機(jī)分為模型組、蜈蚣提取物組、順鉑組，每組10只。接種后第8日給予藥物灌胃，動(dòng)物給藥量按人和動(dòng)物體表面積折算為成人5倍劑量。取蜈蚣提取物12 mg加入生理鹽水至8 mL，配成含0.06 g原藥材/mL藥液，每次灌胃0.4 mL/只，2次/d；順鉑組予2 mg/kg劑量腹腔內(nèi)注射，1次/3 d；模型組予等劑量生理鹽水灌胃。連續(xù)18 d。各組小鼠治療后第19日脫頸處死。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中觀察動(dòng)物一般的狀況，繪制腫瘤體積增長(zhǎng)曲線(xiàn)并計(jì)算其抑瘤率。抑瘤率（%）=（模型組平均瘤質(zhì)量-治療組平均瘤質(zhì)量）÷模型組平均瘤質(zhì)量×100%。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以—x±s表示，2組間比較采用成組t檢驗(yàn)；多組比較采用方差分析，組間比較采用SNK法。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

蜈蚣提取物組動(dòng)物給藥期間飲食、精神可，對(duì)外界刺激反應(yīng)靈敏，大小便正常；順鉑組給藥后第4日出現(xiàn)飲食減少，精神尚可，對(duì)外界刺激反應(yīng)尚靈敏，大便稍溏，小便正常；模型組第3日后開(kāi)始出現(xiàn)消瘦，精神欠佳，對(duì)外界刺激反應(yīng)不靈敏，飲食飲水量減少，大便溏，小便正常。

2.2 蜈蚣提取物對(duì)人肺癌A549細(xì)胞增殖抑制、細(xì)胞周期及誘導(dǎo)凋亡的影響

MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示，蜈蚣提取物對(duì)人肺癌A549細(xì)胞增殖有明顯抑制作用（P<0.05），呈劑量依賴(lài)性。蜈蚣提取物增殖抑制率回歸方程為：Y=24.807X+35.174。經(jīng)計(jì)算IC50為0.603 mg/mL。以IC50濃度蜈蚣提取物作用于人肺癌A549細(xì)胞48 h后，與對(duì)照組比較，G0/G1期細(xì)胞百分含量下降，S期與G2/M期細(xì)胞比例均升高（P<0.05）。Hoechst熒光染色結(jié)果顯示，蜈蚣提取物處理后A549細(xì)胞出現(xiàn)核染色質(zhì)濃縮、凝聚，密度升高，細(xì)胞核被致密濃染，出現(xiàn)顏色發(fā)白等特征性凋亡表現(xiàn)，見(jiàn)圖1。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，蜈蚣提取物組可見(jiàn)大量細(xì)胞凋亡，凋亡率達(dá)63.48%。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.3 蜈蚣提取物對(duì)人肺癌A549細(xì)胞裸小鼠皮下移植瘤瘤體體積、質(zhì)量及抑瘤率的影響

灌胃過(guò)程中測(cè)量皮下移植瘤第8、16、25日體積，蜈蚣提取物組分別為（126.0±11.2）、（171.5±13.3）、（196.0±20.8）mm3，順鉑組分別為（113.7±8.9）、（134.5±9.1）、（183.8±13.5）mm3，模型組分別為（320.0±24.6）、（786.5±31.1）、（1912.5±56.4）mm3，蜈蚣提取物組和順鉑組皮下移植瘤體積生長(zhǎng)速度較模型組明顯減慢（P<0.01），見(jiàn)圖2。給藥18 d后，蜈蚣提取物組皮下移植瘤瘤體質(zhì)量為（2.94±0.76）g明顯低于模型組[（4.65±0.91）g]（P<0.05）；與順鉑組[（2.52±0.69）g]比較無(wú)明顯差異；蜈蚣提取物組抑瘤率為36.77%較順鉑組45.81%比無(wú)明顯差異。

3 討論

蜈蚣是我國(guó)傳統(tǒng)名貴中藥材，現(xiàn)代藥理研究顯示，蜈蚣具有降低血黏度、抗炎、抗菌、鎮(zhèn)痛、抗驚厥等多種作用[8]。蜈蚣具有“攻毒散結(jié)”的功效特點(diǎn)，以復(fù)方配伍的形式應(yīng)用于惡性腫瘤的臨床治療[9-12]。

本研究對(duì)蜈蚣抗肺癌活性進(jìn)行系列體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，蜈蚣提取物呈劑量依賴(lài)性抑制人肺癌A549細(xì)胞增殖，對(duì)肺癌細(xì)胞周期的影響主要表現(xiàn)為明顯的G2/M期阻滯作用，使細(xì)胞有絲分裂受阻，阻礙DNA合成，促使其凋亡。體內(nèi)裸小鼠皮下移植瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果也提示，蜈蚣提取物能減緩腫瘤生長(zhǎng)速度，抑瘤率達(dá)36.77%，其療效與順鉑45.81%比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

綜上所述，蜈蚣提取物體外可抑制肺癌細(xì)胞A549的增殖并誘導(dǎo)其凋亡，體內(nèi)可抑制皮下移植瘤的生長(zhǎng)速度，顯示蜈蚣具有良好的抗肺癌活性。

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