王勝民，劉毅，劉曉麗，熊華章，李豫皖，余峰

(1 遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，貴州遵義563000；2 遵義市第一人民醫(yī)院;3 仁懷市人民醫(yī)院)

·基礎(chǔ)研究·

金鐵鎖對(duì)膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎兔關(guān)節(jié)軟骨的保護(hù)作用及其機(jī)制

王勝民1，劉毅1，劉曉麗2，熊華章1，李豫皖1，余峰3

(1 遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，貴州遵義563000；2 遵義市第一人民醫(yī)院;3 仁懷市人民醫(yī)院)

目的 觀察金鐵鎖對(duì)膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎(OA)兔關(guān)節(jié)軟骨的保護(hù)作用，并探討其作用機(jī)制。方法 將50只家兔隨機(jī)分為空白對(duì)照組，金鐵鎖大、中、小劑量組和模型對(duì)照組，各10只。除空白對(duì)照組外，其余各組均按照改良Hulth法制備右膝關(guān)節(jié)OA模型。金鐵鎖大、中、小劑量組術(shù)后分別按體質(zhì)量稱(chēng)取金鐵鎖粉末12.80、4.23、2.58 mg/kg，配制藥物溶液10 mL灌胃，空白對(duì)照組及模型對(duì)照組灌服等量生理鹽水，1次/d，連用8周。造模第8周處死家兔，取右膝股骨內(nèi)側(cè)髁組織，采用Mankin評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)關(guān)節(jié)軟骨退變情況，qRT-PCR法檢測(cè)關(guān)節(jié)軟骨組織IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果 空白對(duì)照組，金鐵鎖大、中、小劑量組和模型對(duì)照組Mankin評(píng)分分別為(0.80±0.20)、(2.60±0.16)、(3.40±0.16)、(5.10±0.38)、(10.40±0.16)分，各組Mankin評(píng)分依次升高，組間兩兩比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均<0.01)。模型對(duì)照組軟骨組織IL-6、TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于其余各組，空白對(duì)照組均低于其余各組，金鐵鎖大、中劑量組均低于金鐵鎖小劑量組(P均<0.05)。模型對(duì)照組軟骨組織IL-1β mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于其余各組，空白對(duì)照組、金鐵鎖大劑量組均低于金鐵鎖中、小劑量組(P均<0.05)。結(jié)論 金鐵鎖對(duì)膝關(guān)節(jié)OA兔的軟骨具有保護(hù)作用，且呈濃度依賴(lài)性，機(jī)制可能與降低軟骨組織IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)有關(guān)。

骨性關(guān)節(jié)炎；膝關(guān)節(jié)；金鐵鎖；關(guān)節(jié)軟骨；兔

金鐵鎖具有消癰排膿、止血、散瘀定痛等功效，主要用于治療跌打損傷、創(chuàng)傷出血等[1, 2]。目前對(duì)金鐵鎖的研究大多為其化學(xué)成分、藥理作用等方面，關(guān)于其對(duì)骨性關(guān)節(jié)炎(OA)的治療作用少見(jiàn)報(bào)道。2015年1～8月，我們觀察了金鐵鎖對(duì)膝關(guān)節(jié)OA兔關(guān)節(jié)軟骨的保護(hù)作用，并探討其機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 清潔級(jí)健康成年家兔50只，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，雌雄不限，由遵義醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)基地養(yǎng)殖場(chǎng)提供。10%中性緩沖甲醛固定液(即用型)購(gòu)于廣州維格斯生物科技有限公司，動(dòng)物組織/細(xì)胞總RNA提取試劑盒(離心柱型)購(gòu)于北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTMRT Reagent Kit)購(gòu)于日本TaKaRa公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒(SYBR Premix Ex TaqTMⅡ)購(gòu)于日本TaKaRa公司；金鐵鎖粉末購(gòu)于貴州益佰制藥股份有限公司。E200型顯微鏡購(gòu)于日本Nikon公司。

1.2 造模與分組處理 將50只家兔隨機(jī)分為空白對(duì)照組，金鐵鎖大、中、小劑量組和模型對(duì)照組，各10只。采用改良Hulth法[3, 4]制備兔右膝關(guān)節(jié)OA模型：耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉30 mg/kg，術(shù)區(qū)備皮，常規(guī)消毒。行右膝正中切口，逐層切開(kāi)，暴露右膝關(guān)節(jié)腔；切除前交叉韌帶及內(nèi)側(cè)半月板，行抽屜試驗(yàn)確認(rèn)前交叉韌帶已完全斷裂，縫合關(guān)節(jié)腔及皮膚。空白對(duì)照組僅切開(kāi)右膝關(guān)節(jié)，不切除前交叉韌帶以及內(nèi)側(cè)半月板。各組術(shù)后肌注青霉素鈉20萬(wàn)U/kg，連用7 d。分籠飼養(yǎng)并每日驅(qū)趕。按照《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》中的方法計(jì)算給藥劑量[5]，金鐵鎖大、中、小劑量組分別按體質(zhì)量稱(chēng)取金鐵鎖粉末12.80、4.23、2.58 mg/kg，配制藥物溶液10 mL，于造模當(dāng)日灌胃給藥；空白對(duì)照組及模型對(duì)照組灌服等量的生理鹽水；1次/d，連用8周。

1.3 右膝關(guān)節(jié)大體觀察及標(biāo)本制作 各組造模第8周，采用空氣栓塞法[6]處死所有家兔，取其右膝股骨內(nèi)側(cè)髁，生理鹽水沖洗干凈，肉眼觀察關(guān)節(jié)軟骨的完整性及色澤。將標(biāo)本分為兩份，分別采用10%甲醛及液氮(-196 ℃)進(jìn)行固定。

1.4 關(guān)節(jié)軟骨退變情況觀察 HE染色[7]：取1.3中甲醛固定的右膝股骨內(nèi)側(cè)髁標(biāo)本，脫鈣后常規(guī)脫水，取關(guān)節(jié)軟骨石蠟包埋，5 μm厚度切片。二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化后行Harris蘇木精染色，水洗及鹽酸乙醇分化，水洗藍(lán)化，伊紅染色。梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)及軟骨細(xì)胞數(shù)量。番紅染色[8]：取1.3中甲醛固定的右膝股骨內(nèi)側(cè)髁標(biāo)本，脫鈣后石蠟包埋切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化后行番紅染色。水洗及梯度乙醇水化，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)染色及潮線變化。各組染色后采用Mankin評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)關(guān)節(jié)軟骨退變情況，評(píng)分越高說(shuō)明關(guān)節(jié)軟骨退變?cè)絿?yán)重。

1.5 關(guān)節(jié)軟骨組織IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá)量檢測(cè) 采用qRT-PCR法。取1.3中液氮固定的右膝股骨內(nèi)側(cè)髁標(biāo)本，在液氮環(huán)境下用無(wú)菌刀片剝離關(guān)節(jié)軟骨50 mg；放于RNase free的離心管中，超聲破碎儀充分破碎，裂解、離心后取水相層。參照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取標(biāo)本總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度和純度；以總RNA為模板，于冰上配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以β-actin為內(nèi)參進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，嚴(yán)格按照SYBR Green qPCR Master Mix試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。引物序列見(jiàn)表1。反應(yīng)體系20.0 μL：ddH2O 6.4 μL，SYBR 10.0 μL，cDNA 2.0 μL，上、下游引物各0.8 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性10 s；60 ℃退火30 s，共40個(gè)循環(huán)。以2-ΔΔCt法計(jì)算TNF-α、 IL-1β、IL-6 mRNA的相對(duì)表達(dá)量[9，10]。

表1 IL-1β、IL-6、TNF-α及β-actin引物序列

2 結(jié)果

2.1 右膝關(guān)節(jié)情況 空白對(duì)照組右膝股骨內(nèi)側(cè)髁關(guān)節(jié)軟骨透明，表面光滑、平整，無(wú)骨贅形成。金鐵鎖大劑量組右膝關(guān)節(jié)表面失去光澤，股骨內(nèi)側(cè)髁兩側(cè)無(wú)骨贅形成。金鐵鎖中劑量組右膝關(guān)節(jié)稍腫脹，色澤稍灰暗，表面欠光滑。金鐵鎖小劑量組右膝關(guān)節(jié)腫大，色澤灰暗，表面粗糙，股骨內(nèi)側(cè)髁兩側(cè)骨贅形成。模型對(duì)照組右膝關(guān)節(jié)腫脹明顯，表面粗糙明顯，關(guān)節(jié)面不平，部分軟骨剝脫并顯露軟骨下骨，股骨內(nèi)側(cè)髁兩側(cè)骨贅形成。

2.2 關(guān)節(jié)軟骨退變情況 空白對(duì)照組HE染色示軟骨結(jié)構(gòu)光整，細(xì)胞數(shù)量正常；番紅染色示基質(zhì)染色正常，潮線完整。金鐵鎖大劑量組HE染色示軟骨表面局部見(jiàn)不規(guī)則裂隙，軟骨細(xì)胞數(shù)量正常；番紅染色示基質(zhì)局部輕度減退，潮線完整。中劑量組HE染色示軟骨表面局部見(jiàn)裂隙，軟骨細(xì)胞數(shù)量正常；番紅染色示基質(zhì)輕度減退，潮線完整。金鐵鎖小劑量組HE染色示軟骨表面有不規(guī)則裂隙，軟骨細(xì)胞數(shù)量減少；番紅染色示基質(zhì)輕度或中度減退，潮線完整。模型對(duì)照組HE染色示軟骨表面有不規(guī)則裂隙，軟骨細(xì)胞數(shù)量明顯減少；番紅染色示基質(zhì)中度或重度減退，多重潮線。見(jiàn)插頁(yè)Ⅲ圖5、6?？瞻讓?duì)照組，金鐵鎖大、中、小劑量組和模型對(duì)照組Mankin評(píng)分分別為(0.80±0.20)、(2.60±0.16)、(3.40±0.16)、(5.10±0.38)、(10.40±0.16)分，多組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)；各組Mankin評(píng)分依次升高，組間兩兩比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均<0.01)。

2.3 各組關(guān)節(jié)軟骨組織IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 模型對(duì)照組軟骨組織IL-6、TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于其余各組，空白對(duì)照組均低于其余各組，金鐵鎖大、中劑量組均低于金鐵鎖小劑量組(P均<0.05)。模型對(duì)照組軟骨組織IL-1β mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于其余各組，空白對(duì)照組、金鐵鎖大劑量組均低于金鐵鎖中、小劑量組(P均<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組關(guān)節(jié)軟骨組織IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

注：與空白對(duì)照組比較，aP<0.05；與金鐵鎖大劑量組比較，bP<0.05；與金鐵鎖中劑量組比較，cP<0.05；與金鐵鎖小劑量組比較，dP<0.05。

3 討論

OA是一種以關(guān)節(jié)軟骨變形和丟失，關(guān)節(jié)邊緣和軟骨下骨骨質(zhì)再生為特征的慢性關(guān)節(jié)疾病[11]。關(guān)節(jié)軟骨由軟骨細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成，軟骨基質(zhì)主要由膠原纖維、蛋白多糖和水組成，上述成分結(jié)合使關(guān)節(jié)軟骨具有承受負(fù)荷、抵抗應(yīng)力及減少摩擦等作用，OA的始發(fā)部位就在關(guān)節(jié)軟骨。為創(chuàng)建合理的關(guān)節(jié)軟骨缺損動(dòng)物模型，本研究采用了改良Hulth法。結(jié)果顯示，造模第8周空白對(duì)照組關(guān)節(jié)軟骨光滑，無(wú)骨贅形成，基質(zhì)染色正常，潮線完整；模型對(duì)照組關(guān)節(jié)軟骨見(jiàn)不規(guī)則裂隙，細(xì)胞數(shù)目減少，潮線不完整，基質(zhì)染色失染；提示造模成功。本研究中，空白對(duì)照組、金鐵鎖大劑量組、金鐵鎖中劑量組、金鐵鎖小劑量組和模型對(duì)照組Mankin評(píng)分依次升高，且組間兩兩比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；不僅說(shuō)明本研究造模成功，亦表明金鐵鎖對(duì)膝關(guān)節(jié)OA兔具有軟骨保護(hù)作用，且呈濃度依賴(lài)性。

IL-1β是OA發(fā)病過(guò)程中的一種重要炎癥因子，可通過(guò)一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)引起關(guān)節(jié)的破壞和炎癥反應(yīng)[12]。IL-1β對(duì)膝關(guān)節(jié)OA的影響很復(fù)雜，主要是從改變軟骨細(xì)胞正常結(jié)構(gòu)與功能，促進(jìn)軟骨細(xì)胞凋亡發(fā)生，降解軟骨細(xì)胞基質(zhì)等多方面發(fā)揮作用，其軟骨組織的中上層軟骨細(xì)胞及其基質(zhì)皆呈IL-1強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)[13]。TNF-α參與介導(dǎo)多種炎癥過(guò)程，OA的發(fā)病與關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞增殖旺盛并分泌過(guò)多的TNF-α有關(guān)[14]。TNF-α可以激活并聚集白細(xì)胞，增強(qiáng)白細(xì)胞吞噬功能，從而參與感染和自身免疫性疾病的調(diào)節(jié)[15]。

IL-6可能是TNF-α和IL-1β作用于其他細(xì)胞的中介物質(zhì)，三者協(xié)同作用可加速OA的進(jìn)展[16，17]。IL-6可刺激正常軟骨、滑膜細(xì)胞產(chǎn)生前列腺素和膠原酶，增加關(guān)節(jié)炎性反應(yīng)和由IL-1介導(dǎo)的基質(zhì)金屬蛋白酶的分泌。研究表明，IL-6能夠促進(jìn)OA患者關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞生成IL-1受體拮抗劑、可溶性TNF受體等，從而減輕關(guān)節(jié)組織的炎癥反應(yīng)[18]。本研究中，模型對(duì)照組軟骨組織IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯高于其余各組，而金鐵鎖大、中劑量組軟骨組織IL-6、TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯低于金鐵鎖小劑量組，金鐵鎖大劑量組軟骨組織IL-1β mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯低于金鐵鎖中、小劑量組，說(shuō)明金鐵鎖對(duì)膝關(guān)節(jié)OA兔關(guān)節(jié)軟骨的保護(hù)作用可能與其降低上述炎性因子表達(dá)有關(guān)，并呈濃度依賴(lài)性。

綜上所述，金鐵鎖對(duì)膝關(guān)節(jié)OA兔的關(guān)節(jié)軟骨具有保護(hù)作用，且呈濃度依賴(lài)性，機(jī)制可能與降低軟骨組織IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)有關(guān)。但是關(guān)于金鐵鎖對(duì)膝關(guān)節(jié)OA軟骨保護(hù)的其他作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

[1] 趙保勝,桂海水,朱寅荻,等.金鐵鎖化學(xué)成分、藥理作用和臨床應(yīng)用研究進(jìn)展[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2011,17(18):288-291.

[2] 王微,袁琳,康文藝.金鐵鎖化學(xué)成分和藥理活性研究進(jìn)展[J].河南大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2013,32(2):143-146.

[3] 王云峰,白人驍,張揚(yáng),等.改良Hulth模型復(fù)制膝不同時(shí)期骨關(guān)節(jié)炎的實(shí)驗(yàn)研究[J].天津醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2009,15(3):400-404.

[4] 熊華章,劉毅,吳術(shù)紅,等.睪酮對(duì)雄兔膝骨關(guān)節(jié)炎預(yù)防作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2012,37(8):677-681.

[5] 肖曉金,包俠萍,陳文列,等.透骨消痛膠囊對(duì)兔膝骨關(guān)節(jié)炎模型血清與關(guān)節(jié)液炎癥因子的影響[J].風(fēng)濕病與關(guān)節(jié)炎,2013,10(11):35-38.

[6] 熊元,趙振國(guó),李傳郡,等.兔膝骨關(guān)節(jié)炎模型的制備及鑒定[J].實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué),2013,30(3):31-34,63.

[7] 楊瑞甫,胡蘊(yùn)玉,吳銀松,等.兔骨關(guān)節(jié)炎兩種動(dòng)物模型的比較[J].中國(guó)矯形外科雜志,2006,14(19):1497-1499,1524.

[8] 姜鈴霞,姚偉武,趙海南,等.實(shí)驗(yàn)性軟骨損傷的生物學(xué)表達(dá)與病理分期對(duì)照研究[J].診斷學(xué)理論與實(shí)踐,2013,11(1):80-85.

[9] 唐永凱,賈永義.熒光定量PCR數(shù)據(jù)處理方法的探討[J].生物技術(shù),2008,18(3):89-91.

[10] 陳文超,周然,王永輝,等.骨靈膏及其拆方制劑對(duì)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡及胞外基質(zhì)降解的影響[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2014,20(1):143-148.

[11] Bellucci F, Meini S, Cucchi P, et al. Synovial fluid levels of bradykinin correlate with biochemical markers for cartilage degradation and inflammation in knee osteoarthritis[J]. Osteoarthritis Cartilage, 2013,21(11):1774-1780.

[12] Yang CC, Lin CY, Wang HS, et al. Matrix metalloproteases and tissue inhibitors of metalloproteinases in medial plica and pannus-like tissue contribute to knee osteoarthritis progression[J]. PLoS One, 2013,8(11):e79662.

[13] 沈鵬飛,侯為林,徐建達(dá),等.白細(xì)胞介素1β在膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎滑液中臨床意義[J].臨床骨科雜志,2012,15(6):693-695.

[14] 周效思,周凱,譚安雄,等.威靈仙對(duì)兔膝骨關(guān)節(jié)炎結(jié)構(gòu)和功能的影響[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2011,22(10):2454-2456.

[15] 楊穎,王俊杰,崔永勇,等.三種炎癥因子在致炎大鼠乳腺組織中的表達(dá)[J].北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào),2011,26(3):28-30.

[16] 郭靜,閆冰,李琪佳,等.骨關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)軟骨及滑膜中MMP-9、IL-6的表達(dá)[J].第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2011,32(6):672-676.

[17] 趙可偉,潘昆如,司徒儒如,等.中藥骨康對(duì)成骨細(xì)胞IL-1、IL-6和TNF-α表達(dá)的影響[J].熱帶醫(yī)學(xué)雜志,2008,8(7):667-669.

[18] 沈鵬飛.關(guān)節(jié)液中IL-6、LDH含量與骨關(guān)節(jié)炎診斷研究[J].長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2009,25(1):121-122.

貴州省科技廳社發(fā)攻關(guān)基金資助項(xiàng)目(黔科合SY[2010]3091號(hào))；遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院碩士啟動(dòng)基金項(xiàng)目(院字[2013]20號(hào))。

劉毅(E-mail： 13308529536@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.16.008

R684.3

A

1002-266X(2016)16-0027-03

2015-11-10)