吳瓊，王小中

(南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西南昌330006)

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CD55和CD59檢測在陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿診斷中的意義

吳瓊，王小中

(南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西南昌330006)

摘要:目的探討應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測CD55和CD59在陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿(PNH)診斷中的應(yīng)用價(jià)值。方法應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測貧血患者及健康對(duì)照組外周血紅細(xì)胞和粒細(xì)胞的表面抗原CD55、CD59的表達(dá)水平，并同時(shí)做Ham試驗(yàn)、糖水試驗(yàn)和尿Rous試驗(yàn)。結(jié)果健康對(duì)照組紅細(xì)胞和粒細(xì)胞CD55-、CD59-的測定結(jié)果均小于5%。7例PNH患者紅細(xì)胞和粒細(xì)胞CD55-、CD59-的測定結(jié)果均大于5%；20例AA患者中有2例紅細(xì)胞CD55-、CD59-測定結(jié)果大于5%；粒細(xì)胞CD55-、CD59-大于5%的有1例；部分IDA患者紅細(xì)胞CD55-、CD59-大于5%，而粒細(xì)胞的結(jié)果全部正常；MA和AIHA患者的紅細(xì)胞和粒細(xì)胞CD55-、CD59-的測定結(jié)果均正常。7例PNH患者中，Ham試驗(yàn)2例陰性，尿Rous試驗(yàn)1例陰性，而其紅細(xì)胞和粒細(xì)胞CD55-、CD59-的測定結(jié)果均大于5%。結(jié)論利用流式細(xì)胞術(shù)同時(shí)檢測外周血中紅細(xì)胞和粒細(xì)胞CD55和CD59的表達(dá)對(duì)PNH的診斷具有無可比擬的優(yōu)勢，利于PNH的早期發(fā)現(xiàn)，是目前診斷PNH最敏感的方法。

關(guān)鍵詞：陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿；CD55；CD59；流式細(xì)胞術(shù)

陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿(paroxysmal nocturnal hemoglobinuria，PNH)是一種獲得性造血干細(xì)胞基因突變導(dǎo)致的血液病，常在睡眠時(shí)加重，可伴隨有間歇性血紅蛋白尿、全血細(xì)胞減少和反復(fù)血栓形成等癥狀。傳統(tǒng)方法可通過糖水試驗(yàn)、酸溶血實(shí)驗(yàn)（Ham）診斷[1]，但敏感性、特異性較差。近年來研究發(fā)現(xiàn)，在正常細(xì)胞的膜表面均有多種GPI錨蛋白，主要為補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白C3轉(zhuǎn)化酶衰變加速因子（DFA，CD55）和反應(yīng)性溶血膜抑制物（MIRL，CD59），這兩種蛋白能夠保護(hù)紅細(xì)胞免于補(bǔ)體介導(dǎo)的溶血。因此，CD55及CD59這兩種蛋白質(zhì)的缺失將直接導(dǎo)致血管內(nèi)溶血及血紅蛋白尿[2]。PNH患者的多數(shù)臨床表現(xiàn)均可歸結(jié)于受累細(xì)胞表面該類蛋白的缺失[3]。因此，通過檢測細(xì)胞表面CD55、CD59的缺乏可作為診斷PNH最直接的證據(jù)。但有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)健康人及常見的其他貧血性疾病也存在不同程度的表達(dá)下降[4]，鑒于此，筆者對(duì)我院79例各種貧血患者進(jìn)行CD55、CD59免疫表型觀察研究，探討PNH診斷的敏感指標(biāo)，現(xiàn)報(bào)告如下。

1　對(duì)象與方法

1.1對(duì)象收集2011年8月－2014年10月門診、住院病人79例，其中男31例，女48例，年齡14～86歲，平均42歲。各種貧血診斷均參照《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》[4]；正常對(duì)照選擇醫(yī)院健康體檢者30例，其中男18例，女12例，年齡18～49歲，平均37歲，均無貧血史。

1.2方法

1.2.1主要設(shè)備和試劑BD公司FACSCalibur流式細(xì)胞儀；FITC標(biāo)記的CD59單克隆抗體，PE標(biāo)記的CD55單克隆抗體及相應(yīng)的同型對(duì)照IgG2a和溶血素均購自美國BD公司。

1.2.2標(biāo)本采集和處理采集晨起空腹靜脈血2mL，用EDTA－K2抗凝，采血后6h內(nèi)檢測。

1.2.3標(biāo)本檢測

1.2.3.1紅細(xì)胞標(biāo)記方法設(shè)樣品管和對(duì)照管，樣品管中分別加入CD55－PE和CD59－FITC各20μl，對(duì)照管中分別加入IgG2a－PE和IgG2a－FITC 各20μl。每管中加入全血20μl，充分混勻，室溫下避光孵育30min。加入0.5mlPBS緩沖液，避光待測。流式細(xì)胞儀分析應(yīng)用Cell Quest軟件，在FSCSSC散點(diǎn)圖上選定紅細(xì)胞群，設(shè)門圈出欲分析的細(xì)胞群體，計(jì)算紅細(xì)胞CD55和CD59的表達(dá)。

1.2.3.2粒細(xì)胞標(biāo)記方法設(shè)樣品管和對(duì)照管，樣品管中加入CD55－PE、CD59－FITC和CD45－Percp 各20μl，對(duì)照管中加入IgG2a－PE、IgG2a－FITC和CD45－Percp各20μl。分別加入全血50μl，充分混勻，室溫下避光孵育30min。加入溶血素1ml，充分混勻，室溫下避光反應(yīng)10min后1200r/min轉(zhuǎn)離心5min，棄上清，PBS洗滌2次后加入0.5mLPBS重懸細(xì)胞，避光待測。在CD45－SSC散點(diǎn)圖上選定粒細(xì)胞群，設(shè)門圈出欲分析的細(xì)胞群體，計(jì)算粒細(xì)胞上CD55和CD59的表達(dá)。

1.2.3.3 Ham試驗(yàn)、糖水試驗(yàn)和尿Rous試驗(yàn)等溶血檢測指標(biāo)，按照國內(nèi)外統(tǒng)一溶血檢驗(yàn)操作規(guī)程[5]。

1.2.3.4判斷標(biāo)準(zhǔn)以正常人紅細(xì)胞和粒細(xì)胞的CD55、CD59表達(dá)設(shè)定陰性閾值，CD55－、CD59－百分率小于5%認(rèn)為正常，CD55－、CD59－的百分率大于5%認(rèn)定為有PNH克隆[6－8]。

2　結(jié)果

2.1紅細(xì)胞和粒細(xì)胞CD55、CD59的表達(dá)率貧血患者及健康對(duì)照組外周血細(xì)胞CD55和CD59測定結(jié)果見表1。所有健康人中紅細(xì)胞和粒細(xì)胞的CD55－和CD59－百分率均小于5%；7例PNH患者紅細(xì)胞和粒細(xì)胞CD55－、CD59－的測定結(jié)果均大于5%；20例再生障礙性貧血（aplastic anemia，AA）患者中有2例AA患者紅細(xì)胞CD55－、CD59－測定結(jié)果大于5%；粒細(xì)胞CD55－、CD59－大于5%的有1例；33例缺鐵性貧血（iron deficiency anemia，IDA）患者中有2例患者紅細(xì)胞CD55－、CD59－測定結(jié)果大于5%，而粒細(xì)胞的結(jié)果全部正常；巨幼細(xì)胞性貧血（megaloblastic anemia，MA）和自身免疫溶血性貧血（autoimmune hemolytic anemia，AIHA）患者紅細(xì)胞和粒細(xì)胞CD55－、CD59－的測定結(jié)果均在正常范圍。

表1　健康對(duì)照組及貧血患者外周血CD55-和CD59-細(xì)胞檢測結(jié)果

2.2糖水試驗(yàn)、Ham試驗(yàn)、尿Rous試驗(yàn)的結(jié)果比較糖水試驗(yàn)、Ham試驗(yàn)和尿Rous試驗(yàn)的測定結(jié)果見表2。7例PNH病人糖水試驗(yàn)全是陽性；酸溶血試驗(yàn)2例陰性；尿Rous試驗(yàn)1例陰性。20例AA患者中有6例糖水試驗(yàn)陽性；Ham試驗(yàn)和尿Rous試驗(yàn)均是陰性。其余病人糖水試驗(yàn)、Ham試驗(yàn)、尿Rous試驗(yàn)均陰性。

表2　健康對(duì)照組和貧血患者其他檢測指標(biāo)比較

3　討論

PNH是一種獲得性造血干細(xì)胞克隆缺陷性疾病，病變細(xì)胞X染色體上PIG－A基因發(fā)生突變，引起糖基磷脂酰肌醇錨合障礙，導(dǎo)致GPI錨鏈蛋白(GPI－AP)表達(dá)減少或者缺失，使得異常細(xì)胞對(duì)補(bǔ)體敏感而被破壞，出現(xiàn)持續(xù)性血管內(nèi)溶血[9]。而傳統(tǒng)診斷PNH的方法有賴于一系列特殊的溶血試驗(yàn)檢測，糖水試驗(yàn)試驗(yàn)敏感性高，但特異性差，只能用于初步篩查；Ham試驗(yàn)特異性高，但敏感性差，PNH患者中陽性率只有60%～80%[10]，是否陽性取決于PNH患者對(duì)補(bǔ)體敏感的異常紅細(xì)胞數(shù)量，只有PNH患者外周血受累紅細(xì)胞數(shù)量達(dá)到一定比例才有可能陽性。近年來應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測CD55、CD59抗體標(biāo)記已成為臨床診斷PNH的一個(gè)新的特異手段。其具有敏感性高，特異性強(qiáng)、結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性高等特點(diǎn)，結(jié)合特異性單抗，可同時(shí)檢測細(xì)胞表面兩種主要GPI錨定蛋白的缺失，并能發(fā)現(xiàn)少量PNH克隆，有報(bào)道稱應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)可檢測出僅占3%的異常細(xì)胞存在[11]。因此，通過檢測細(xì)胞表面CD55、CD59的缺乏可以作為診斷PNH最直接的證據(jù)。

目前已經(jīng)證實(shí)PNH克隆可累及幾乎所有的血細(xì)胞[12]，不同系列細(xì)胞表面的CD55、CD59缺乏或減少的程度不一，其累及造血細(xì)胞次序?yàn)榱＜?xì)胞、單核細(xì)胞、紅細(xì)胞、淋巴細(xì)胞[13]。有報(bào)導(dǎo)指出PNH患者出現(xiàn)嚴(yán)重溶血，剛剛接受輸血治療或正處于恢復(fù)期時(shí)。因?yàn)榧t細(xì)胞壽命較長，異常細(xì)胞被破壞和正常細(xì)胞增多會(huì)導(dǎo)致異常細(xì)胞相對(duì)減少，因此若只檢測紅細(xì)胞的CD55－、CD59－可能出現(xiàn)假陰性[14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，所有健康人紅細(xì)胞和粒細(xì)胞CD55－、CD59－的百分比均小于5%；7例PNH患者中，Ham試驗(yàn)2例陰性，尿Rous試驗(yàn)1例陰性，而其紅細(xì)胞和粒細(xì)胞CD55－、CD59－的百分比均大于5%，存在PNH克隆，檢出率為100%。這說明CD55、CD59檢測的敏感性要明顯優(yōu)于Ham試驗(yàn)、尿Rous試驗(yàn)，提示CD55－和CD59檢測可以用于PNH早期診斷及鑒別診斷；另外，糖水試驗(yàn)中除了7例PNH患者陽性外，我們發(fā)現(xiàn)有6例AA患者也被檢測出陽性，容易出現(xiàn)假陽性而做出誤診，而20例AA患者中除一位患者紅細(xì)胞和粒細(xì)胞CD55－、CD59－的百分比均大于5%，小于10%外，均沒有檢測出PNH克隆，這說明CD55、CD59檢測的特異性要好于糖水試驗(yàn)。我們后期跟蹤發(fā)現(xiàn)這位AA患者最終轉(zhuǎn)化為PNH，證實(shí)了AA和 PNH關(guān)系密切，部分AA患者可以轉(zhuǎn)化為PNH[15]。同時(shí)我們?cè)?例IDA患者紅細(xì)胞上也檢測出了少量PNH克隆，其程度比PNH患者輕，而粒細(xì)胞正常，其機(jī)制目前尚不清楚。

綜上所述，利用流式細(xì)胞術(shù)同時(shí)檢測外周血中紅細(xì)胞和粒細(xì)胞CD55和CD59的表達(dá)對(duì)PNH的診斷具有無可比擬的優(yōu)勢，利于PNH的早期發(fā)現(xiàn)，是目前診斷PNH最敏感的方法。

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·實(shí)驗(yàn)研究·

The application of CD55 and CD59 expression in the diagnosis of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria syndrome

WU Qiong，WANG Xiaozhong. Department of Clinical Laboratory，the Second Affiliated Hospital of Nanchang University，Nanchang 330006，China.

Abstract：Objective To study on the application of CD55 and CD59 expression detected by flow cytometry in the diagnosis of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria syndrome (PNH). Methods Flow cytometry was used to detect the expression of the peripheral erythrocytes and granulocytes surface antigen CD55，CD59 in anemia patients and healthy control group，and at the same time doing Ham test，sugar intake test and urine Rous test were done. Results The expression of the erythrocytes and granulocytes surface antigen CD55，CD59 in healthy control group were less than 5%. Seven PHN patients’expression of the erythrocytes and granulocytes surface antigen CD55，CD59 were more than 5%. Two of the twenty AA patients’expression of the erythrocytes surface antigen CD55，CD59 was more than 5%，and only one of them the expression of the erythrocytes and granulocytes surface antigen CD55，CD59 were all more than 5%. Part of the IDA patients’expression of the erythrocytes surface antigen CD55，CD59 were more than 5%，while the expression of the granulocytes is normal. MA and AIHA patients’expression of CD55，CD59 were normal. In the seven PHN patients，two of them Ham test were negative，one of them urine rous test was negative，but all of them the the expression of the erythrocytes and granulocytes surface antigen CD55，CD59 were more than 5%. Conclusion Using flow cytometry to detect the expression of the peripheral erythrocytes and granulocytes surface antigen CD55，CD59 has unexampled advantages in the diagnosis of PNH，and it has been helpful and the most sensitive method to the early detection of PNH.

Key words:PNH；CD55；CD59；Flow cytometry

(收稿日期2015－12－09；修回日期2016－02－03)

通信作者：王小中，男，1973年12月生，博士，研究生導(dǎo)師，主任技師，教授，研究方向：主要從事臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)。

基金項(xiàng)目：江西省自然科學(xué)基金項(xiàng)目，項(xiàng)目編號(hào)：2014ZBAB205010

作者簡介：吳瓊，女，1984年6月生，碩士學(xué)位，主管技師，研究方向：流式細(xì)胞術(shù)。

DOI：10.3969/j.issn.1674-1129.2016.02.006

中圖分類號(hào)：R556.6+4，R446.62

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1674-1129(2016)02-0146-03