王慧琳 王偉 劉京銘 李傳友 高孟秋

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趨化因子5和趨化因子受體5基因多態(tài)性與肺結核易感性的關系

王慧琳 王偉 劉京銘 李傳友 高孟秋

目的 探討趨化因子5(CCL5)及趨化因子受體5(CCR5)基因多態(tài)性與肺結核(pulmonary tuberculosis, PTB)易感性的關系。方法 選取2014年2月至2015年4月首都醫(yī)科大學附屬北京胸科醫(yī)院收治的PTB患者作為病例組，共494例；選取413名健康志愿者作為對照組。采集研究對象靜脈血，使用競爭性等位基因特異性PCR方法檢測其CCL5啟動子區(qū)rs2107538和CCR5啟動子區(qū)rs1799987基因型，計算病例組和對照組的基因型及等位基因頻率，并對其分布情況進行比較，分析各基因多態(tài)性與PTB患病的相關性。結果 CCL5啟動子區(qū)rs2107538基因-403位點GG、GA、AA基因型及等位基因G、A的頻次和頻率病例組分別為：202(41%)、224(45%)、68(14%)和628(64%)、360(36%)；對照組分別為：152(38%)、209(51%)、52(13%)和513(62%)、313(38%)，兩組之間基因型分布和等位基因分布差異均無統(tǒng)計學意義(χ2值分別為2.50和0.35，P值均>0.05)。CCR5啟動子區(qū)rs1799987基因-2459位點AA、AG、GG基因型及等位基因A、G的頻次和頻率病例組分別為：99(20%)、272(55%)、123(25%)和470(48%)、518(52%)；對照組分別為：67(16%)、210(51%)、136(33%)和344(42%)、482(58%)，兩組之間基因型分布和等位基因分布差異均有統(tǒng)計學意義(χ2值分別為7.62和6.14，P值均<0.05)。攜帶該位點基因型GG和等位基因G可降低PTB患病風險[OR(95%CI)值分別為：0.68(0.50～0.91)、0.78(0.64～0.94)]。結論 CCL5啟動子區(qū)rs2107538基因多態(tài)性與PTB患病無相關性；攜帶CCR5啟動子區(qū)rs1799987基因-2459位點基因型GG和等位基因G可降低PTB患病風險。

趨化因子類； 多態(tài)性，單核苷酸； 結核，肺； 疾病易感性

肺結核(pulmonary tuberculosis, PTB)是Mtb感染引起的慢性傳染性疾病。目前，全球約有1/3的人感染了Mtb，但僅有5%～10%發(fā)展為PTB[1]，這表明PTB發(fā)病存在個體差異。Mtb感染引起免疫應答時，趨化因子及其受體調節(jié)免疫細胞到達感染部位。進一步研究發(fā)現(xiàn)，含有Mtb氣溶膠吸入人體后，通過形成特征性肉芽腫及多種免疫細胞間的相互作用，可有效控制其感染[2]，而這一過程中趨化因子5(CCL5)起重要作用。CCL5優(yōu)先通過與受體趨化因子受體5(CCR5)結合[3]，募集γ-干擾素(IFN-γ)、抗原特異性T細胞、中性粒細胞及單核細胞等到達炎癥組織，促進肉芽腫形成[2]。CCL5啟動子區(qū)rs2107538基因突變和CCR5啟動子區(qū)rs1799987基因突變影響其轉錄活性[4-5]，與PTB易感性可能存在一定關系。目前，以上2個基因位點多態(tài)性與PTB易感性相關性報道較少，值得進一步研究。本研究應用快速、簡便的競爭性等位基因特異性PCR (kompetitive allele specific PCR，KASP)分型技術，探討CCL5的rs2107538及CCR5的rs1799987基因型和等位基因在PTB人群與健康人群中分布情況，分析其基因多態(tài)性與PTB易感性的關系。

資料和方法

1.對象：選取2014年2月至2015年4月首都醫(yī)科大學附屬北京胸科醫(yī)院收治的確診PTB患者(有細菌學證據者)和臨床診斷PTB患者(無細菌學證據，有影像學證據、可疑臨床癥狀，并排除其他肺部疾病者)作為病例組，共494例。所有患者均符合診斷標準[6]，排除癌癥患者、糖尿病患者、長期使用免疫抑制劑者及HIV感染免疫功能低下者。選取2014年2月至2015年4月胸科醫(yī)院查體確診既往無結核病史，胸部X線攝片檢查未見異常，結核菌素皮膚試驗硬結平均直徑小于5 mm，結核感染T細胞斑點試驗(T-SPOT.TB)結果陰性的健康志愿者作為對照組，共413名。排除兩組中存在血緣關系者。

研究對象中病例組494例，包括男300例(60.7%)，女194例(39.3%)；平均年齡為(35.0±15.0)歲，均為漢族；其中，確診PTB患者213例，臨床診斷PTB患者281例。對照組共413名，包括男240名(58.1%)，女173名(41.9%)；均為漢族，平均年齡為(33.9±12.8)歲。病例組和對照組年齡和性別構成差異無統(tǒng)計學意義(t=2.13，χ2=0.54，P值均>0.05)，具有可比性。本研究已獲得首都醫(yī)科大學附屬北京胸科醫(yī)院科研倫理委員會批準，所有研究對象均簽署知情同意書。

2.DNA提?。翰杉芯繉ο笸庵莒o脈血2 ml，應用全血試劑盒(購自北京百泰克生物技術有限公司)提取基因組DNA。DNA提取質量標準：紫外分光光度計吸光度值A260/280值在1.8～2.0之間。

3.基因分型：采用KASP試劑盒(購自英國LGC有限公司)。使用試劑盒推薦的PCR反應體系，應用ABI7500實時定量PCR進行基因分型。PCR反應條件：95 ℃預熱15 min，10個循環(huán)的降落PCR(94 ℃ 20 s、65 ℃ 25 s、每個循環(huán)降落0.6 ℃)、26個循環(huán)的擴增PCR(94 ℃ 20 s、55 ℃ 60 s)，若基因分型較分散，則通過增加循環(huán)數(shù)，優(yōu)化實驗條件進行調整。數(shù)據分析讀取采用ABI7500系統(tǒng)軟件。引物是由美國Invitrogen公司合成，序列見表1。使用ABI7500實時定量PCR儀讀取基因分型結果。讀取每個樣本等位基因所對應的FAM和HEX熒光信號，形成等位基因分型圖，從而判定待測樣本基因型結果。

表1 趨化因子5啟動子區(qū)rs2107538基因及趨化因子受體5啟動子區(qū)rs1799987基因擴增引物序列

4.質量控制：在基因分型時，每96孔板中設置2個不同基因型已知樣本作為陽性對照，1～2個陰性對照進行質量控制。陽性對照是由北京擎科新業(yè)生物技術有限公司測序，rs2107538測序結果如圖1，rs1799987測序結果如圖2。

a為基因型CC；b為基因型CT圖1 趨化因子5啟動子區(qū)rs2107538基因擴增片段測序結果

a為基因型AA；b為基因型AG圖2 趨化因子受體5啟動子區(qū)rs1799987基因擴增片段測序結果

5.統(tǒng)計學分析：應用R2.11.1軟件進行分析。病例組與對照組研究對象年齡的比較采用兩獨立樣本t檢驗；性別構成的比較采用χ2檢驗。分析各位點基因型頻率是否符合Hardy-Weinberg(HWE)遺傳平衡，計算病例組與對照組各基因型和等位基因的頻數(shù)及頻率，采用χ2檢驗進行組間差異的比較，并計算OR(95%CI)值。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1.Hardy-Weinberg平衡分析：使用R2.11.1軟件中HWE計算公式對兩個基因單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)位點基因型頻數(shù)進行計算，發(fā)現(xiàn)rs2107538和rs1799987基因型頻率在對照組分布均符合遺傳平衡(P>0.05)，提示選取的對照組具有群體代表性。

2.基因多態(tài)性分析：結果發(fā)現(xiàn)，病例組和對照組CCL5啟動子區(qū)rs2107538基因型頻率與等位基因頻率差異均無統(tǒng)計學意義；CCR5啟動子區(qū)rs1799987等位基因頻率和基因型頻率差異均具有統(tǒng)計學意義，攜帶基因型GG和等位基因G可以降低PTB患病風險，而攜帶等位基因A則會增加PTB患病風險，見表2。

表2 趨化因子5啟動子區(qū)rs2107538基因和趨化因子受體5啟動子區(qū)rs1799987基因多態(tài)性分析結果

注 表中括號外數(shù)值為“頻數(shù)”，括號內數(shù)值為“頻率(%)”

討 論

PTB是嚴重危害人類健康的全球公共衛(wèi)生問題，也是我國重點防控的疾病之一。PTB發(fā)病是環(huán)境因素和宿主遺傳因素共同作用的結果。以往研究發(fā)現(xiàn)，CCL5及其受體在抗Mtb感染過程中起重要作用：(1)CCL5與特征性肉芽腫形成有關。Chensue等[7]在感染Mtb的小鼠中發(fā)現(xiàn)高濃度的CCL5與肉芽腫形成有關，抗CCL5藥物應用使肉芽腫成分改變和形成減少，CCL5敲除小鼠無抗原提呈細胞或趨化因子受體陽性T細胞到達肉芽腫組織[8]。(2)在體外實驗中發(fā)現(xiàn)CCL5可以有效抑制Mtb在巨噬細胞內生長[9]。(3)CCL5趨化T細胞、單核細胞及巨噬細胞轉移至炎癥部位[9-10]。Mtb感染時，CCL5蛋白優(yōu)先選擇與CCR5受體結合發(fā)揮免疫學效應。Mtb感染CCR5敲除小鼠后，其早期抗菌能力較野生型小鼠明顯下降[2]，形成的肉芽腫中淋巴細胞、髓細胞數(shù)目增加，同時IFN-γ、誘導性一氧化氮合酶(NOS2)、重組人白細胞介素-12(IL-12)等細胞因子增加，這些成分可有效控制Mtb感染[11]。Pokkali和Das[3]發(fā)現(xiàn)，PTB患者細胞表面的CCR5水平明顯高于健康組。CCL5蛋白表達基因位于17q11，長約8 kb，位于啟動子區(qū)rs2107538的A等位基因與CCL5低表達呈正相關[12]。CCR5蛋白表達基因定為3q21.3，長約1.9 kb，包含4個外顯子和2個內含子，啟動子中-2459A/G突變調整其轉錄活性影響蛋白表達[5]。

本研究未發(fā)現(xiàn)CCL5啟動子區(qū)rs2107538基因-403 G/A多態(tài)性與PTB易感性的相關，與相關報道一致[13-16]。有學者研究發(fā)現(xiàn)，在西班牙北部人群中，等位基因G是結核病保護性因素[17]；在印度人群中，基因型AA是罹患結核病的危險因素[17]。不同地區(qū)研究結果不一致可能與種族、研究對象數(shù)量及納入排除標準有關。推測本研究未發(fā)現(xiàn)相關性的原因可能是：(1)CCL5基因啟動子含有多個調控基因，rs2107538可能是與其他調控基因共同調節(jié)。例如，在中國香港人群單獨研究rs2107538、-28C/G和內含子Inl.1T/C時未發(fā)現(xiàn)其與PTB易感性的關系，而對其單倍體研究時發(fā)現(xiàn)A-C-T和G-C-C可增加結核病患病風險，且-28C/G和Inl.1T/C的基因型組合GA/TT和GG/TC與結核病易感性明顯相關[13]。(2)機體通過復雜的免疫系統(tǒng)調控結核病，CCL5僅是其中一環(huán)，還可被其他趨化因子或通路代償。在CCL5敲除小鼠實驗中發(fā)現(xiàn)，CCL5表達缺乏未改變肉芽腫的形成，僅在早期影響了肉芽腫發(fā)展，中晚期CCL5敲除小鼠肺部形成的肉芽腫反而比野生型小鼠更大更多[8]。

同時，本研究發(fā)現(xiàn)CCR5啟動子區(qū)rs1799987基因-2459 A/G多態(tài)性與PTB易感性相關。其中，攜帶基因型GG和等位基因G可以降低PTB患病風險。Mamtani等[19]在哥倫比亞成年人群中研究也發(fā)現(xiàn)，攜帶rs1799987 G等位基因的HH-單倍體群(包括-2733 A/G, -2554 G/T, -2459 G/A, -2135 T/C, -2132 C/T, -2086 A/G, and -1835 C/T)與PTB易感性相關。CCR5啟動子區(qū)rs1799987基因在對照組中的突變頻率為58%，與南美有色人種(52%)及非洲科薩人(62.5%)相似，遠高于秘魯人(34%)[20]，說明此位點存在種族、地域差異，因此該位點基因多態(tài)性與PTB易感性在不同地區(qū)不同民族可能存在一定差異。

綜上所述，本次研究未發(fā)現(xiàn)CCL5啟動子區(qū)rs2107538基因多態(tài)性與中國漢族PTB發(fā)病相關，其基因多態(tài)性可能不是影響PTB發(fā)病的重要因素；發(fā)現(xiàn)CCR5啟動子區(qū)rs1799987基因多態(tài)性與PTB發(fā)病易感性相關，攜帶基因型GG和等位基因G是PTB患病的保護基因，攜帶等位基因A是PTB患病的危險因素。CCR5基因多態(tài)性在PTB發(fā)生的具體調控機制、調控過程中是否與配體或受體相互作用還需進一步探討。PTB的發(fā)病是多因素共同作用的結果，本研究受研究對象數(shù)量、地域、種族等多種因素影響，結果有待進一步驗證。

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(本文編輯：李敬文)

Relationship between polymorphism of CCL5 gene and CCR5 gene and susceptibility of pulmonary tuberculosis

WAGNHui-lin,WANGWei,LIUJing-ming,LIChuan-you,GAOMeng-qiu.

BeijingChestHospital,CapitalMedicalUniversity;BeijingTuberculosisandThoracicTumorResearchInstitute;BacteriaImmunologyLaboratory,BeijingKeyLaboratoryofDrug-resistantTuberculosisResearch,Beijing101149,China

Correspongdingauthor:GAOMeng-qiu，Email:gaomqwdm@aliyun.com

Objective To study the relationship between CCL5, CCR5 gene polymorphism and susceptibility of pulmonary tuberculosis (PTB). Methods A total of 494 PTB patients from Beijing Chest Hospital, Capital Medical University from February 2014 to April 2015 were selected as case group. Of 413 healthy volunteers were selected as a control group. By collecting venous blood, the single nucleotide polymorphisms (SNPs) ofrs2107538 in CCL5 promoter region andrs1799987 in CCR5 promoter region were detected using competitive allele-specific PCR SNPline program. The genotype and allele frequencies for the SNPs were calculated for case group and control group separately in order to analyze the relationship between CCL5, CCR5 gene polymorphism and susceptibility of PTB. Results For the SNP ofrs2107538 in CCL5, the frequencies for genotype GG, GA, AA and allele G, A were 202 (41%), 224 (45%), 68 (14%), and 628 (64%), 360 (36%) in case group; 152 (38%), 209 (51%), 52 (13%), and 513 (62%), 313 (38%) in control group. There was no statistically significant difference in genotype and allele frequencies between the two groups (χ2=2.50, 0.35, allPvalues >0.05). For the SNP ofrs1799987 in CCR5, the genotype GG, GA, AA and allele G, A frequencies were 99 (20%), 272 (55%), 123 (25%) and 470 (48%), 518 (52%) in case group; 67 (16%), 210 (51%), 136 (33%) and 344 (42%), 482 (58%) in control group. The differences in genotype and allele frequencies between the two groups were statistically significant (χ2=7.62 for genotype frequencies,χ2=6.14 for allele frequencies, allPvalues <0.05). The GG genotype or G allele ofrs1799987 in CCR5 may reduce the risk of PTB (OR(95%CI)：0.68 (0.50-0.91), 0.78(0.64-0.94)). Conclusion There was no correlation betweenrs2107538 polymorphism in CCL5 and susceptibility of PTB. The GG genotype or G allele ofrs1799987 in CCR5 promoter region may reduce the risk of PTB.

Chemotactic factors; Polymorphism, single nucleotide； Tuberculosis, pulmonary； Disease susceptibility

10.3969/j.issn.1000-6621.2016.03.008

北京市醫(yī)院管理局臨床醫(yī)學發(fā)展專項(ZYLX201304)

101149 首都醫(yī)科大學附屬北京胸科醫(yī)院 北京結核病胸部腫瘤研究所 耐藥結核病研究北京市重點實驗室細菌免疫學研究室(王慧琳、王偉、劉京銘、李傳友)；首都醫(yī)科大學附屬北京胸科醫(yī)院結核二科(高孟秋)

高孟秋，Email：gaomqwdm@aliyun.com

2015-11-23)