小花棘豆中毒對和田羊內(nèi)臟器官α—甘露糖苷酶的影響

王帥　廖秋萍　賈琦珍　陳根元

摘要：探討小花棘豆（Oxytropis glabraD C）中毒對和田羊內(nèi)臟器官α-甘露糖苷酶（AMA）的影響，進一步揭示小花棘豆的毒性作用機理。將12只和田羊隨機分為3組，即對照組、試驗Ⅰ組和試驗Ⅱ組。試驗組分別按10g/kg和20g/kg的劑量飼喂小花棘豆，飼喂至出現(xiàn)典型中毒癥狀。屠宰后每組隨機采集試驗羊的肝臟、腎臟、脾臟、心臟和肺臟，檢測和田羊內(nèi)臟器官AMA活性及表達的變化。結(jié)果表明，和田羊肝臟、腎臟、脾臟、心臟和肺臟中高爾基體α-甘露糖苷酶Ⅱ（AMA1）和溶酶體α-甘露糖苷酶（AMA2）均有表達。試驗I組和田羊各器官的AMA2的表達均與對照組差異不顯著（P>0.05），試驗Ⅱ組和田羊肝臟和腎臟AMA2的表達顯著低于對照（P<0.05），但其余器官AMA2的表達均與對照組差異不顯著（P>0.05）；試驗lI組和田羊肝臟和腎臟AMA1的表達極顯著低于對照（P<0.01），脾臟AMAl的表達顯著低于對照（P<0.05）；試驗Ⅰ組和田羊肝臟、腎臟AMA1的表達顯著低于對照（P<0.05），其余器官AMAl的表達均與對照組差異不顯著（P>0.05）。不同劑量小花棘豆均可降低和田羊內(nèi)臟中AMA活性及其mRNA表達量，肝臟和腎臟是其主要作用的靶區(qū)。

關(guān)鍵詞：小花棘豆（Oxytropis glabra DC）；苦馬豆素；α-甘露糖苷酶；內(nèi)臟器官

中圖分類號：S856.9 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）09-2308-05

小花棘豆（Oxytropis glabra DC）是廣泛分布于新疆天然草原的有毒植物之一，具有耐旱、耐貧瘠、返青早、生命力強、繁殖系數(shù)高等特性。是制約新疆草原畜牧業(yè)發(fā)展的重要因素。目前僅南疆阿克蘇、和田地區(qū)天然草場中廣泛叢生小花棘豆的面積已超過20%，每年因采食小花棘豆而中毒的家畜占放牧家畜總數(shù)的5%-10%，其中50%左右的中毒家畜死亡。中毒家畜表現(xiàn)為機體的廣泛性損傷，剖檢發(fā)現(xiàn)其內(nèi)臟器官多出現(xiàn)腫脹等炎癥，病理組織學(xué)表現(xiàn)主要為細胞空泡變性。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，苦馬豆素（Swainsonine，SW）是小花棘豆的主要毒性成分，可通過抑制α-甘露糖苷酶（oL-Mannosidase，AMA）活性，導(dǎo)致機體甘露糖代謝發(fā)生異常而發(fā)揮毒性作用。研究表明，AMA是動物小花棘豆中毒特異性最強的指標，小花棘豆中毒動物的AMA活性受到顯著抑制，但對其轉(zhuǎn)錄、翻譯、加工修飾等的影響尚不清楚。和田羊是新疆南疆地區(qū)的主要放牧品種，占該地區(qū)綿羊存欄數(shù)的70.97%，在畜牧業(yè)生產(chǎn)中占有重要地位。近年來，和田羊小花棘豆中毒已成為該地區(qū)畜牧業(yè)發(fā)展面臨的嚴重問題。本試驗通過ELISA、免疫組化和熒光實時定量PCR。以新疆南疆地區(qū)小花棘豆為試驗材料，研究小花棘豆攻毒對和田羊內(nèi)臟器官AMA活性及分布、表達的影響。為揭示小花棘豆中毒機制提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

健康和田羊12只，雌雄各半，體重（32±1.4）kg，購自同一牧場。小花棘豆風(fēng)干樣采自阿克蘇市溫宿縣佳木鄉(xiāng)，由塔里木大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院草業(yè)科學(xué)學(xué)科組鑒定。

S-P超敏組化試劑盒（福州邁新生物技術(shù)公司）；AMA檢測試劑盒（南京建成生物技術(shù)公司）：反轉(zhuǎn)錄試劑盒、總RNA提取試劑盒、Real-time PCR試劑盒，均購自TAKARA（大連）有限公司。

1.2 試驗動物分組與處理

試驗羊隨機分為對照組、試驗Ⅰ組和試驗Ⅱ組。每組4只。對照羊自由采食青干草。每只每日補飼精料300g，試驗Ⅰ、Ⅱ組飼喂小花棘豆粉，每天分別按10g/kg和20g/kg的劑量與300g精料加水混勻，飼喂3次，即08：00-09：00、14：00M5：00、19：00-20：00，自由采食后飼喂青干草。自由飲水。待出現(xiàn)喜臥、起立困難、以手提耳出現(xiàn)搖頭等典型中毒癥狀后進行屠宰，分別取肝臟、腎臟、脾臟、心臟和肺臟組織，部分進行免疫組化染色分析，部分利用冰生理鹽水制備10%組織勻漿液用于檢測AMA活性，部分液氮保存用于檢測mRNA水平表達的影響。所有解剖工具及凍存管均需用DEPC預(yù)處理。

1.3 AMA在中毒羊內(nèi)臟器官組織的分布

和田羊內(nèi)臟器官組織均使用4%多聚甲醛固定，梯度酒精脫水，二甲苯透明后進行石蠟包埋。包埋組織進行連續(xù)切片，片厚6μm，二甲苯脫蠟，梯度酒精復(fù)水，然后按照試劑盒說明操作。其中抗體稀釋比為1/100，DAB顯色。使用PBS為陰性對照。常規(guī)脫水，透明，封片，光鏡下觀察組織病理學(xué)變化。采用hnage-ProPlus6.0軟件對免疫組化獲得照片進行分析。

1.4 AMA活性測定

按照試劑盒說明書，采用間接ELISA法測定和田羊內(nèi)臟器官組織中AMA活性。具體步驟為：標準品稀釋→加樣→溫育→洗滌→加酶→溫育→洗滌→顯色→終止→測定。

1.5 AMA表達水平的測定

1.5.1 引物設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank中綿羊高

爾基體α-甘露糖苷酶Ⅱ（AMAl）、溶酶體α-甘露糖苷酶（AMA2）和Bβ-actin基因的核苷酸序列，采用BeaconDesigner軟件設(shè)計引物，引物見表1，由TAKARA（大連）有限公司合成。

1.5.2 總RNA提取與cDNA合成 參照TAKARA總RNA提取試劑盒（D9108）說明書提取綿羊待測組織總RNA，通過檢測OD_260nm和瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，將合格RNA利用gDNAEraser去除基因組DNA，反應(yīng)條件：42℃，2min。然后采用兩步法進行反轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)體系：PrimeScriptBuffer5x4.0μL，PrimeScriptRTEnzymeMixI1.0μL，RTPrimerMix1.0μL，RNA提取液10.0μL，RNaseFreedH₂O4.0μL：反應(yīng)條件：37℃反應(yīng)15min，85℃反應(yīng)5s，-20℃保存。

1.5.3 普通PCR及基因測序 PCR反應(yīng)體系：2xTaq PCR Master Mix12.5μL，模板cDNA2.0μL，上、下游引物各2.0μL，ddH₂O6.5μL；各反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性5min：94℃變性20s，58℃退火30s，72℃延伸30s，30個循環(huán)：72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物送至TAKARA（大連）有限公司測序。

1.5.4實時熒光定量PCR檢測和田羊內(nèi)臟器官中AMA的相對表達 實時熒光定量PCR反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex Taq 2×10，0μL，上、下游引物各0.8μL，ROXReferenceDyeⅡ50×0.4μL，cDNA液2.0μL，RNaseFreeddH₂O6，0μL；反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30s：95%變性5s，60℃退火34s，72℃延伸30s。40個循環(huán)：72℃延伸10min。按反應(yīng)體系及條件進行實時熒光定量PCR，得到各部分Ct值，采用雙標準曲線法對所得實時熒光定量PCR結(jié)果進行分析。

1.6 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)用SPSS16.0軟件進行分析，通過One-WayANOVA方法分析單因素方差，結(jié)果用平均值±標準差來表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 AMA在和田羊內(nèi)臟器官組織中的分布

由圖1可知，AMA在和田羊的肝臟組織、腎臟皮質(zhì)區(qū)、腎臟髓質(zhì)區(qū)、脾臟紅髓、脾臟白髓、脾臟小梁、心肌組織、肺泡組織等區(qū)域均有分布。但在肝臟中央靜脈、小葉間靜脈、小葉間動脈、腎小球細胞和腎小管細胞中染色極淡，表明在這些區(qū)域AMA表達較弱或不表達。小花棘豆攻毒羊肝細胞、腎臟皮質(zhì)區(qū)和髓質(zhì)區(qū)細胞、脾臟紅髓、脾臟小梁中AMA的染色明顯變淡。其中試驗Ⅱ組和田羊肝細胞、腎臟皮質(zhì)區(qū)和髓質(zhì)區(qū)細胞中AMA免疫組化染色極淡，表明這些區(qū)域AMA已經(jīng)幾乎不表達。

2.2 引物的可靠性驗證

由圖2可知，β-actin在100bp左右出現(xiàn)條帶，AMA1和AMA2基因分別在100bp和200bp間出現(xiàn)2條清晰條帶，與試驗設(shè)計的目的條帶大小相符，表明引物設(shè)計良好。

2.3 和田羊內(nèi)臟器官AMA活性的變化

由表2可知，試驗組和田羊內(nèi)臟器官AMA活性與對照組相比均有一定程度的下降，其中試驗Ⅰ組和田羊脾臟、心臟和肺臟與試驗Ⅱ組和田羊心臟、肺臟AMA活性均顯著低于對照（P<0.05），試驗Ⅰ組和田羊肝臟、腎臟和試驗Ⅱ組和田羊肝臟、腎臟和脾臟AMA活性均極顯著低于對照（P<0.01）。試驗表明，長時間、大劑量的攝食小花棘豆可顯著影響和田羊內(nèi)臟器官AMA活性，其中小花棘豆中毒對肝臟和腎臟的影響最為明顯。

2.4 和田羊小花棘豆中毒對內(nèi)臟器官AMA1在mRNA表達水平的影響

由表3可知，試驗組和田羊內(nèi)臟器官中AMA1均有表達。與對照組相比。試驗Ⅰ組和田羊肝臟、腎臟與試驗Ⅱ組和田羊脾臟AMA1mRNA表達量顯著低于對照（P<0.05）：試驗Ⅱ組和田羊肝臟與腎臟中AMA1mRNA表達量均極顯著低于對照（P<0.01）。其余指標均與對照組差異不顯著（P>0.05）。試驗結(jié)果表明，大劑量、長時間的飼喂小花棘豆可顯著影響和田羊肝臟、腎臟和脾臟的AMA1在mR-NA的表達水平。

2.5 和田羊小花棘豆中毒對內(nèi)臟器官AMA2在mRNA水平表達的影響

由表4可知，通過小花棘豆的攻毒飼喂，各試驗組和田羊內(nèi)臟器官AMA2mRNA表達量均有不同程度的下降，其中試驗Ⅱ組和田羊肝臟與腎臟中AMA2mRNA表達量均顯著低于對照（P<0.05），但其余臟器指標均與對照組差異不顯著（P>0.05）。試驗表明，小花棘豆中毒對和田羊內(nèi)臟器官AMA1mRNA表達量的影響較為顯著，對AMA2mRNA表達量的影響不明顯。

2.6 和田羊小花棘豆中毒對臟器中AMA基因序列的影響

經(jīng)DNAStar軟件分析及NCBIBlast比對，試驗Ⅰ組和田羊肺臟和心臟AMA與公布的基因序列完全一致，脾臟AMA與公布的基因序列重合率大于99%，表明低劑量小花棘豆中毒對和田羊肺臟、心臟及脾臟AMA的表達均無顯著影響。試驗Ⅰ組和試驗Ⅱ組和田羊肝臟、腎臟AMA與公布的基因序列有較大差異，其中試驗Ⅰ組和試驗Ⅱ組和田羊肝臟AMA1與公布的基因序列重合率分別只有93%和90%，腎臟AMA1與公布的基因序列重合率分別只有93%和91%，但各試驗組和田羊AMA2與公布的基因序列重合率均在95%以上，表明小花棘豆中毒對和田羊內(nèi)臟器官中AMA1有顯著影響。

3 討論

小花棘豆化學(xué)成分組成復(fù)雜，國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)小花棘豆含有生物堿、皂苷、黃酮、揮發(fā)油、酚類、有毒蛋白等多種活性物質(zhì)，其中吲哚里西啶類生物堿苦馬豆素被多數(shù)研究者確認為小花棘豆的主要毒性成分。目前研究認為，苦馬豆素陽離子呈半椅狀結(jié)構(gòu)，而甘露糖苷在酶水解的過程中其陽離子也形成了半椅狀的立體構(gòu)型，二者極為類似，故苦馬豆素對AMA具有極高的親和性：另據(jù)化學(xué)分析表明?？囫R豆素的吲哚里西啶環(huán)上結(jié)合有3個羥基，其中的順式二醇官能團和對位的羥基可增加苦馬豆素同甘露糖陽離子的相似性，分子間的氫鍵又增加了苦馬豆素與AMA結(jié)合的特異性，并在其糖基化修飾甘露糖低聚糖的過程中發(fā)揮作用，造成甘露糖代謝障礙，最終因低聚糖大量蓄積而導(dǎo)致動物細胞損傷。賈琦珍等研究表明小花棘豆中毒可導(dǎo)致動物臟器損傷，而且肝臟指數(shù)、腎臟指數(shù)、脾臟指數(shù)與小花棘豆中毒均極顯著相關(guān)（P<0.01）。心臟指數(shù)與肺臟指數(shù)與小花棘豆中毒均顯著相關(guān)（P<0.05）。丁伯良等研究認為甘肅棘豆（主要毒性成分為苦馬豆素）中毒山羊組織細胞的空泡變性與AMA活性下降有關(guān)，本試驗發(fā)現(xiàn)AMA在和田羊內(nèi)臟器官組織中均有分布，小花棘豆中毒和田羊內(nèi)臟器官中AMA活性顯著下降，而且與時間一劑量呈正相關(guān)。表明苦馬豆索可通過影響AMA導(dǎo)致動物中毒。

在哺乳動物細胞組織中存在3種結(jié)構(gòu)形式不同的AMA，其主要在糖基化修飾低聚糖過程中發(fā)揮重要作用，是N-聚糖成熟和降解的必要酶，也可在N-糖基化過程中加工甘露糖。不同的AMA可降解各類糖蛋白中的低聚糖苷，從而影響蛋白的折疊、成熟等過程，苦馬豆素與甘露糖競爭性結(jié)合AMA可導(dǎo)致糖蛋白構(gòu)象及生物活性改變，中毒動物出現(xiàn)溶酶體蓄積病的典型癥狀，Douglas等研究發(fā)現(xiàn)苦馬豆素可顯著影響AMA的表達，并認為苦馬豆素對AMA的抑制不僅是因為空間結(jié)構(gòu)的相似，還因為弱堿性的苦馬豆素極易與酸性的AMA結(jié)合。賈琦珍等研究表明苦馬豆索可顯著抑制AMA在家兔腦組織中的表達，長時間、高劑量的攝入苦馬豆索可極顯著抑制AMA1在家兔小腦、丘腦和大腦組織中的mRNA表達量。本試驗研究發(fā)現(xiàn)，小花棘豆毒性成分SW可影響和田羊內(nèi)臟器官中AMA1和AMA2在mRNA水平的表達，而且其對AMA1的影響較為顯著。該結(jié)果與榮杰、宋巖巖、張建軍等的研究結(jié)果一致。另外免疫組化試驗發(fā)現(xiàn)小花棘豆中毒和田羊內(nèi)臟器官中AMA蛋白表達均有一定程度的下降，而且高劑量小花棘豆攻毒可導(dǎo)致和田羊內(nèi)臟器官AMA蛋白表達受到顯著抑制。中、高劑量苦馬豆素均可顯著降低中毒綿羊肝臟、腎臟AMA1基因序列與公布的基因序列的重合率，高劑量組攻毒綿羊肝臟AMA1基因序列與NCBI公布的序列重合率僅有90%，表明綿羊小花棘豆中毒可顯著影響AMA1mRNA表達水平、蛋白表達水平和基因序列組成。

Doudas等研究發(fā)現(xiàn)苦馬豆素是AMA1的高效抑制劑，而且這種抑制作用極為專一：對AMA2、β-甘露糖苷酶等不能完全抑制。本研究結(jié)果與之一致。苦馬豆素的弱堿性質(zhì)及其空間結(jié)構(gòu)特性，使A-MA1與苦馬豆素極易結(jié)合，導(dǎo)致蛋白合成異常，出現(xiàn)天冬酰胺-糖蛋白聚合體。不同的動物、中毒組織及攻毒植物可導(dǎo)致不同的低聚糖組成，中毒綿羊的肝、腎組織中低聚糖主要為甘露糖-葡萄糖-N-乙?；咸烟?，中毒動物細胞內(nèi)大量蓄積低聚糖可造成組織、器官等損傷及發(fā)生功能性障礙。其中神經(jīng)系統(tǒng)損害出現(xiàn)最早，其損傷為不可逆并多伴有神經(jīng)細胞損傷：生殖系統(tǒng)損傷出現(xiàn)較晚。但影響最為廣泛，并可透過胎盤屏障影響胎兒健康，肝臟是動物最重要的解毒器官，腎臟是動物重要的排泄器官。但苦馬豆素對動物肝臟、腎臟影響的微觀機制研究較少。本試驗研究了苦馬豆素對綿羊肝臟、腎臟AMA活性、mRNA表達水平、蛋白表達水平和基因序列組成的影響，為動物小花棘豆中毒機制的研究提供了一定的基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

小花棘豆中毒可導(dǎo)致和田羊內(nèi)臟器官AMA活性與表達水平顯著下降，而且下降趨勢與小花棘豆攝入量呈顯著正相關(guān)。小花棘豆中毒對肝臟、腎臟AMA1的影響較為顯著，其可通過mRNA水平和蛋白表達水平影響AMA1在肝臟和腎臟中的作用。