標本溶血對ELISA法檢測25—OH維生素D3的影響

周后鋼 毛安華 譚浩

摘要：目的 分析標本溶血對ELISA法檢測25-OH維生素D3的影響，以評估溶血標本血漿25-OH維生素D3結果的準確性。方法 將正常標本分為兩份，利用物理震蕩法制備一份溶血標本，用ELISA競爭法分別檢測溶血標本和正常標本血漿25-OH維生素D3水平，比較兩組結果的差異；并檢測溶血標本游離血紅蛋白，分析游離血紅蛋白與25-OH維生素D3偏倚的相關性。結果 溶血標本血漿25-OH維生素D3結果顯著降低，其血漿游離血紅蛋白與25-OH維生素D3偏倚呈正相關。結論 標本溶血影響25-OH維生素D3的檢測，檢測結果差異與溶血程度呈正相關，臨床工作中碰到溶血標本應通知重抽標本檢測。

關鍵詞：溶血；ELISA；25羥維生素D

維生素D（Vitamin D，VD）是膽固醇在紫外線作用下轉換生成的一種人體必需的脂溶性維生素，在調節(jié)機體鈣、磷代謝方面發(fā)揮著非常重要的作用。近年來，維生素D又被發(fā)現(xiàn)與細胞增殖與分化以及免疫功能有著密切的聯(lián)系。25羥維生素D3（25-OH Vitamin D3，25-OHD3）是維生素D在人體內的主要循環(huán)活性形式。臨床上常常檢測血液中25-OHD3水平，用于評估維生素D的營養(yǎng)狀況、診斷兒童VD缺乏以及調整口服維生素D的用量等。目前檢測25-OHD3主要方法有色譜法、化學發(fā)光法和酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA），其中ELISA檢測25-OHD3由于操作簡單、標本用量少、成本低廉以及實用范圍廣而成為臨床上檢測25-OHD3最常用的方法。本文主要探討標本溶血對ELISA法檢測25-OHD3水平的影響，以評價溶血標本25-OHD3結果的可靠性。

1資料與方法

1.1一般資料 本院2015年7月～10月兒童保健科、兒科門診及住院檢測25-OHD3的兒童42例，年齡為2歲～6歲，男童15例，女童27例，剔除脂血和黃疸標本。

1.2試劑與儀器 25-OHD3檢測ELISA試劑盒為廣州菲康生物技術有限公司生產(chǎn)，批號為：B15307；游離血紅蛋白檢測試劑盒購自北京瑞爾達生物科技有限公司；洗板機和酶標儀均由雷杜公司提供；真空采血管和抗凝劑有湖北金杏科技發(fā)展有限公司提供。

1.3標本采集與處理 真空采血法采集研究對象肘靜脈血，EDTA-K2抗凝，搖勻，分成兩管，一管用于制備溶血標本，然后以4 000 r/min離心5 min分離血漿，不能及時檢測的血漿標本置于-20℃冷藏，避免反復凍融。

1.4方法

1.4.1溶血標本的制作 將分出的一管EDTA-K2抗凝血，利用物理震蕩方法制備溶血標本。

1.4.2將正常標本和制作的溶血標本離心，取血漿用于檢測。

1.4.3按照試劑盒說明書的操作步驟檢測溶血標本血漿游離血紅蛋白。

1.4.4按照ELISA試劑盒操作步驟同時檢測正常標本和溶血標本血漿25-OHD3，每個樣本均做平行孔，取均值。高值和低值質控均在控。

1.5統(tǒng)計學方法 用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料用x±s表示，兩配對樣本之間的比較采用配對t檢驗；兩組數(shù)據(jù)之間的相關性采用Pearson直線相關分析。

2結果

2.1正常標本與溶血標本血漿25-OHD 3水平的差異 溶血標本血漿25-OHD3水平（57.6±22.3）nmol/L明顯低于正常標本（65.4±19.1）nmol/L，差異具有有統(tǒng)計學意義（t=23.134，P<0.01）。

2.2血漿游離血紅蛋白與25-OHD 3偏倚的相關性 偏倚Bias=（正常標本血漿25-OHD 3-溶血標本血漿25-OHD 3）/正常標本血漿25-OHD3×100%。將溶血標本血漿游離血紅蛋白與偏倚進行相關分析，結果表明，二者之間呈顯著正相關（r=0.6692，P<0.01），二者相關散點圖見圖1。

圖1 游離血紅蛋白與25-OHD3偏倚的相關性

3討論

維生素D在體內經(jīng)肝臟和腎臟代謝后生成1，25-二羥維生素D，后者是維生素D在體內的活性形式，是該磷代謝的的主要調節(jié)因子之一，促進鈣的吸收是其主要功能之一。研究表明，維生素D在缺鈣、佝僂病發(fā)生之前數(shù)月就已經(jīng)開始缺乏，因此，定期測定體25-OHD3是預防佝僂病發(fā)生的重要措施。Belderbos ME等研究表明[1]，低臍帶血25-OHD3的嬰兒在1年之內更加容易發(fā)生病毒性的呼吸道感染。曲輝等也發(fā)現(xiàn)[2]，體內維生素D不足的兒童更加容易發(fā)生反復的呼吸道感染。不難推測，定期測定嬰兒與兒童血漿中25-OHD3，及時補充及處理，對提高兒童免疫功能及預防呼吸道感染也有著重要的臨床意義。目前，測定25-OHD3的方法主要有色譜法和免疫學方法。臨床上用的較多的是ELISA測定25-OHD3。ELISA是結合抗原抗體反應的特異性和酶催化的敏感性建立起來的便捷、經(jīng)濟的免疫學方法，操作簡便，實用范圍廣，但是影響因素較多。不少學者已報道[3-5]，溶血可干擾ELISA檢測乙肝表面抗原和艾滋抗體的檢測，造成假陽性的結果。本研究中，溶血標本血漿25-OHD3明顯低于正常標本，而且在一定的溶血程度范圍內，檢測受干擾的程度與標本中游離血紅蛋白呈正相關，說明溶血越厲害，25-OHD3檢測值越低。這可用游離血紅蛋白吸附于反應孔來解釋：本研究檢測25-OHD3采用的是競爭法，顏色越深，25-OHD3值越低，因此，當游離血紅蛋白吸附于反應孔時，催化TMB產(chǎn)生顏色反應，導致顏色加深，結果是導致檢測結果降低。因此，我們在臨床檢測25-OHD3的工作中，如碰到溶血標本，應該通知臨床重抽標本，對于沒法重抽的"讓步檢驗"標本，應與臨床進行溝通，告知溶血對結果的影響，以免對臨床診斷和治療效果產(chǎn)生不良的影響。

參考文獻：

[1]Belderbos ME，Houben ML，Wilbrink B，et al.Cord blood vitamin D deficiency is associated with respiratory syncytial virus bronchiolitis[J].Pediatrics，2011，127（6）：e1513-e1520.

[2]曲輝，康凱，付姝麗，等.血清維生素D水平與兒童反復呼吸道感染的關系[J].實用兒科臨床雜志，2012，2（22）：1738-1739.

[3]何星，黃小明.溶血標本在ELISA二步法中對HBsAg測定結果的影響[J].中國輸血雜志，2013，26（9）：900-902.

[4]薛俊太，鄧翠華，王惟，等.溶血標本在ELISA一步法和二步法中對HBVM測定結果的影響[J].檢驗醫(yī)學與臨床，2009，6（14）：1126-1127.

[5]岳展伊.溶血對ELISA檢測HIV抗體影響的臨床分析[J].中外醫(yī)療，2010，2：34.編輯/丁一