尿Smad1是2型糖尿病腎病的診斷指標(biāo)

李巧 李佳縈 朱章志 馮烈 萬曉剛 黃開顏 張創(chuàng)標(biāo)

【摘 要】 目的 本研究旨在通過觀察2型糖尿病患者尿Smad1的排泄水平，探討尿Smad1對糖尿病腎病診斷方面的臨床意義。方法 選擇來自廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科和暨南大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科166例2型糖尿病患者。將他們按尿微量白蛋白與肌酐比值（ACR）分為正常白蛋白尿組（NAU）、低值白蛋白尿組（LAU） 、高值白蛋白尿組（HAU）、極高值白蛋白尿組（VHAU）。其中，LAU、 HAU和VHAU作為糖尿病腎病組，NAU作為糖尿病非腎病組，并以80例健康體檢者作為對照組。采用酶聯(lián)免疫吸附法（Elisa）檢測尿標(biāo)本中Smad1濃度，并以尿Smad1與肌酐比值（SCR）作為標(biāo)準(zhǔn)數(shù)值，SCR取對數(shù)值。 結(jié)果 1. 糖尿病腎病組SCR較糖尿病非腎病組高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），而糖尿病非腎病組SCR與對照組無明顯差異（P>0.05）。2.LAU組SCR與NAU組沒有明顯差別（P>0.05）。3.VHAU組SCR較HAU組和LAU組高，HAU組較LAU組高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 本研究表明尿Smad1可以作為2型糖尿病腎病診斷的新型指標(biāo)，但不能預(yù)測早期糖尿病腎病。

【關(guān)鍵詞】 尿Smad1 糖尿病腎病 診斷指標(biāo)

【Abstract】 Objective The aim of this study was to analyze urinary Smad1 level in patients with type 2 diabetes， explore the possibility of Smad1 being a indicator for early diagnosis. Methods 166 subjects with type 2diabetes and 80 healthy volunteers were enrolled. Subjects were grouped according to urine albumin to creatinine ratio（ACR） into： normal albumin in urine （NAU）， low albumin in urine （LAU）， high albumin in urine （HAU）， and very high albumin in urine （VHAU）. Among those， LAU， HAU， and VHAU were regarded as the diabetic nephropathy group（DN group）， NAU was regarded as nondiabetic nephropathy（non-DN group）， and the healthy volunteers were the controls. Enzyme-linked immunosorbent assay was used todetect the urinary Smad1 concentration， urinary Smad1 to creatinine ratio （SCR） was used as the standard reference. Results Compared with non-DN group， SCR of DN group was higher （P<0.05）， while there was no difference between the non-DN group and controls （P>0.05）. There was no significant difference for SCR between LAU and NAU groups （P>0.05）. The SCR was higher in VHAU groupthan those in HAU and LAU groups， and higher in HAU than that in LAU group （P<0.05）. Conclusion It suggested that the urinary Smad1 may be a new potential diagnostic indicator for DN. However， it cannot predict the earliest DN.

【Keywords】 Urinary Smad1； Diabetic nephropathy ； diagnostic indicator

糖尿病腎病是糖尿病嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥，臨床上30%-40%的糖尿病患者最終會發(fā)展成糖尿病腎病。糖尿病腎病是導(dǎo)致終末期腎功能衰竭的主要原因之一，在歐美國家，接受透析的終末期腎病中40%是由糖尿病腎病引起的。糖尿病腎病早期若及時干預(yù)腎功能可恢復(fù)，但早期癥狀不典型，且常規(guī)實驗室檢查敏感性低，而一旦發(fā)展為臨床腎病就很難逆轉(zhuǎn)。故早期發(fā)現(xiàn)，早期干預(yù)，對控制和延緩糖尿病腎病進(jìn)展具有重要的臨床意義。目前微量白蛋白尿[1]、Cys -C、tHcy、hs-CRP、GFR及腎活檢等都可用于早期糖尿病腎病的診斷。腎活檢雖然是金標(biāo)準(zhǔn)，但其為有創(chuàng)性檢查，故目前臨床上最常用的指標(biāo)是微量白蛋白尿與肌酐比值（ACR） 。但ACR受運(yùn)動、血壓、尿路感染等多種因素干擾，所以存在一定的誤診率。而其他指標(biāo)出現(xiàn)在糖尿病腎病相對較晚的階段，且機(jī)制難以解釋，故在臨床上未得到廣泛應(yīng)用。因此，尋找一個更可靠的能夠早期診斷糖尿病腎病的無創(chuàng)性指標(biāo)顯得非常重要。

目前已有較多糖尿病小鼠模型研究[2-3]發(fā)現(xiàn)，尿Smad1 的排泄水平與腎小球系膜基質(zhì)積聚的程度呈明顯正相關(guān)，而與白蛋白尿的關(guān)聯(lián)卻不大。而有關(guān)尿Smad1與2型糖尿病腎病的臨床研究極少，有研究認(rèn)為尿Smad1可以作為2型糖尿病腎病診斷的指標(biāo)[4-5]，而有研究則得到相反的結(jié)論[6]。鑒于目前的研究多限于動物實驗而缺乏臨床資料，且臨床研究結(jié)論不一致，故本研究通過較大樣本、多中心合作再次探討尿Smad1與糖尿病腎病的關(guān)系。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選擇廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科和暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科2014年3月至2015年7月間收治的符合WHO 1999年糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)的2型糖尿病患者共166例，平均年齡（57.12±10.69）歲；平均病程（7.87±3.18）年。健康體檢者80例，平均年齡（56.56±7.64）歲。糖尿病視網(wǎng)膜病變診斷標(biāo)準(zhǔn)以國際臨床分級標(biāo)準(zhǔn)為準(zhǔn)，并以2009年NKF和FDA研討會對白蛋白尿的分級[7]作為糖尿病腎病的診斷依據(jù)（正常：ACR<10mg/g；低值：ACR為10-29mg/g；高值：ACR為30-300 mg/g；極高值：ACR>300 mg/g。）。本研究中凡已確診為2型糖尿病，病程超過5年，并且伴視網(wǎng)膜病變，在排除其他原因引起的蛋白尿增多情況下，3-6個月ACR3次檢測中至少2次大于10-29mg/g，可臨床診斷為糖尿病腎病。此外，本研究將低值白蛋白尿（ACR：10-29mg/g）視為早期糖尿病腎病，這與以往的診斷標(biāo)準(zhǔn)（ACR：30-300mg/g）不同。并排除1型糖尿病者、合并感染，酮癥酸中毒等急性并發(fā)癥者、合并原發(fā)性及其他繼發(fā)腎臟病變者等。本研究獲得廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院及暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 分組

根據(jù)2009年NKF和FDA研討會對尿ACR的重新分級將2型糖尿病患者分為正常白蛋白尿組（NAU）、低值白蛋白尿組（LAU） 、高值白蛋白尿組（HAU）、極高值白蛋白尿組（VHAU）。其中，LAU、 HAU和VHAU作為糖尿病腎病組，NAU作為糖尿病非腎病組，并以健康人群作為對照組。

1.2.2 觀察指標(biāo)

尿Smad1、ACR、HbAlc、FPG、血脂、腎功能、眼底檢查等。

1.2.3 Smad1（人信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子1）的檢測

用無菌管收集所有納入人群新鮮晨尿， 于常溫下3000r/ min 離心20min，仔細(xì)收集上清，于-80℃保存，使用前迅速解凍并離心以去除尿酸或磷酸鹽成分。采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法（ Elisa）定量測定尿Smad1濃度。所有Elisa過程均在96孔板（試劑盒購美國R&D公司）中進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗所得全部數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析。SCR結(jié)果為非正態(tài)分布資料經(jīng)自然對數(shù)校正為正態(tài)分布。多樣本間均數(shù)比較采用方差分析，多樣本間率的比較采用x2檢驗，以ROC曲線評價診斷試驗的特異度和敏感度。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 所有納入人群臨床指標(biāo)比較（見表1）

經(jīng)完全隨機(jī)設(shè)計的方差分析及X2檢驗，2型糖尿病患者與對照組年齡、性別、BMI、SBP、BUN、Cr等基線指標(biāo)具有良好的可比性（P>0.05）；而2型糖尿病患者FPG、HbA1c、ACR、Cys-c較健康人群高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

2.2 糖尿病腎病組、糖尿病非腎病組與對照組SCR比較（見表2）

經(jīng)完全隨機(jī)設(shè)計的方差分析， 糖尿病腎病組SCR較糖尿病非腎病組高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），而糖尿病非腎病組SCR與對照組無明顯差異（P>0.05）。

2.3 SCR診斷糖尿病腎病的靈敏度和特異度（見圖1）

受試者工作特征（ROC）曲線下面積為0.930，可認(rèn)為SCR對糖尿病腎病的診斷價值較高。在截斷點(diǎn)≧0.86處兼顧了靈敏度（88.7%）和特異度（83.0%）均較高。

2.4 2型糖尿病患者各亞組SCR比較（見表3）

經(jīng)完全隨機(jī)設(shè)計的方差分析，各亞組間SCR不同，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P =0.000，P<0.05）。經(jīng)多個樣本均數(shù)間兩兩比較的SNK檢驗，LAU組SCR與NAU組沒有差別（P>0.05），VHAU組SCR比HAU組、LAU組高，HAU組比LAU組高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

3 討論

目前2型糖尿病腎病的分期方法仍沿用1989年Mogensen 提出的1型糖尿病腎病分期標(biāo)準(zhǔn)。然而，最近的研究[8] 發(fā)現(xiàn)，由于內(nèi)皮結(jié)構(gòu)失調(diào)，在白蛋白尿低于30mg/g時，GFR已經(jīng)出現(xiàn)下降，并且腎臟及心血管損害的風(fēng)險也隨之增高。因此，2009年NKF和FDA研討會[7]在原來的“正常白蛋白尿”中增加了“低值白蛋白尿（ACR 10-29mg/d或10-29mg/g）”的定義。故本研究以此為依據(jù)將ACR 在10-29mg/g即“低值白蛋白尿期”視為早期糖尿病腎病，這與Mogensen分期有所不同。

糖尿病腎病是高糖所致的全身及腎內(nèi)多種細(xì)胞因子、生長因子的表達(dá)和調(diào)節(jié)的作用結(jié)果。早期腎臟病理特點(diǎn)主要是細(xì)胞外基質(zhì)的聚集。IV型膠原是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，而TGF-β可引起細(xì)胞外基質(zhì)積聚。Smad蛋白是TGF-β下游重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，介導(dǎo)Smads通路的胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而調(diào)節(jié)IV型膠原的表達(dá)。

目前的動物模型研究發(fā)現(xiàn)Smad1過表達(dá)的糖尿病大鼠腎小球系膜基質(zhì)的聚集增加了1-1.5倍，而Smad1過表達(dá)的非糖尿病大鼠未出現(xiàn)腎臟組織的改變。此外，將糖尿病大鼠雜合體Smad1基因敲出后，腎小球系膜基質(zhì)聚集的程度減輕[9]。表明腎小球Smad1與早期系膜基質(zhì)的積聚密切相關(guān)。糖尿病腎病小鼠模型研究還發(fā)現(xiàn)，小鼠尿中Smad1的水平也與早期腎小球系膜基質(zhì)積聚程度明顯正相關(guān)，而白蛋白尿水平與之關(guān)聯(lián)不大[2]。使用TGF-β抗體治療后系膜基質(zhì)聚集的程度減輕，而蛋白尿并未減少[10]。因此認(rèn)為尿Smad1可以用于糖尿病腎病的早期診斷，且優(yōu)于白蛋白尿。本研究中糖尿病腎病組尿Smad1濃度高于糖尿病非腎病組和對照組，且通過繪制ROC曲線發(fā)現(xiàn)尿Smad1對糖尿病腎病的診斷價值較高（診斷價值： ROC曲線下面積≤0.7較低；>0.7且≤0.9中等；>0.9較高。本研究曲線下面積為0.930），由此推測尿Smad1可以作為糖尿病腎病的診斷指標(biāo)。但在本研究中，糖尿病腎病早期已經(jīng)出現(xiàn)低值白蛋白尿（ACR：10-29mg/g）的患者與正常白蛋白尿患者尿Smad1的水平無明顯差別。由此認(rèn)為尿Smad1雖然可以作為糖尿病腎病的診斷指標(biāo)，但不能預(yù)測早期糖尿病腎病。不一致的結(jié)論可能是由于尿Smad1側(cè)重于反映糖尿病腎病腎臟形態(tài)學(xué)改變，而白蛋白尿則主要是反映糖尿病腎病腎臟功能的改變，而形態(tài)與功能的改變并不完全一致[2]。從另一側(cè)面表明糖尿病腎病中蛋白尿的出現(xiàn)與系膜基質(zhì)的聚集可能是基于不同的發(fā)病機(jī)制。但值得注意的是，本研究中尿Smad1不能預(yù)測早期糖尿病腎病這一結(jié)論是在以低值白蛋白尿（ACR：10-29mg/g）為早期糖尿病腎病標(biāo)準(zhǔn)下得到的，若以Mogensen分期為準(zhǔn)則得到相反的結(jié)論（表4）。該研究結(jié)果從另一個角度表明2009年NKF和FDA對白蛋白尿的重新分級可能不適合作為糖尿病腎病新的分期標(biāo)準(zhǔn)。

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，VHAU組尿Smad1含量比HAU組、LAU組高，HAU組比LAU組高，即隨著糖尿病腎病的進(jìn)展，尿Smad1濃度隨白蛋白尿的增加而升高，表明尿Smad1與糖尿病腎病病情進(jìn)展相關(guān)。這與以往的研究結(jié)論是一致的[2-3]。

總之，本研究表明尿Smad1可以糖尿病腎病診斷的新型生物指標(biāo)，并可以判斷糖尿病腎病病情進(jìn)展程度，但不能預(yù)測早期糖尿病腎病。但本研究ROC曲線的繪制是以ACR而不是腎活檢為金標(biāo)準(zhǔn)的，因此結(jié)果可能存在偏倚。故尿Smad1對糖尿病腎病的診斷價值尚需更多的研究進(jìn)一步闡明。

參考文獻(xiàn)

[1] deBoer IH， Rue TC， Cleary PA， et al. Long-term renal outcomes of patients with type 1 diabetes mellitus and microalbuminuria： an analysis of the Diabetes Control and Complications Trial/Epidemiology of Diabetes Interventions and Complications cohort[J]. Arch Intern Med， 2011， 171（5）：412-420.

[2] Matsubara T， Abe H， Mima A， et al. Expression of Smad1 is directly associated with Mesantial matrix expansion in rat diabetic nephropathy[J].Lab Invest， 2006， 86： 357-368.

[3] Mima A， Arai H， Abe H， et al. Urinary Smad1 is a novel marker to predict later onset of mesangial matrix expansion in diabetic nephropathy[J].Diabetes， 2008， 57： 1712-1722.

[4] Fu WJ， Fang YG， Deng RT， et al. Correlation of high urinary Smad1 level with glomerular hyperfiltration in type 2 diabetes mellitus[J]. Endocrine， 2013， 43（2）：346-350.

[5] Li Q， Feng L， Li J， et al.Urinary Smad1 is a new biomarker for diagnosis and evaluating the severity of diabetic nephropathy[J]. Endocrine， 2014 ， 46（1）：83-89.

[6] Shu SH， Li M， Shi BY， et al. Signal protein Smad1 preliminary study of the type 2 diabetic nephropathy diagnosis significance [J]. China general medicine， 2012，15（4A）：1127-1129.[周淑紅，李蒙，施秉銀，等.信號蛋白Smad1對2型糖尿病腎病診斷意義的初步研究[J].中國全科醫(yī)學(xué)，2012，15（4A）：1127-1129.]

[7] Levey AS Cattran D， Friedman A， et al. Proteinuria as a surrogate outcome in CKD： report of a scientific workshop sponsored by the National Kidney Foundation and the US Food and Drug Administration[J]. Am J Kidney Dis， 2009， 54（2）：205-226.

[8] Sarnak MJ， Levey AS， Schoolwerth AC， et al. Kidney disease as a risk factor for development of cardiovascular disease： A statement from the American Heart Association Councils on Kidney in Cardiovascular Disease， High Blood Pressure Research， Clinical Cardiology，and Epidemiology and Prevention [J]. Circulation， 2003， 108：2154-2169.

[9]Matsubara T， Araki M， Abe H， et al. Bone Morphogenetic Protein 4 and Smad1 Mediate Extracellular Matrix Production in the Development of Diabetic Nephropathy[J]. Diabetes， 2015 ， 64（8）：2978-2990.

[10] Ziyadeh FN， Hoffman BB， Han DC， et al. Long-term prevention of renal insufficiency， excess matrix gene expression， and glomerular mesangial matrix expansion by treatment with monoclonal antitransforming growth factor-beta antibody in db/db diabetic mice [J]. Proc Natl Acad Sci USA， 2000， 97：8015–8020.