咼亮　汪芳芳　林建國

摘要：建立了超聲萃取—陽離子交換高效液相色譜法測定乳制品中三聚氰胺含量的方法。乳制品經(jīng)1%三氯乙酸乙腈溶液超聲萃取15分鐘后，經(jīng)強(qiáng)陽離子交換型色譜柱進(jìn)行分離，采用二極管陣列檢測器檢測。流動相為50 mmol磷酸鹽（pH=2.5）：乙腈（35：65），檢測波長為235nm，三聚氰胺的線性范圍為0.5—400μg/g，線性方程的相關(guān)系數(shù)大于0.99，加標(biāo)回收率在93%—110%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于9.1%。三聚氰胺的檢測限為0.02μg/g。本方法簡單、快速，可有效消除乳制品基體干擾，測定結(jié)果滿意，可應(yīng)用于乳制品中三聚氰胺的監(jiān)控。

關(guān)鍵詞：超聲萃??；三聚氰胺；乳制品；陽離子交換色譜

中圖分類號：TB 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A doi：10.19311/j.cnki.1672-3198.2016.06.092

1引言

由于食品和飼料工業(yè)蛋白質(zhì)含量測試方法的缺陷，三聚氰胺常被不法商人用作食品添加劑，以提升食品檢測中的蛋白質(zhì)含量。寵物飼料及嬰幼兒奶粉中非法添加三聚氰胺，造成對健康的危害。三聚氰胺的檢測頗受關(guān)注。目前對三聚氰胺的檢測主要局限于飼料類產(chǎn)品，多用離子對色譜法，雖然國家已出臺了三聚氰胺的檢測標(biāo)準(zhǔn)，前處理采用固相萃取技術(shù)，存在費時費力，有機(jī)溶劑使用量較大的缺點。國外關(guān)于三聚氰胺的分析方法主要是色譜法，如HPLC，GC/MS和LC/MS/MS，也有用拉曼光譜進(jìn)行檢測的報道，但均未見乳制品中三聚氰胺檢測的報道。乳制品含有脂肪、蛋白質(zhì)，若前處理不好，低含量的三聚氰胺的檢測易受干擾。超聲萃取是一種有效的前處理方法，萃取溶劑的選擇對超聲萃取效果影響極大。針對目前乳制品中三聚氰胺的檢測樣品量大，建立簡單、快速、可靠的乳制品中三聚氰胺的分析方法非常必要。

本文采用1%三氯乙酸乙腈溶液為提取液的超聲萃取為前處理方法，以二極管陣列紫外檢測器作為定性定量手段，采用陽離子交換色譜方法，建立了一種回收率高，快捷，穩(wěn)定的乳制品中三聚氰胺的檢測方法。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

Waters 2695高效液相色譜儀，Waters 996PAD二極管陣列檢測器（美國waters公司）；渦旋混合儀；（上海滬西分析儀器廠，WH-3）超聲清洗器（上海KU-DOS超聲儀器有限公司，SK7200LH）。

三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品（純度大于99%，百靈威公司）用1：1甲醇水配制成10ttg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于-4℃下避光保存，根據(jù)需要稀釋成適當(dāng)濃度的工作液。實驗所用液態(tài)奶樣品，奶粉樣品均為武漢產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所日常檢測用品。

2.2實驗方法

2.2.1超聲萃取條件

取2.00g液體奶樣品置于50.0mL比色管中，然后加入10.00mL1%三氯乙酸乙腈溶液，渦旋混勻，超聲提取15min后，再次渦旋混勻，靜置，取上清液過0.2tim微孔濾膜，備檢測用。

取2.00g奶粉樣品置于50.0mL比色管中，先加入5.00mL二次水溶解，渦旋混勻后，與液體奶預(yù)處理步驟相同。

2.2.2色譜條件

色譜柱：Luna—scx（4.6×250mm，5μm，美國菲羅門公司）；流動相：A相為50mmol磷酸二氫鉀溶液（pH=2.5），B相為乙腈，A：B=35：65，等度洗脫；流速：1.0mL/min；進(jìn)樣量：30μL；檢測波長：235nm。

3結(jié)果與討論

3.1超神萃取條件的優(yōu)化

3.1.1萃取方法及萃取液的選擇

通常用液一液萃取法提取乳制品中的三聚氰胺，由于乳制品中蛋白質(zhì)的含量較多，蛋白質(zhì)變性后會將中心的樣品包裹起來，即使通過超聲波，高速振蕩等方法也很難將包被層破壞掉，使樣品不能被充分的提取。本文針對乳制品的特點，分別稱取5份空白液體奶樣品和奶粉樣品，添加10μg/g的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)工作液，分別用5種不同提取液進(jìn)行預(yù)處理，用LC—PAD進(jìn)行分離檢測，結(jié)果如表1所示。

由表1可見，單獨使用甲醇回收率很低；使用乙腈做提取液回收率提高到83.2%，但仍不能滿足分析的要求；1：1甲醇與水的混合溶劑進(jìn)行提取時發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)沉降緩慢，需進(jìn)行12000r高速離心才能夠分層。先用1%三氯乙酸水溶液，然后用乙腈提取回收率葉較低；單獨用三氯乙酸提取，回收率只有35.%，仍無法滿足分析要求。含有1%三氯乙酸的乙腈溶液進(jìn)行提取，液態(tài)奶與奶粉的回收率均在93%以上，效果最佳。因此本研究確定提取液為1%三氯乙酸乙腈溶液。

3.1.2提取液體積的優(yōu)化

萃取液體積對回收率有重要影響。為了確保三聚氰胺能夠全部提取出來，本研究提高了液態(tài)奶及奶粉中的添加水平（500μg/g），先按照3.1.1確定的方法分別加入5.00mL，10.00mL，15.00mL，20.00mL，25.00mL，30.00mL1%三氯乙酸乙腈溶液，渦旋混合，超聲提取15min，進(jìn)行分離檢測。試驗結(jié)果如圖1所示，結(jié)果表明，提取液體積在大于10.00mL后，提取出的三聚氰胺的總量不再增加。提取液體積為5.00mL時，反應(yīng)體系不易分層，需用12000r/min轉(zhuǎn)速離心；若提取液體積過大，會因稀釋比例過大導(dǎo)致方法檢出限偏高。故本文提取液用量定為10.00mL。

3.1.3超聲提取時間的優(yōu)化

超聲提取時間可影響三聚氰胺的回收率。分別稱取5份空白液體奶樣品和奶粉樣品，添加三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)工作液到10/μg/g，按照3.1.1和3.1.2節(jié)所述方法，分別加入10.00mL1%三氯乙酸乙腈溶液，渦旋混合，分別超聲提取0min，5min，10min，15min，20min，25min，30min，然后進(jìn)行分離檢測，結(jié)果如圖2所示。結(jié)果表明，超聲提取能夠大幅提高回收率，在超聲時間大于15min之后，三聚氰胺的回收率基本不再增加。故本文超聲提取時間定為15min。

3.2色譜條件的優(yōu)化

比較了C8（4.6×250mm，5/μm），C18（4.6×250mm，5μm）和Luna—sex（4.6×250mm，5/μm）三種色譜柱的分離情況。其中C8柱和C18柱按照國標(biāo)方法給定的色譜條件進(jìn)行實驗。實驗結(jié)果表明，選用C8柱和C18柱，應(yīng)用離子對試劑進(jìn)行分離，空白樣品中有一雜質(zhì)峰與目標(biāo)峰發(fā)生重疊，檢測結(jié)果受到較大干擾，如圖3（a），（b）所示分別為應(yīng)用C8柱和C18柱的空白樣品和三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖。

而選用強(qiáng)陽離子型色譜柱Luna—SCX，以50mmol磷酸鹽（pH=2.5）：乙腈（35：65）為流動相，大部分雜質(zhì)在死時間即被洗脫，能夠很好的與所有雜質(zhì)峰分離，見圖3（c），分別是空白樣品，三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品及空白加標(biāo)樣品的色譜圖。由圖可見，雜質(zhì)峰和三聚氰胺完全得到分離，因此本研究選擇上述Luna-scx色譜柱作為分離柱；選用235nm作為檢測波長。

3.3方法的線性范圍，檢出限?；厥章屎途芏?/p>

采用外標(biāo)法定量，三聚氰胺在液態(tài)奶及奶粉中的線性范圍為0.5～400μg/g，相關(guān)系數(shù)均大于0.99。以陰性樣品為測試樣品，添加不同濃度水平的三聚氰胺，每個水平做6個平行樣，計算回收率、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果見表2。通過低濃度（0.5μg/kg）添加樣品，以3倍信噪比為檢出限（LOD），計算得出三聚氰胺的檢出限為0.02μg/g，同樣條件下，以10倍信噪比為定量下限（LOQ），計算出三聚氰胺的定量下限為0.5μg/g。

3.4乳制品中三聚氰胺的測定

測定了5種乳制品，分別是原料牛奶，成品純牛奶，成品乳酸菌飲料，成品酸奶及成品奶粉。樣品按照本文確定的前處理方法進(jìn)行預(yù)處理后，以30μL直接進(jìn)樣分析，所得結(jié)果如表3所示。三聚氰胺在5種乳制品中的回收率為94.6%～100.2%。

采用超聲萃取能有效降低乳制品的基體干擾，與離子交換色譜聯(lián)用檢測乳制品中三聚氰胺，具有檢出限低，雜質(zhì)干擾少，樣品前處理步驟簡單，回收率穩(wěn)定等優(yōu)點，可用于實際奶制品中三聚氰胺的檢測。